Summary
Burada, bir protokol virüsü inaktive tam kan rapid virüs nükleik asit çıkarılması için mevcut. Çıkarma doğrudan kan toplama tüplerde gerçekleştirilir ve hiçbir ekipman veya elektrik gerektirir. Yöntem ve laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir olabilir herhangi bir yere (Örneğin, alan hastanelerde) kullanılır.
Abstract
Hızlı tanı bir enfeksiyonu salgını yönetimi, risk çevreleme ve hasta bakımı için önemlidir. Biz daha önce Ebola virüsü hızlı başucu inactivation güvenli nükleik asit (NA) testleri için kan örnekleme sırasında için bir yöntem bir ticari lizis/bağlayıcı arabelleğe doğrudan vakum kan toplama tüpler içine ekleyerek göstermiştir. Bu başucu inactivation yaklaşımı kullanarak, bir güvenli, hızlı ve Basitleştirilmiş başucu NA çıkarma yöntemi bir virüs lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan içinde sonraki tespiti için geliştirdik. NA çıkarma doğrudan kan toplama tüplerde gerçekleştirilir ve hiçbir ekipman veya elektrik gerektirir.
Kan lizis/bağlayıcı arabelleğe toplandıktan sonra içeriği el ile tüp lanetleme tarafından karışık ve karışımı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe. Manyetik cam parçacıkları (MGPs) tüp eklenir ve içeriği el ile toplama tüp saygısız karıştırılır. MGPs sonra bir manyetik tutucu veya bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak kan toplama tüp tarafında toplanır. MGPs üç kez yıkanır ve toplama tüp içine doğrudan elüsyon arabellek eklenmesinden sonra NAs qPCR veya izotermal döngü amplifikasyon (lamba), reaksiyon gelen MGPs kaldırılması olmadan gibi NA testler için hazırız. NA çıkarma yöntemi herhangi bir laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir ve kolayca herhangi bir yere (Örneğin, alan hastaneler ve hastane yalıtım wards) kullanılır. Bu NA çıkarma yöntemi lamba ve taşınabilir alet ile birleştirildiğinde, bir tanı kan toplama 40 dk içinde elde edilebilir.
Introduction
Virüs salgını durumlarda hastaların hastane yalıtım wards veya hızlı tanı gerekli olduğunda, sınırlı zaman güvenli, basit ve doğru bakım noktası moleküler tanı hasta bakım ve risk çevreleme için zorunludur. İki son virüs salgınları, Ebola virüsü (EBOV) Batı Afrika'da (2013) ve Güney Amerika (2015), Zika virüs geliştirilmiş bakım noktası moleküler tanı testleri, Ters transkripsiyon döngü-aracılı İzotermik gibi ilgi arttı amplifikasyon (RT-lamba)1,2 ve recombinase polimeraz amplifikasyon (RPA)3,4. RT-lamba ve RPA Basitleştirilmiş örnek hazırlıkları üzerinde gerçekleştirilebilecek hızlı, hassas ve belirli moleküler testlerdir. Zika virüs için RT-lamba Zika virüs olmayan saf tam kan örneklerinde 30 dk1içinde tespit edebilen bir yanal akışı tahlil (LFA), ile birlikte; Ancak, bir risk grubu 4 patojen sınıflandırılır ve çok bulaşıcı, EBOV örnekleri Biyogüvenlik altında ele alınması gerekir 4 (BSL-4) koşulları düzey ve güvenli herhangi bir tanı yöntemleri uygulanmadan önce inaktive olur.
Örnek2,3,4,5, lizis arabellekleri eklenmesi gibi EBOV için Basitleştirilmiş inactivation yöntemleri salgını sırasında kullanılması; Ancak, bu yöntemler ile Laboratuar donanımları, BSL-3 Biyogüvenlik kabinleri, santrifüj, Isıtma blokları ve Pipetler, en azından gibi BSL-4 koşulları altında işlem gerektirir. Bu ekipman yalıtım koğuşlarında ya alan hastaneler mevcut değil normal. Bu zorluğu aşmak için bavul3' te gerçekleştirin teşhis için yapılan girişimleri ve birkaç taşınabilir cihazlar ve makineleri gelişmiş [Örneğin, nükleik asit (NA) çıkarılması için taşınabilir bir aygıta] olmuştur6. Ancak, EBOV-pozitif örnekleri hala bu cihazların kullanılabilmesi için önce inaktive gerekir.
Biz daha önce bir hızlı başucu virüs inactivation yöntemi EBOV7, vaksinia virüs ve ineklerde virüs8 için buna ek olarak bir ticari lizis/bağlama arabellek tarafından sıradan vakum kan toplama tüpler için doğrudan için izin bildirdin hastanın transfer kan inactivation arabellek7içine. Bu doğrudan ve anında inactivation kapalı bir sistem içinde BSL-4 koşullar7gibi herhangi bir sıkı koruma kullanarak örnekleri işleme gereksinimini ortadan kaldırır ve örnekleri normal BSL-2 şartlar altında ele alınabilir. Bu inactivation Yöntem robotlar ve el arıtma kitleri7gibi birkaç NA emme tesisleri ile uyumludur; Ancak, bu yöntemler laboratuvar donanımları, robotlar, santrifüj ve elektrik, her zaman mevcut alan ayarları veya hastane yalıtım wards değil gibi gerektirir.
Bu raporda, bir güvenli, hızlı ve Basitleştirilmiş el ile NA çıkarma yöntemi bir virüs lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan içinde sonraki moleküler tespiti için açıklar. NA çıkarma yöntemi bir mıknatıs/manyetik tutucu dışında herhangi bir donanım gerektirmez. Santrifüjler blok veya elektrik Isıtma, NA çıkarma için ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bu yöntem ve laboratuvar olanakları üzerinde bağımlı değildir kolayca herhangi bir yere (Örneğin, alan hastaneler, hastane yalıtım Wards veya düşük kaynak ayarları ile) kullanılır. NA çıkarma yöntemi hızlı ve basit ve doğrudan testlerde herhangi bir aşağı akım NA, qPCR, RT-qPCR, lamba veya RT-lamba gibi kullanılabilir. Bu NA çıkarma yöntemi lamba ve taşınabilir bir pil tahrik izotermal aleti ile birleştirildiğinde, başucu tanı kan toplama 40 dk içinde elde edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Biyomedikal Araştırma Etik Komitesi, Başkent Bölgesi onay verdi ve tüm yöntem tanımlamak burada bir inceleme tahlil kalkınma projeleri üzerinde Danimarka yasa uyarınca etik kurul sistemi tarafından muaf.
1. virüs Inactivation ve hızlı NA çıkarma için kan toplama camlı hazırlanması
Dikkat: Bu iletişim kuralı için kullanılan arabellek guanidinium thiocyanate (GITC) ve iyonik olmayan yüzey aktif, tahriş edici içerir. Uygun laboratuvar güvenlik önlemleri almak, bir akış başlığı kullan ve üstesinden eldiven giyerler. Herhangi bir cilt ve göz teması önlemek. Arabellek döküldü, bu karışım zehirli siyanür oluşumuna neden olabilir çünkü kontamine yüzeyi hiç kloramin veya sodyum hipoklorit ("çamaşır suyu" içinde aktif maddeler) ile doğrudan dezenfekte gerekir. Önce emici doku ile dökülen tampon kadar Sil. Daha sonra ve daha sonra su ile % 70 etanol ile yüzeyi temizleyin ve son olarak, kloramin veya sodyum hipoklorit kullanın.
- Kan toplama camlı hazırlamak için belirli ticari lizis arabelleği 1.6 mL tüp 25 G x 1 iğne ve 3 mL şırınga kullanarak kapak delme tarafından 4 mL EDTA Vakum tüpün içine enjekte et.
Not: vakum tüpü kapağını çıkarmak değil. Vakum muhafaza edilmelidir. - Camlı oda sıcaklığında arabellek kullanımı kadar içeren depolar.
Not: Tüpler onların hazırlık sonra en az 1 yıl boyunca stabildir.
2. NA çıkarılması için arabellekleri hazırlanması
- Arabellekleri bir NA çıkarma için hazırlamak için iki 1,8 mL, iki 4.5 mL ve bir 3,6 mL tüpler bir rafa yerleştirin.
- Ekleme, pipetting, manyetik cam parçacıkları (MGPs) bir temiz 1,8 mL tüp ve bununla MGPs. Resuspend MGP süspansiyon tamamen pipetting önce etiket için 960 µL tarafından.
Not: MGPs hızlı tüp alt kısmında toplamak için eğilimindedir. - Ekleme, pipetting, yıkama arabellek 4 mL ben temiz 4.5 mL tüp tarafından ve WB-1 olarak etiketleyin.
Dikkat: Yıkama arabellek ben tahriş edici guanidinium klorür içerir. Uygun laboratuvar güvenlik önlemleri almak, bir akış başlığı kullan ve üstesinden eldiven giyerler. Herhangi bir cilt ve göz teması önlemek. - Ekleme, pipetting tarafından bir temiz 3.6 mL tüp yıkama arabelleğe II 1,5 mL ve WB-2 etiketleyin.
- Ekleme, pipetting tarafından yıkama arabelleğe III temiz 4.5 mL Tüp 3 mL ve WB-3 etiketleyin.
- Ekleme, pipetting, elüsyon arabelleği için bir temiz 1,8 mL tüp 100 µL tarafından ve EB etiketleyin.
- Oda sıcaklığında bölünmemeli arabellekleri kullanmak kadar saklamak.
Not: Tüpler onların hazırlık sonra en az 1 ay boyunca stabildir.
3. kan koleksiyonundan işaret ve bir virüs enfeksiyonu olan hastalarda
Dikkat: tam kan hastadan toplarken uygun laboratuvar güvenlik önlemleri almak. Eldiven ve gözlük giymek. Hasta yalıtım modunda ise, Biyogüvenlik seviye 4 yordamları izleyin.
- Hastanın intravenöz tam kan toplamak için bir kelebek iğne ile küçük uzantısı boru ve bir kan toplama vakum tüpü lizis/bağlama arabellek içeren kullanın. Hastanın kolunu aşağı doğru bir konumda dinlenme ve kelebek iğne alt toplama tüp getirin. Kelebek iğne hastanın damar içine yerleştirin ve kan toplama vakum tüpü küçük uzantısı ekleyebilirsiniz.
Not: Bu geri akış engeller. - Kan toplama sonra 5 - 10 kez tüp saygısız tüp içeriği karıştırın.
Not: otomatik olarak 1.6 mL lizis/bağlama arabellek içeren kan toplama tüp kalan boşlukta nedeniyle toplanan örnek hacmi 1.6 mL olacaktır. - % 70 etanol kullanarak tüp dýþýna dezenfekte.
- Tüpler, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
Not: Protokol burada duraklatıldı ve tam kan toplama tüpler-20 ° C, 5 ° C, 25 ° C veya 37 ° C en az 1 ay7için saklanabilir. - Doğrudan Basitleştirilmiş NA ayıklama yönteme geçin.
4. tam kan çıkarılması NA Basitleştirilmiş
- NA lizis/bağlama arabellek inaktive toplanan kandan, mix arındırmak için vakum saygısız tarafından tüp içeriğini el ile 5-10 x tüp.
- Tüpün kapağı dikkatli bir şekilde çıkarın ve boşaltma kapağı.
- MGPs (1 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.
- Yeni bir kapak bir kullanılmayan kan toplama tüp örnek içeren tüpü yerleştirin.
- Bir parmak tüp sıkıca kapalı olduğundan emin olun ve kan toplama tüp el ile 5 - 10 kat saygısız tüp içeriğini karıştırmak için kapağı yerleştirin.
- Tüp manyetik tutucu içinde yerleştirin ve kapağını tüp sıkıca kapalı sağlamak için bir parmak tutmak.
- Tüp ile manyetik sahibi tüm MGPs tüp mıknatıs ile tarafında toplanan emin olmak için el tarafından birkaç kez çevirin.
Not: Manyetik tutucu uzun bir mıknatıs ve bir lastik bant ile değiştirilebilir. - Tüp kapağını kaldırmak ve tek kullanımlık bir pipet kullanarak veya içeriği 50 mL toplama tüp içine dökme tarafından sadece tüp içeriğini atın.
Not: 50 mL toplama tüp aerosoller kapaklı tüp kapatarak kaçının. - WB-1 (4 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.
- Tüp üzerine kapak koyun ve bir parmak tüp sıkıca kapalı sağlamak için kapağını yerleştirin.
- Kapağı güvenli bir şekilde bir parmak ile sıkılır tutmak manyetik sahibinden tüpü çıkarması.
Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın. - MGPs kan toplama tüp el ile 5 - 10 kat lanetleme tarafından resuspend.
- 4.6-4.8 olan adımları yineleyin.
- WB-2 (1,5 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.
- Tüp üzerine kapak koyun ve manyetik sahibinden tüpü çıkarması.
Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın. - Bir parmak tüp sıkıca kapalı sağlamak için kapağını yerleştirin.
- MGPs kan toplama tüp birkaç saniye için el ile saygısız resuspend.
- 4.6-4.8 arasındaki adımları yineleyin.
- WB-3 (3 mL) hazırlanan aliquot doğrudan kan toplama tüp içine dökün.
- Tüp üzerine kapak koyun ve manyetik sahibinden tüpü çıkarması.
Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın. - Bir parmak tüp sıkıca kapalı sağlamak için kapağını yerleştirin.
- MGPs kan toplama tüp el ile 5 - 10 kat lanetleme tarafından resuspend.
- 4.6-4.8 olan adımları yineleyin.
- EB hazır aliquot dökün (100 µL) doğrudan kan toplama tüp içine.
- Tüp üzerine kapak koyun ve manyetik sahibinden tüpü çıkarması.
Not: bir mıknatıs ve bir lastik bant kullanarak, sadece lastik bant ve mıknatıs tüp sizden kaldırın. - MGPs EB içinde kan toplama tüp bir parmak ile 5 - 10 kez dokunarak resuspend.
Not: Burada protokol duraklatılmış ve tüpler-20 ° C'de depolanan - Bir damlacık (5-8 µL) resuspended MGPs 1,5 mL tek kullanımlık pipet (herhangi bir aşağı akım tanılama NA amplifikasyon tahlil lamba/RT-lamba veya qPCR/RT-qPCR deneyleri kullanılan gibi) kullanarak aşağı akım NA amplifikasyon tepki karışıma aktarın.
Not: NAs MGPs için sopa, aşağı akım NA amplifikasyon tepki MGPs kullandığınızdan emin olun. Kullanmadan önce MGP süspansiyon karıştırın. Karıştırma sonra MGPs tüp alt kısmında toplayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan iletişim kuralı basit ve etkili ve geniş lizis/bağlama arabellek inaktive bulaşıcı tam kan örnekleri üzerinde gerçekleştirilen herhangi bir moleküler tahlil için uygulanabilir. Kan inactivation ve NA çıkarma için iş akışı kan toplama camlı7 (Şekil 1A), kan toplama7 (Şekil 1B), ( NA ayıklama hazırlanması da dahil olmak üzere Şekil 1' de gösterilen Rakamlar 1 c - 1 H) ve aşağı akım NA Analizi (Şekil 1I).
Basitleştirilmiş NA ayıklama Protokolü nedeniyle MGPs elüsyon adımından kaldırılmaz ve bu nedenle, NAs MGPs için sopa eğilimindedir. Herhangi bir aşağı akım moleküler analizi, qPCR veya lamba analizi, gibi doğrudan MGPs üzerinde (Şekil 1I ve Şekil 2) olumlu bir sonuç sağlamak için yapılması gerekiyor.
NA ayıklama yöntemi ile viral yük 130-3.000 kopya/mL elde edilebilir ve ya qPCR ya da RT-qPCR (Şekil 3) kullanılarak analiz gibi düşük verimli ve RNA veya DNA-virüs-pozitif tam kan örnekleri var.
NA çıkarma yöntemi, lamba veya RT-lamba ve taşınabilir bir pil tahrik izotermal aygıt için virüs-pozitif tam kan örnekleri kullanarak, bir tanı kan Collection (Şekil 4) 40 dk içinde elde edilebilir.
Resim 1 : İş akışı tam kan örneklerinin Basitleştirilmiş NA çıkarılması için. Bir iğne ve şırınga kullanarak lysis/bağlama arabellek vakum kan toplama tüpler(a)hazırla. (B) toplamak bir kelebek iğne kullanarak kan. (C) yer kan toplama tüp bir tutucu kapağı çıkarın ve MGPs tüpün içine dökün. (D) tüp yeni bir kapak ile kapatın ve içeriği el ile tüp saygısız karıştırın. (E) tüp manyetik tutucu saygısız tarafından kan toplama tüp tarafında MGPs toplamak. (F) Kaldır tek kullanımlık bir pipet kullanarak süpernatant. (G) yıkama veya elüsyon arabellek doğrudan kan toplama tüp içine dökün ve paneller D - Fgösterilen eylemler tekrarlayın. (H) Bu panel gösterir MGPs doğrudan kullanıma hazır bir qPCR RT-qPCR, lamba veya RT-lamba tepki. (ben) Transfer bir damlacık (5-8 µL) MGPs, 1,5 mL tek kullanımlık pipet kullanarak bir PCR veya lamba tepki tüp için. A ve Bpaneli: Bu rakam Rosenstierne ve ark. değiştirildi 7. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : NA algılama 28 virüs-pozitif tam kan örneklerinin Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemiyle çıkarılan. Tam kan örnekleri (1.6 mL) test negatif bir virüs çivili için her iki DNA-virüs [Epstein - Barr virüsü (EBV) (2.0 x 104 - 1.0 x 103 kopya/mL)] veya bir RNA virüsü [Hepatit C virüsü (HCV) (6.0 x 105 - 103 kopya/mL x 3.0)] ya da dang virüs (DENV) (1.7 x 108 - 1.7 x 106 kopya/mL). NAS'ın yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak elde ve ayıklanan NAs yinelenen içinde belirli şirket içi qPCR, RT-PCR, lamba veya RT-lamba, ile ya da ezelî MGPs analiz edildi. X-ekseni = NA algılama metodu, y-eksen örnekleri qPCR/lamba içinde olumlu yüzdesi =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemi duyarlılığını. Yöntem kavramının bir kanıtı, virüs negatif tam kan farklı RNA veya DNA virüs hazırlıklar tanımlanmış bir viral yük içeren çivili ve NAs Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemini kullanarak elde. (A)negatif tam kan (1.4 mL) ile 10 kat dilutions Guéckédou/Gine (2.0 x 106 kopya/mL) son patlak üzerinden hazırlanan tanılama amacıyla (ENIVD), hazırlanan EBOV standart 200 µL çivili. Ayıklanan NAs içinde yinelenen bir MX3005P termal cycler kullanma bir kurum içi EBOV özgü RT-qPCR7 tarafından analiz edildi. (B) tam kan (1.2 mL) bir HCV kim standart serum örneği 10 kat dilutions 400 µL ile çivili (1.2 x 106 IU/mL). Ayıklanan NAs içinde yinelenen bir in-house HCV özgü RT-MX3005P termal cycler kullanarak qPCR tarafından analiz edildi. (C) tam kan (1.2 mL) 400 µL EBV (2.0 x 104 kopya/mL, 8,0 103 kopya/mL x, 103 kopya/mL x 2.7 ve 9,3 x 102 kopya/mL) farklı konsantrasyonları ile çivili. Ayıklanan NAs içinde yinelenen bir in-house EBV özel qPCR tarafından analiz edildi. (D) tam kan (1.2 mL) ile 10 kat dilutions BK virüs (1.3 x 104 kopya/mL) 400 µL çivili. Ayıklanan NAs içinde yinelenen bir in-house BK özel qPCR tarafından analiz edildi. X-ekseni (kopya/mL veya IU/mL), çivili tam kan örneğinde bir virüs son konsantrasyonu = y-eksen Ct-değeri (ortalama ± SD) =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Basitleştirilmiş NA çekme ve RT-lamba ya da lamba izotermal bir taşınabilir aygıtta. (A)EBOV-pozitif tam kan örnekleri bölümü virüs & mikrobiyolojik özel tanılama, Serum Institut stats, Danimarka olmaması nedeniyle negatif tam kan 1.4 mL EBOV farklı dilutions 200 µL ile çivili yapıldı. tanılama amacıyla (ENIVD) hazırlanan standart. Çivili örnekleri Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemini kullanarak bir NA çıkarma yapıldı ve EBOV özgü RT-lamba reaksiyon tarafından analiz edildi. Bir negatif kontrol, bir negatif tam kan örneği dahil edildi. X-eksen EBOV son konsantrasyonu çivili tam kan örneğinde (kopya/mL), y=-eksen pozitif için min =. (B) kavramının bir kanıtı için tam kan (1.6 mL) aliquots 7 hastalardan tanısı olumlu EBV (13.000-500 kopya/mL) virüs bölümü & mikrobiyolojik özel tanılama, Serum Institut stats, Danimarka, için bir NA uygulandı Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemini kullanarak ayıklama ve taşınabilir pil tahrik Genie II izotermal aygıtta EBV özel lamba reaksiyon tarafından analiz edildi. Bir negatif kontrol türedi B19-pozitif örnek dahil edildi. X-ekseni EBV viral yük bir hasta örneğinde (kopya/mL), y=-eksen pozitif için min =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu raporda, bir güvenli, hızlı ve basit el ile başucu NA çıkarma yöntemi lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan virüs aşağı akım moleküler tespiti için açıklar. Açıklanan NA çıkarma yöntemi doğrudan lizis/bağlama arabellek (Tablo reçetesi)7içeren vakum kan toplama tüplerde toplanan tam kan örnekleri üzerinde gerçekleştirilen için geliştirilmiştir. Bu belirli bir arabellek EBOV7 inaktive ve yöntem kritik bileşenidir. Kan toplama sonra tam inactivation örnek sağlamak için en az 20 dk7 tüp kuluçka öneririz. Başucu EBOV inactivation BSL-4 koşulları gibi sıkı koruma koşullar altında herhangi bir EBOV pozitif örnekleri işleme gereksinimini ortadan kaldırır ve normal BSL-2 şartlar altında ele alınması örnekleri sağlar. Büyük olasılıkla diğer risk grubu dört patojenleri gibi Lassa virüs, Marburg virüsü ve Kırım Kongo kanamalı ateşi virüs de bu arabellek tarafından inaktive ama bu almak için kalır.
Açıklanan NA ayıklama yöntemi hastalar hastanede tecrit koğuşuna ya da bir sahra hastanesi yanında yapılması için geliştirilen ve bu nedenle, santrifüjler, Isıtma blok veya elektrik gibi hiçbir Labaratuar donanımları gerektirir. O NA çıkarma yöntemi tüpler MGPs veya yıkama arabellekleri, manyetik tutucu ve tek kullanımlık pipetler sabit bir birimi içeren gerektirir. Arabellek içeren tüpler öncesi hazırlanması protokol kolaylaştırır, çünkü pipetler gereksinimini ortadan kaldırır ve bunun yerine, bölünmemeli arabellekleri doğrudan örnek tüpler içine dökülür. Manyetik tutucu NA içeren MGPs yakalar ve yıkama adımları kolay bir kullanım aracılık eder. Bir manyetik tutucu kullanılamaz durumda manyetik tutucu sıradan bir mıknatıs ve bir lastik bant ile yerine; Ancak, manyetik tutucu tüp bırakarak ve içeriği mıknatıs ve lastik bant uygularken dökülüp, uygulamalı riskini azaltır. Lizis/bağlama arabellek inaktive tam kan örnek viskozite nedeniyle, tek kullanımlık pipetler tüpünden süpernatant/sıvı/yıkama arabellekleri kaldırmak için kullanılır. Tek kullanımlık pipetler bir doğrudan tüp İçindekiler bir atık toplama tüp içine dökerek yerine ama tüp dışında herhangi bir damlacıklar yaratmak için değil unutmayın. Damlacıkları oluşturduysanız, bu karışım zehirli siyanür oluşumuna neden olabilir çünkü kontamine yüzeyi hiç kloramin veya sodyum hipoklorit ("çamaşır suyu" içinde aktif maddeler) ile doğrudan dezenfekte gerekir. Bu nedenle, ilk dökülen Eğer dökülme emici bir doku ile silin. Ardından, % 70 etanol ile ve sonra bol su ile yüzeyi temizleyin ve son olarak, kloramin veya sodyum hipoklorit kullanın. Bu (atık toplama tüp ve tek kullanımlık pipetler de dahil olmak üzere) lizis/bağlama arabellek ile temas oldu tüm atık içerir. Bunun yerine, ayrı bir atık konteyner tüm atık toplama ve sadece % 70 etanol kapsayıcıyla dýþýna dezenfekte.
NAS'ın normalde MGPs bir Isıtma adımı sırasında eluted ama bu Isıtma adım elektrik ve ekipman kullanımı ortadan kaldırmak için Basitleştirilmiş NA ayıklama kuralında kaldırıldı. Bu nedenle, NAs olan, bu nedenle, aşağı akım NA algılama tahlil için olumlu bir NA algılama eklemeniz gerekir MGPs sopa eğilimindedir. MGPs 1,5 mL tek kullanımlık pipet üzerinden bir damlacık aşağı akım tepki karışımının aktarılır. Bu ek bir yüzgeci ucu pipet kullanarak normal bir ek olarak kesin değildir; Ancak, unprecise yanı sıra NA/MGPs lamba, RT-lamba, qPCR veya RT-qPCR reaksiyon karışımı değil tepki inhibe veya floresan sinyal bizim in-house teşhis tahlil etkisi. Yine de, bu tahlil tahlil farklı olabilir ve biz aşağı akım her NA test doğrulanır ve testin duyarlılığı Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemi kullanarak test öneririz. NA çıkarma yöntemi nispeten duyarlı ve bir DNA veya RNA virüsü 3.000 kopya/mL kolayca ayıklanır ve aşağı akım moleküler testlerde, qPCR gibi algılanan gibi düşük içeren tam kan örnekleri var. Klinik örneklerinde viral yük bir enfeksiyon akut faz sırasında genellikle çok yüksektir ve genellikle EBOV gibi kanamalı ateşi virüsler, Lassa virüs ve Kırım Kongo kanamalı ateşi virüs, 10'dan fazla5 kopya/mL9 içeren ,10,11. Bu nedenle, virüsler Bu örneklerdeki kolayca bu NA çıkarma yöntemi kullanarak tespit edilebilir. Ancak, MPLB inactivation EBOV7, vaksinia ve ineklerde dışındaki virüs virüs8 gösterilmesini kalır.
Basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemi hastane yalıtım Wards veya alan ayarları'nda gerçekleştirilen ve bakım noktası moleküler teşhis için idealdir. Ancak, yöntem yüksek üretilen iş NA çekimi açık bir tüp için yakışıklı-üstünde işleme nedeniyle geçerli değildir. Yüksek işlem hacmi NA çekimi gerekiyorsa, Inaktif tam kan örnekleri, NA ayıklama robotlar7kullanarak kolayca saf. Bir diğer dezavantajı lizis/bağlama arabellek [% 20-30 Polietilen glikol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil eter ve % 30-50 guanidinium thiocyanate (GITC)]17 ve yıkama arabellek gibi zararlı kimyasalları kullanımı olduğunu ben (% 30-50 guanidinium bir akış başlık dışında açık bir tüp içinde klorür)17 . Yoğun biçimde lizis/bağlama arabellek vakum tüpü içinde ve kan 1:1 (v/v) koleksiyonu ile yer alıyor, tüp açılmadan önce konsantrasyonu azalır. Açılış vakum tüplü ve ekleme/kaldırma MGPs veya yıkama arabellek bir kaç saniye içinde gerçekleştirilir ve bu nedenle, aerosoller zehirlenmesinden riski azdır. Yıkama arabellek çıkarıldıktan sonra-ben, tüp sizden hiçbir zararlı diğer reaktifler iletişim kuralında kullanılır.
20133,6,12,13,14,15,16 EBOV patlak beri pek çok hızlı bakım noktası moleküler testleri ve aygıtlar geliştirilmiştir . Ancak, çoğu bu testler, hala bulaşıcı malzeme, BSL-3 Biyogüvenlik kabini ve Pipetler, santrifüj ve Isıtma blok veya elektrik gibi en az, bir laboratuar donanımları, bir yukarı-stream işleme gerektirir. Biyogüvenlik kabinleri kullanımını karmaşıklaştırır ve hızlı tanı uzatır. Basitleştirilmiş NA ayıklama yöntemi ile kombine virüs inactivation tüpler doğrudan koleksiyonuna kan ile açıklanan başucu virüs inactivation Biyogüvenlik kabinleri, elektrik ve laboratuvar olanakları ortadan kaldırır. Ayrıca, hastanın yanında gerçekleştirilen ve taşınabilir bir pil tahrik izotermal aygıt bir lamba reaksiyon ile birlikte basitleştirilmiş NA çıkarma yöntemi çünkü güvenli bir başucu moleküler tanı 40dakika içinde elde edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Susanne Lopes Rasmussen ve Solvej Kolbjørn Jensen teknik yardım ve klinik örnekleri işleme için teşekkürler. Bu proje finansman yenilikçi ilaç girişimi 2 ortak girişim Hibe Sözleşmesi N ° 115843 altında aldı EbolaMoDRAD Konsorsiyumu bir parçasıdır. Bu ortak girişim, Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı ve EFPIA destek alır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) | Becton Dickinson | 368861 | |
| Plus Blood Collection | Becton Dickinson | 362725 | |
| 23G x 1 needle | Becton Dickinson | 300800 | |
| LUER LOK syringe (3 mL) | Becton Dickinson | 309658 | |
| Butterfly needle with small-bore extension tubing | Jørgen Kruuse A/S | 121714 | |
| 1% Virkon | Nomeco A/S | 849265 | |
| MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis/Binding Buffer - Refill | Roche Diagnostics A/S | 03246752001 | |
| MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit | Roche Diagnostics A/S | 3038505001 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL) | Thermo Fisher Scientific | 375418 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379189 | |
| Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 379146 | |
| DynaMag™-5 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Transfer pipette (3.5 mL) | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) | Thermo Fisher Scientific | 231 | |
| Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 |
References
- Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
- Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
- Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
- Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
- Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
- Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
- Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
- Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
- Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
- De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
- Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
- Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
- Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
- Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
- Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
- Biocartis. Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , https://www.fda.gov/downloads/MedicalDevices/Safety/EmergencySituations/UCM503944.pdf (2016).
- MPLC. Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , https://pim-eservices.roche.com/DownloadDocument/SDS/DE/en/03038505001 (2015).
