Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

doi: 10.3791/58079 Published: August 29, 2018

Summary

Burada izole periosteum fare kalp üzerinde profil oluşturma polysome gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Biz kalp perfüzyon, profil oluşturma polysome ve polysome kesirler ile ilgili mRNA'ların, miRNAs ve polysome Proteom analizi için yöntemler açıklanmaktadır.

Abstract

Dinamik değişiklikleri protein çeviri çalışmaları özel yöntemler gerektirir. Burada biz yeni sentezlenmiş protein iskemi ve polysome profil oluşturma ile birleştiğinde izole periosteum fare kalp kullanarak reperfüzyon karşısında değişiklikler incelenmiştir. Daha fazla protein çeviri dinamik değişiklikleri anlamak için biz sitozolik ribozomlara (polyribosomes veya polizomlar) ile doluydu ve aynı zamanda mitokondrial polizomlar kurtarıldı ve mRNA ve protein dağıtım karşılaştırıldığında mRNA'ların karakterize yüksek verimli kesirler (çok sayıda ribozom mRNA için bağlı), düşük-verimlilik (daha az ribozom bağlı) mitokondriyal polizomlar ve tercüme kesirler de dahil. miRNAs Ayrıca, böylece çeviri verimliliğini azaltmak tercüme ediliyor mRNA ile ilişkilendirebilirsiniz, arasında kesirler miRNAs dağılımı incelenmiştir. MRNA'ların, miRNAs ve proteinler dağıtım 30 dk küresel akış olmayan iskemi ve reperfüzyon 30 dk sonra sonunda periosteum bazal koşullar altında incelenmiştir. Burada bu çözümlemeyi gerçekleştirmek için kullanılan yöntemleri mevcut — özellikle protein çekme--dan sükroz degrade, bu duruma getirilmesi için yaklaşım önce tarif edilmiştir değil — ve temsilcisi bazı sonuçlar sağlar.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kalp hasar iskemi (ı) ve reperfüzyon (R) dinamik bir şekilde yanıt verir. Ancak, tepki sırasında protein sentezi akut değişiklikler içine küçük fikir yoktur. Bu sorunu çözmek için biz yansıtmaktadır ribozomlar ve polizomlar, sitozol translasyonel düzenleyici faktörler yeniden dağıtılması protein bolca değişiklikleri tanımlamak için1 profil oluşturma polysome köklü yöntemi kullandı ve Yeni sentezlenmiş protein (NSP) artırın. Ben ortamda / R, yeni protein sentezi artış oluşur bir süre içinde yeni mRNA'ların2; transkripsiyon ile tutarsız Ayrıca, uyumsuzluk mRNA ifade düzeyleri ile protein bereket bildirilen3olmuştur. Bu nedenlerden dolayı biz protein çeviri tarafından yansıtıldığı gibi dinamik Proteom değişiklikleri analiz etmek seçti. Bunu yapmak için mRNA polysome kesirler ölçmek ve polysome kesirler protein bileşiminde analiz. Çünkü mikroRNA (miRs) mRNA'ların çeviri için kullanılabilirliğini düzenleyen ve protein çeviri4,5verimliliği ile engelleyebilir, son olarak, biz miRs polysome kesirler dağıtımını odaklanan muayene Ben Yanıt / R.

Sürekli perfüzyon, sonra 30 dk küresel akış olmayan iskemi ve iskemi reperfüzyon 30 min tarafından takip 30 dk sonra bazal koşullar altında hasat doku ve izole fare Langendorff perfüzyon model kullanmayı seçtiniz. Daha sonra kalp doku çözündürüldükten ve polizomlar sükroz degrade üzerinde ayrılmış proteomik analizi ve seçmeli olarak algılanması mRNA'ların ve miRNAs PCR ve Mikroarray, sırasıyla izledi. Bu yöntemlerin bileşimini eşzamanlı olarak algılanması mRNA, miRNA ve NSP'ler yanı sıra, düzenleyici proteinler, miRNA ve mRNA dağıtılması arasında nontranslating kesirler Etkinleştirme dinamik Proteom anlamak için güçlü bir yaklaşım temsil eder, düşük verimli polizomlar ve yüksek verimli polizomlar (bkz. Şekil 1). Dinamik yönetmelik bu sürecin içine anlayışlar daha fazla çözümleme eIF2α veya mTOR gibi anahtar düzenleyici faktörler fosforilasyon tarafından uzatılacak. Şimdi tek tek adımları ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm hayvan çalışmaları kurumsal kılavuzlarınıza uygun olarak gerçekleştirilen ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Cedars-Sinai Tıp Merkezi tarafından onaylanmış.

1. Langendorff perfüzyon fare kalp

  1. Langendorff perfüzyon fare kalp iskemi reperfüzyon ile
    1. Mayi Fentobarbital sodyum yönetmek 70 mg/kg yetişkin fare (8-hafta-yaşlı, Erkek, C57BL6/j). Derin anestezi çimdik baştan aşağı çekilmesi eksikliğinden onaylayın.
    2. Anticoagulate mayi heparin 500 ile U/kg.
    3. Göğüs sternal kesi ile açın. Diyafram açın ve anterior aksiler eksen için nodern sınırı boyunca kesilmiş. Sonra anterior aksiler eksen tamamen göğüs kafesi açmak için forelimb kadar kesti. Sonra kalbin görüntülenmesi, artan aort forseps ile kelepçe ve hızla kalp tüketim. Kan kaybı nedeniyle ölümdür. Kalp soğuk Krebs yerleştirin (NaCl 6.9 g/L, KCl 0.35 g/L, NaHCO3 2.1 g/M, KH2PO4 0,16 g/L, MgSO4 0.141 g/L, glikoz 2 g/M ve CaCl2 0.373 g/L).
    4. Bir künt uçlu iğne ile aort cannulate ve kalp retrogradely Krebs çözüm sürekli baskı modunda ile sıvı.
    5. 15 dk sonra bir istikrar süre 30 dk 30 dakika reperfüzyon takip için küresel bir akış olmayan iskemi kalp tabi.
    6. Kalpler 15 dk temel perfüzyon sonra sonra 30 dk iskemi veya 30 dk reperfüzyon sonra hasat. Kulakçık trim ve ek-doku sıvı azot kıpırdama.
    7. -80 ° C'de kullanmak kadar saklamak

2. doku homojenizasyon, Solubilization ve sukroz yoğunluk Gradient sedimantasyon

  1. Degrade hazırlık
    1. 100 mL sukroz, 4 mL NaCl 2, 5 M karıştırma 2 çözümleri (% 15 ve % 50) hazırlamak;
      0.8 mL MgCl2 1,25 M; 1 mL Tris-HCl 1 M, pH 7.5; 15 g veya sukroz 50 g (% 15 ve % 50, anılan sıraya göre); Ultrasaf Su 100 mL ulaşmak için; ve Ksilen cyanol % 15 çözüm renk (0,02 mg/mL)
    2. Her çözüm (0,22 µm filtreleri) filtre
    3. Degrade kullanılmak üzere gün 40 mL her sükroz çözeltisi hazırlamak ve sikloheksimit son 100 µg/mL konsantrasyonu elde etmek için her çözüm
      1. % 15 ve % 50 sükroz çözüm arasında bir karışım hazırlamak için bir degrade makinesi kullanın
      2. % 15 sükroz degrade sol bölmesinin 5 mL ile doldurmak
      3. Sağ bölmenin % 50 sükroz gradyan ile doldurmak
      4. Musluğu açın ve iki küçük bölmeler manyetik karıştırıcı ile karıştırın pompa geçiş
      5. Kullanım bir tüp karışık sükroz çözüm ince duvarlı bir ultra-Santrifüjü tüp akışı için izin vermek için ikinci dokunun bağlı. Son hacim yaklaşık 10 mL olacak.
    4. Degradeler 4 ° C'de tutmak (gerekirse bir gecede, ama uzun olmayan)
  2. Homojenizasyon kalp doku
    1. Taze veya dondurulmuş kalp ile filtre uygulanmış lizis arabelleği (sukroz degrade ayırma için değiştirilmiş) bir polytron homojenize 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 7.5, 5 mM MgCl2, %0,4 içeren NP-40. Sikloheksimit 100 µg/polysome yapısı, 0.1 U RNase inhibitörü ve proteaz inhibitörü kokteyl (50 mL için 1 tablet) korumak için mL içerir.
    2. Lysate kuluçkaya üzerinde buz 15dk.
    3. 18.000 x g 4 ° C'de çözünmez malzeme çıkarmak ve süpernatant toplamak için 15 dakika, santrifüj kapasitesi.
    4. (Bkz: Şekil 2) protein tayini, RNA izolasyon ve RNA bütünlük analizi için 50 µL saklıdır.
    5. Süpernatant (500-100 µL) degradeler üzerine katman ve lizis arabellek tüplerini denge.
  3. Sedimantasyon ve kesirler toplanması
    1. Ultrasantrifüj sallanan bir kova Open End 4 ° C'de 37.000 devirde 120 min için gerçekleştirin. Üreticiye göre bu 228,000 x g maksimal RADIUS de karşılık gelir.
    2. Her degrade 254 absorbans sürekli izlenmesi ile microcentrifuge tüpler 17 kesir (yaklaşık 600 µL Kesir) olarak toplamak nm (OD254).
    3. Kesir Toplayıcı aşağıdaki gibi programı:
      1. Toplama (tüp geçişin daha önce bulunan sıvı karşılık gelen) ilk 3 dk atmak
      2. 4-19 dk 17 kesirler 1 mL/dk hızında kesirler toplamak.
    4. En kısa zamanda her toplanır kesirler buza koyun. Eğer onlar hemen işlenmeyen örnekleri-80 ° C'de dondurmak. Bu toplanır gibi tipik bir UV densitometric izleme geçişin Şekil 1' de gösterilmiştir.

3. yalıtım ve mRNA'ların Polysome ve Nontranslating kesirler Analizi

  1. MRNA çıkarımı
    1. Toplandıktan sonra flaş donmuş olsaydı on Ice, kesirler tezcan
    2. Her kesir 200 µL için taze bir tüp transferi
      Not: Bu adımda iki veya daha fazla ardışık kesirler birlikte havuza alınmış. Dikkatli bir şekilde polysome ve polysome kesirler karışmak yok böylece OD254 grafik analiz sonra yapılmalıdır.
    3. 10 ekleyin luciferase RNA normalleştirme amaç için her örnek için iç kontrol olarak ng.
      Not: Luciferase astar bir iç kontrol sonuçları normalleştirmek için kullanılmalıdır.
    4. RNA ayıklama reaktif (fenol ve guanidin isothiocyanate monophasic çözüm; bkz: Malzemeler tablo) 700 µL her tüp için ekleyin. Mix iyi ve RT (Oda sıcaklığında), 5 min için tüpler kuluçkaya.
    5. 140 µL kloroform ve girdap 15 s. Incubate 2-3 dk RT. az için add ögesi
    6. Örnekleri, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi
    7. Dikkatle üst sulu faz için yeni bir tüp aktarın.
    8. Kesirler RNA içeriği yüksek olmadığından, glikojen 10 µg her tüp için taşıyıcı olarak ekleyin.
    9. 350 µL isopropanol her tüp için ekleyin. Mix iyi ve verimi artırmak 1 h için-20 ° C'de kuluçkaya.
    10. Santrifüj, 12.000 x g 4 ° C'de 15 dakika
    11. Süpernatant atmak ve RNA Pelet yıkamak için %75 700 µL etanol ekleyin.
    12. Santrifüj 7,500 x g 4 ° C'de, 5 min için
    13. Etanol kaldırmak ve 10-15 dk için kuru Pelet hava girsin.
      Not: aşırı RNA Pelet kurutma suda tam onun solubilization engeller.
    14. RNA Pelet RNase free ultrasaf H2o 50 μL içinde resuspend
    15. Örnekleri 55 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
    16. Her örneğinin 2 μL ayıklanan RNA miktarı ve kalitesini ölçmek ve kalan-80 ° C'de depolamak için kullanın.
  2. Ters transkripsiyon ve qPCR
    1. Ters transkripsiyon cDNA sentezi 4 μL kullanın (bkz. Tablo reçetesi) 20 μL tepki için kit. Supermix örnek sayısına göre hazırlayın. Her tüp için gerekli ses aktarım ve giriş RNA 5 μL her tüp için ekleyin. Bu birimin Taq polimeraz çalışma koşulları aralığı için alakalı olacak şekilde düzeltilebilir.
    2. Üretici tarafından önerilen aşağıdaki programı ile termal cycler tüplerde kuluçkaya: 5 dk 25 ° c, 20 dk 46 ° C'de 20 dk için Ters transkripsiyon ve transkriptaz inactivation 95 ° C'de 1 dk
    3. QPCR astar her çift için en iyi duruma getirilmiş programı çalıştırın.
      Not: kesirler içinde belirli mRNA'ların olup olmadığını belirlemek için her kısmını (izole RNA) eşit birimden Ters transkripsiyon için kullanılmalıdır.
  3. Analiz sonuçları
    1. Delta Ct değerleri hesaplamak için baktılar gen ve luciferase Ct değerini kullanın
    2. Her kesir delta Ct değeri farklı fraksiyonları (Tablo 1) arasında mRNA dağılımını görselleştirmenizi bütün fraksiyonları bulunan mRNA toplamının yüzdesi olarak ifade

4. yalıtım ve Analizi miRNAs Polysome kesirler ve Nontranslating kesirler

  1. MRNA ve miRNA çıkarma
    Not: Bu protokol birkaç değişiklikle üreticisinin yönergelerini takip eder.
    1. Glikojen ve spike denetimi çözülme. Buz üstünde tutun.
    2. MiRNA ayıklama reaktif 700 µL havuza alınan örnek 200 µL için ekleyin.
    3. 1 µg/µL glikojen ekleyin ve pipet kullanarak lunaparkçı. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
    4. 3.5 µL 1.6 x 108 spike içinde denetimi ekleyin ve karıştırın.
    5. Kloroform ve girdap 200 µL eklemek için en az 15 sn.
    6. 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    7. 4 ° C'de 15 dakika 12.000 x g , santrifüj
    8. Bir pipet kullanarak, süpernatant yeni bir 1,5 mL tüp aktarın. Orta ve alt aşamaları atmak.
    9. 1.5 x hacmi % 100 etanol süpernatant için ekleyin ve karıştırın.
    10. Bu karışımdan 700 µL miRNA ayıklama sütuna aktarmak ve 15 tam hızda santrifüj kapasitesi s RT ve atma akışı-aracılığıyla; kalan herhangi bir örnek ile bu işlemi tekrarlayın.
    11. Arabellek 1 700 µL sütununu ekleyin ve 15 tam hızda santrifüj kapasitesi RT; s akışı aracılığıyla atın.
    12. Arabellek 2 500 µL sütununu ekleyin ve 15 tam hızda santrifüj kapasitesi RT; s akışı aracılığıyla atın.
    13. 500 µL % 80 etanol sütununu ekleyin ve RT 2 min için tam hızda santrifüj kapasitesi; akışı aracılığıyla atın.
    14. Yeni 2 kapağını mL Tüp, kapağı açın ve bu RT tam hızda 5 dk santrifüj kapasitesi sütun transfer; akışı aracılığıyla atın.
    15. O tam eluate buz üzerinde hız 1 dk az dik tutmak için ya da ilerideki analizleri için-80 ° C'de depolamak sütun ve santrifüj 16 µL RNAse free su ekleyin.
      Not: Her örneğinin iki microliters OD analizi için kullanılabilir.
  2. Ters transkripsiyon
    1. Buzda hazırlayın. Her 20 µL RT-PCR reaksiyon için 4 µL miRNA RT arabelleği, nükleik asitlerin 2 µL, toplam RNA, enzim 2 µL ve su RNAse free 3 µL 9 µL ekleyin; Bunu karıştırıp kısaca aşağı sıralayacağız.
    2. Termal Cycler aşağıdaki gibi ayarlayın:
      60 dk 37 ° C;
      95 ° C 5 min için;
      4 ° C tutun.
    3. Termal cycler tüpler kaldırın ve 200 µL RNAse free su ekleyin. -20 ° C'de depolayın veya gerçek zamanlı PCR için devam edin.
  3. Gerçek zamanlı PCR
    Not: Bu protokol 96 iyi plaka biçimi izler. Buz reaksiyon karışımına hazır olun.
    1. PCR reaksiyon karışım hazırlamak ve cDNA (dan miRNAs yukarıdaki) iletişim kuralı tarafından kabul aralığı göre ekleyin. Toplu iş iş işlemde birden çok tepkiler hazırlanabilir.
    2. Toplam 25 µL PCR karışımı + cDNA her kuyuya ekleyin.
    3. Bir optik plaka mühür kullanarak plaka mühür.
    4. 1 dk 1000 x g oda sıcaklığında az plaka santrifüj kapasitesi.
    5. Gerçek zamanlı cycler programı aşağıdaki gibi:
      İlk harekete geçirmek adım 15dk için 95 ° c;
      3-adım Bisiklete binme: 15 94 ° C'de denatürasyon s; 30 55 ° C'de tavlama s; uzantısı için 30 70 ° C'de s (floresan veri toplama gerçekleştirmek); 40 döngüleri eklemek;
      Erime-eğri cycler varsayılan göre.
  4. Karşılaştırmalı Analizi
    1. Normalleştirme örneği (bkz. Tablo 2):
      1. SCM en küçük değerini bulmak.
      2. Bu en az tüm SCM değerleri normalize.
      3. Bu değer miRNAs faiz (MOI) ve referans gen (REF) Ct değerlerinden çıkarma.
      4. 2-ΔCt formülü kullanarak verileri analiz.

5. proteomik analizi

  1. Proteinlerin çıkarma polysome kesirler
    1. Toplanan sükroz kesirler üç final kesirler birleştirin. Kesirler ağır (yüksek verimlilik polizomlar havuza alınan kesirler 4, 5, 6 ve 7 sükroz en yüksek konsantrasyon ile; Degrade tüp alt), mark ışık (düşük verimlilik polizomlar havuza alınan kesir 8, 9, 10 ve 11; ortasına Degrade tüp) ve (sukroz 12, 13, 14 ve 15 En düşük konsantrasyon ile havuza alınan kesirler; Degrade tüp üst) sigara çeviri . Protein tahlil havuza alınan kesirler gerçekleştirin.
    2. Trichloroacetic asit (TCA) stokunun % 100 hazırlamak ve karanlıkta 4 ° C'de saklayın. Örnek 0.5 mL %100 60 µL ile karıştırın TCA ve gece karanlıkta-20 ° C'de kuluçkaya.
      Not: 1,5 mL düşük protein saklama tüpler ( Tablo malzemelerigörmek) kullanın.
    3. Gecede kuluçka sonra buz ve santrifüj 15.000 x g, 30 dk. atma süpernatant için 4 ° C, örnek çözülme.
      Not: Toplam protein örnek 100 µg tüp alt kısmında görünür protein Pelet verir.
    4. Önceden aseton-20 ° C-dondurucu soğuk. Protein Pelet ve santrifüj 15.000 x g, 15 dk. atma süpernatant için 4 ° C de soğuk aseton 0.5 mL ekleyin. Bu iki kez tekrarlayın.
    5. Hava kuru Pelet. Pelet 50 mM Tris-HCl tampon (pH 8) 360 µL içinde resuspend.
      Not: gerekirse, Pelet resuspend için bir darbe sonicator kullanın.
    6. 0.1 M dithiothreitol 40 µL ekleyin (son konsantrasyonu 10 mM) ve 55 ° c için 45 dk. Ekle 50 µL 0.15 M iodoacetamide, shaker üzerinde kuluçkaya (son konsantrasyonu 17 mM) ve shaker için 30 dk içinde karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.
    7. Tripsin çözüm hazırlamak: tripsin 20 µg 50 mM Amonyum Bikarbonat 100 µL içinde resuspend. Tripsin çözüm ilgili birim için örnek 1:50 at (w/w) eklemek tripsin: protein oranı, bu pH 8 olduğundan emin olun ve shaker 37 ° c üzerinde kuluçkaya gecede.
      Not: 1 M Amonyum Bikarbonat pH 8'e getirmek için ekleyin.
    8. Tripsin sindirim sonra serin örnek, tezgah santrifüj, kısaca santrifüje eklemek %10 formik asit tripsin etkinlik gidermek ve örnek desalting ile devam etmek için pH 2-3.
      Not: μ-elüsyon plaka örnek desalting için kullanın.
    9. Durumda jelleştirici kuyuları ile üç kez Klima tarafından %0,1 formik asit 200 µL tarafından üç kez takip vakum kullanma metanol 200 µL 96 iyi plaka. Örnek yüklemek ve üç kez 200 µL %0,1 formik asit kullanarak bir örnek yıkama gerçekleştirin. Örnek 100 µL % 50 acetonitrile/0.1% formik asit ile iki kez düşük protein saklama 0.5 mL tüp içine elute.
      Not: örnek Elute yavaş yavaş ilk başta yerçekimi kullanarak düşük vakum tarafından izledi.
    10. Dar kurutma başlığını kullanarak kuruluk için örnek eluate buharlaşır ve ya doğrudan kütle spektrometresi analiz veya mağaza taşımak-80 ° c kadar kullan.
  2. Kütle spektrometresi Analizi
    1. Her Pelet (tryptic peptidler oluşan) 50-100 µL sulandırmak ve 1 µL kütle spektrometre enjekte.
      Not: Sulandırma ve enjeksiyon birimleri LC/MS/MS sinyal maksimum yoğunluk elde etmek için en iyi duruma getirme. Bizim durumumuzda, yüksek sinyal (Toplam iyon geçerli; İçinde TIC) aralığındaki 1E8 2E9 için kalp taraması yapıldı.
    2. Bir tuzak sütun C18 kullanın (300 µm kimlik x 5 mm, 5 µm, 100Å) tarafından takip peptid ayrılık C18 sütun (75 µm kimlik x 250 mm, 2 µm, 100Å) kullanarak bir akış hızı ayarı, 300 nL/dak Set nano-kaynak kapiller sıcaklık ile 275 ° C ve sprey voltajı 2 kV.
    3. 5-%35 B 90 dk, 3 dk için 35-%95 B %95 B 7 dk. ve %5 B 25 dk (A: %0,1 formik asit/su ve B: %0,1 formik asit Asetonitril) için denge holding doğrusal degrade uygulayın. MS2 spectra CID modunu kullanarak her MS1 inceden inceye gözden geçirmek--dan 15 en yüksek yoğunluk iyonları için kazanmak. 3 kütle spektrometresi çoğaltır analiz her örnek için kullanın.
      Not: En iyi duruma getirme ve deneysel koşullar ve örneklerinizi belirli kütle spektrometresi cihazda için uygun olan parametreleri kullanın. Koşulları/5.2 bölümünde açıklanan parametreleri. kullanılan ve bizim laboratuvar olarak en iyi duruma getirilmiş.
  3. Protein tanımlama/Nefelometri
    1. Kütle spektrometresi analiz sonra ham spectra dosyaları MSConvert yazılım (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html) kullanarak uyumlu mzXML dosyalarına dönüştürün.
    2. Sun dönüştürülen dosyaları SEQUEST arama motoruna arama ölçütleri ile Örneğin, UniProtKB/İsviçre-Prot fare veritabanı (en kanonik gözden güncel); tripsin kullanarak yarı enzim Özet (KR sonra /-); 2 nefrette özledim; öncü Kütle aralığı: 400-4.500 amu; statik değiştirme: carbamidomethyl (C) 57.021465 amu; peptid kitle tolerans: 50 ppm; parçası kitle türü: monoisotopic.
      Not: Diğer protein veritabanı arama motorları ve veri boru hatları kullanılabilir. Bir veritabanı veritabanları fare ve insan için daha az tam olan Örneğin fare için kullanıyorsanız fare (ve/veya insan karşı) aramanız gerekebilir Proteom kapsama artırmak için veritabanları. Bu durumda, fazlalık protein adlarındaki kaldırılması gerekir.
    3. Bir sonrası arama çözümlemesi gerçekleştirin. Verileri görüntülemek için filtreleri ayarlayın. Örneğin, bir minimum protein olasılık (protein eşik) %95 veya % 99, sadece kendisi için bir istatistiksel analiz örnek mevcut olan %95 veya % 99 olasılık anlamına gelir proteinler-ecek var olmak göstermek Yani, olarak ayarlayın. Peptid eşik (örn., %95), için filtre ayarlamak Yani, bir spektrum bir peptid tanımlar olup olmadığını belirlemede kullanılacak en düşük bir olasılık. Bir protein mevcut olup olmadığını belirlemek peptitleri en az sayısını seçin (2 peptidler olarak en az protein tanımlama için önerilir).
    4. Kalite/miktar için saptanan proteinler değerlendirin. Proteotypic peptidler miktar için kullanıldığından emin olun. İzoformu tanımlanmazsa üsleri belirli izoformu benzersiz bir amino asit dizisi oluşan bir tryptic peptid gözlenmesi üzerinde olduğundan emin olun. Herhangi bir "benzer" veya varsayımsal proteinler karşılaştırma görmek için geçmesi gözlenen peptidler karşılık gelen için bilinen bir protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

mRNA Analizi
mRNA sonuçları bir dağıtım her kesir (Şekil 3A); belirli bir mRNA olarak ifade miktar için polyribosomal çeviri kesirler birleştirmek ve mRNA bereket nontranslating kesirler çeviri içinde oranında sunulması sigara çevirme kesir (Şekil 3B), karşılaştırın. Ek bilgi yüksek verim polysome kesirler ayrı olarak düşük verimli polysome kesirler (ve ayrı nontranslating kesirler) inceleyerek elde edilir. (Nereye onlar onların hedef mRNA'ların protein çeviri ile müdahale) düşük verimli kesirler zenginleştirilmiş miRNAs analiz ederken bu özellikle önemlidir.

Fare kalpler iskemi ve iskemi/reperfüzyon tabi tutuldu sonra çeviri ve nontranslating kesirler genelinde dağıtım sham göre değişiklikler Şekil 4' te gösterilen belirli bir mRNA için temsilcisi sonuçlanır.

miRNA dizi analizi
MiRNA dizi analiz temsilcisi sonuçları Şekil 5' te gösterilmektedir. Burada, miRNAs (özel olarak tasarlanmış dizi plaka) kümesini analiz 22 miRNAs 9 miRNas sırasında iskemi, iskemi ve koşulların her ikisi de ortak 7 ile reperfüzyon sırasında polizomlar ile ilişkili olduğunu gösteren havuza alınan ağır kesirler. Bu miRNAs Derneği dinamik iskemi ve reperfüzyon stresleri karşılık olarak gösterir.

Proteomik analizi
Ağır, hafif ve tercüme kesirler sham (kontrol) örneği analiz:
881 toplam proteinlerin kütle spektrometresi tarafından tespit edilmiştir; 3, toplam 46 ve 208 proteinlerin ağır, ışık ve trans kesirler için benzersiz sırasıyla (Şekil 6A). Mitokondrial ribozomal proteinler (28S ve 39S) çoğunluğu (% 88) ışık kesir (36 dışarı-in 41) tespit edilmiştir ve sitozolik ribozomal proteinler (40'lı ve 60'lar) bir çoğunluğu (% 88) genellikle ağır ve hafif kesirler (53 dışarı-in 60) tespit edildi verimli ayrılık ve proteomik teyit yetenek-e doğru tespit daha ağır sitozolik vs mitokondrial ribozomal proteinler daha hafif. Tanımlanan mitokondrial ve sitozolik ribozomal protein alt kümesini Şekil 6Bgösterilir.

Figure 1
Şekil 1: tipik UV absorbans profil polysome kesirler sükroz degrade üzerinde sahibi. İlk üç kesirler tüp içinde geçersiz birim temsil eder. Yüksek verimlilik (yüksek molekül ağırlıklı, HMW) kesirler kesirler 4-7, düşük toplanan verimliliği (düşük moleküler ağırlıklı, LMW) 8-11 ve sigara çeviri (ve sitozolik malzeme kalan) kesirler kesirler 12-15 () içinde toplanan nontranslating, NTR). Kırmızı çizgi iletkenlik ve mavi izleme 254 absorbans UV gösterir nm. Bir test tüpünde bir karikatür sükroz degrade, gösteren dağıtım ile polizomlar sedimantasyon sonra üzerinde hakkıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: RNA bütünlük kontrol analizi üzerinde Bioanalyzer. RNA bütünlük sayısı (RIN) Toplam RNA izole kalp bütün lysate. RIN hesaplanır 18S ve 28S doruklarına göre. RIN aralığı: 1-10 ve RIN 10 temsil eder çok iyi bir bütünlük =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: sükroz degrade mRNA dağıtım temsilcisi profil. Kalpleri tabi bazal Langendorff perfüzyon veya iskemi ve reperfüzyon (ı / R). (A) sükroz degrade üzerinde kalp lysates çözüldü ve mRNA içerik GAPDH (solda) ve COX4 (sağda) için her kesir tespit. Arsa (sham, kırmızı çizgi ve elmas) Bazal perfüzyon ve iskemi/reperfüzyon için göreli mRNA bereket her kesir (Kesir sayı ekseni) gösterir (ı / R, mavi çizgili ve kareler). Arsa üzerinde üst üste UV absorbans (ışık gri eğrisi) Toplam mRNA içerik gösteren ve gürültülerinden (düz gri eğimli çizgi) vardır. Kutuları nasıl kesirler havuza alınmış gösterir. (B) çubuk grafik Arsa (polizomlar) vs nontranslating (NT) kesirler GAPDH (solda) ve COX4 (sağda) mRNA'ların için çeviri mRNA bereket oranını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: temsilcisi mRNA sonuçları. Deney grubu göre değişir gösterilen havuza alınan kesirler (HMW, LMW, NTR) bir mRNA Nefelometri. Polysome ayırma fare kalplerin Langendorff perfüzyon sonra gerçekleştirildi. Sonuçlar % toplam mRNA (üst paneli) ve için nontranslating kesir (NTR) (HMW + LMW) polizomlar oranı olarak çizilir. Hata çubukları 5 kalpler grubu başına gelen sonuçları temsil (sahte, iskemi veya ı / R). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: temsilcisi miRNA sonuçları. Venn şeması bir yolun odaklı gösterilmesini miRNA Analizi ve downregulated miRNAs fareler örneklerinin ağır kesir havuzlarda kalp sonra iskemi veya iskemi ve reperfüzyon. Cut-off değeri: 1,5 kat. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: kütle spektrometresi tarafından tanımlanan proteinler. (A) Venn şeması proteinlerin ortak ve ağır, ışık ve trans kesirler için benzersiz. (B) alt kümesi tanımlanan mitokondrial ve sitozolik ribozomal proteinler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: şematik iş akışları için protein ayıklama yöntemleri test. Protein ayıklama yöntemleri sham (kontrol) örnek ve ağır (yüksek verimlilik polizomlar) kullanarak test edildi kesir en yüksek sükroz içeriği ile. Kırmızı sayılar, kütle spektrometresi tarafından tanımlananların proteinlerin sayısını belirleyin; iki numara gösterilir nerede onlar iki ayrı deney vardır. Ayrıntılı açıklama metin verilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

KESİRLER GENE Ct LUCIFERASE Ct ΔCt 2ΔCt TÜM KESİRLER TOPLAMI HER FRAKSİYONU % Polysome/NTR oranı
Yüksek verim (HMW) 28,75 22.79 5,96 0.016 0.046 34.64 2,77
Düşük verimlilik (LMW) 28.43 22.63 5,80 0,018 38.81
Sigara çeviri (NTR) 29,12 22.77 6.35 0.012 26,55
Polysome/NTR oranı = (HMW + LMW) / NTR

Tablo 1: Örnek analiz mRNA. Bir mRNA analiz yöntemi farklı havuza alınan kesirler (HMW, LMW, NTR) kantitatif PCR sonra gösterilir. ΔCt gen Ct - luciferase Ct, = ve 2ΔCt 2ΔCt.

SCM en küçük değerini bulmak: 22.77
Örnek 1 Örnek 2 Örnek 3
CT MOI 22.92 22.36 22.58
CT SCM 22.81 22.77 22,9
CT REF 23.27 23.55 23.19
Bu en az tüm SCM değerleri normalize
Örnek 1 Örnek 2 Örnek 3
CT SCM 0,05 0 0,13
Bu değerler MOI ve REF Ct değerlerinden çıkarma
Örnek 1 Örnek 2 Örnek 3
CT MOI 22.87 22.36 22.45
CT REF 23,22 23.55 23.06

Tablo 2: örnek gerçek zamanlı PCR hesaplama miRNA ifade karşılaştırma polysome ve nontranslating kesirler için. faiz (MOI) ve referans gen (REF) miRNAs farelerin ağır havuza alınan kesirler iskemi veya iskemi/reperfüzyon sonra analiz edildi. Değerleri ilk (SCM) Ct değer, o zaman 2-ΔCt formül spike bileşenini denetim için normalleştirilmiş Ct miRNA ifadeyi karşılaştırmak için kullanılan.

Yöntemi Numune hacmi [mL] # tespit proteinlerin Yorumlar
FASP 1 227 filtre üzerinde çöktürülmüş sükroz toplu
aseton yağış 0,6 372 sükroz tüp altındaki yapışkan çamur; 4:1 (reaktif: örnek) birimler; hiçbir görünür protein Pelet
Kloroform/metanol yağış 0,32 389 sükroz tüp altındaki yapışkan çamur; 8:1 (reaktif: örnek) birimler; hiçbir görünür protein Pelet
TCA yağış (4 ° C'de) 0,5 405, 415 hiçbir sükroz yağış; 0.12:1 (reaktif: örnek) birimler; Tüp alt görünür Pelet
yeniden yağış 85, 60 ilk Pelet toplanmıştır sonra süpernatant ile ek TCA yağış
TCA yağış (-20 ° C'de) 0,5 440, 430 hiçbir sükroz yağış; 0.12:1 (reaktif: örnek) birimler; Tüp alt görünür Pelet
yeniden yağış 81, 55 ilk Pelet toplanmıştır sonra süpernatant ile ek TCA yağış

Tablo 3: Protein çıkarma yöntemlerinin karşılaştırılması. FASP, aseton yağmur damlaları, kloroform/metanol yağış ve TCA yağış 4 ° C ile -20 ° C de değerlendirildi. Hedefi tespit proteinler sayısını en üst düzeye çıkarmak oldu. TCA ihtimali malzeme tekrarlanabilirlik onaylamak için ikinci bir toplu iş değerlendirildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Polysome profil analiz protein çeviri çalışması için belirli bir mRNA veya tüm transcriptome6,7translasyonel durumu analiz ederek sağlar. Yerel synaptosomes8gibi okudu gerektiğinde de çok yardımcı olur. Geleneksel olarak, bu yöntem mono - ve polyribosomes ve ilişkili mRNA'ların hangi ile genomik birleştiğinde olabilir sükroz degrade veya istediğiniz sonuçları6,9elde etmek için proteomik teknikler ayrılması içerir. Örneğin, bizim grup tarafından yapılan bir çalışmada iskemi/reperfüzyon hasarı taklit eden KPB geçiren hastaların kalp içinde yürütülen çoğu bir düzenleyici mekanizma ortaya koymuştur. Polysome profil analizi yararlanarak, biz nükleer kodlanmış mitokondrial proteinler kalbinde çeviri KPB yordam2' den sonra artış göstermiştir.

Burada sunulan dinamik Proteom polyribosomal profil oluşturma yaklaşım mRNA'ların polyribosomes ve aktif olarak proteinler ile ilgili nüfus değişiklikleri ortaya çıkarabilir. MRNA'ların çeviri kısmen miRNAs tarafından yönetilir gibi miRNAs bu kesirler analizini ek anlayışlar ortaya çıkarabilir. Aslında, çeşitli çalışmalarda bu yöntemi modifiye ve yönetmelik10,11miRNA modu araştırmak için uygun ve güvenilir bir yaklaşım gibi kanıtlanmıştır.

Son on yıl miRNAs, rolüne çeşitli biyolojik fonksiyonları12,13' te önemi dikkate alınarak delving içinde birçok çalışma yapılmıştır. MiRNAs Bankası-muadili mRNA'ların onları bozulmayı işaretlemek için eşleştirme yoluyla hareket beri polysome profil analizi gerçekleştirilen edilmiş ve miRNAs aslında çeviri mRNA'ların14, hedefleme polysome kesirler içinde bulunan gösterilen 15 , 16. miR-21 düşük bir baskı ve zayıf polizomlar kanser hücrelerinde polizomlar ilişkilendirmesini artar ve baskıcı etkisi çok daha güçlü17yaşında iken normal hücrelerde, bağlama ile ilişkili nerede iyi bir örnek olduğunu.

Bu çalışmada, gerçek zamanlı PCR analiz yapıldı (MOI) ilgi miRNAs Ct değerlerini kullanarak, spike-in Ct değerleri kontrol örnekleri arasında stabil miRNA (SCM) Teknik varyasyonları ve referans gen veya miRNA (REF) Ct değerini azaltmak için. MOI ve SCM Ct değerlerine REF Ct değerleri normalize etmek ilk adım oldu. Daha sonra hakem için MOI ikinci adım normalleştirme yapıldı ve sonuç değeri 2-ΔCt formülü hesaplamak için kullanılan. Bu değerler veya kat-değişiklik değerleri gruplar arasındaki farkları göstermek için kullanılabilir.

Proteinler çıkarma polysome kesirler zor olduğundan, şu ana kadar yapılan çalışmaların en kullandı kesirler doğrudan western blot analizi için. Onlar sadece tortu her kesir ve mix SDS-yükleme ile tampon SDS-sayfa analiz8,18için kullanmak için protein içeriği. Burada, bize sadece özü mRNA'ların ve miRNAs için ayırma sonra aynı zamanda peptidler ve kütle spektrometresi analizi ile devam etmek için yüksek kalite ile protein elde etmek için izin veren bir yöntem geliştirdik.

Bu yaklaşım uzatılabilir aktif metiyonin19,20azidohomoalanine (AHA) gibi biorthogonal amino asit homolog gibi metabolik etiketleme kullanarak yeni sentezlenmiş protein ölçme tarafından daha fazla. AHA tıklayın Kimya tarafından takip birleşme AHA dahil tüm proteinlerin streptavidin arıtma tarafından takip bir biotin etiketi birleşme için sağlar. Bu yeni sentezlenmiş protein kesin kimlik sağlar — dinamik Proteom diğer parçası. Yanıt bir uyarıcı olarak çeviri ve nontranslating fraksiyonları arasında yeniden dağıtma miRNAs tespiti (Ben burada / R) protein çeviri dinamik Yönetmeliğin sorgulama sağlar. Ancak, miRNAs bağlı ribozom mRNA çevresinde için recruit faktörler tespit ve sistematik olarak araştırılması için kalır.

TCA yağış, ek olarak bizim çalışmada test ettik polysome kesirler protein çıkarılması için üç yöntem: i) FASP (filtre destekli numune hazırlama)21, II) aseton yağış ve III) kloroform/metanol yağış. Kesirler sükroz yüksek konsantrasyon ile işleme yeteneği her iki temel yöntemleri uygunluğu değerlendirilmiştir (% 50) ve kütle spektrometresi (Şekil 7 ve Tablo 3) tarafından tanımlanan proteinler sayısı.

FASP yöntemi için bir Ultrafiltrasyon ünitesi 30 kDa göreli bir moleküler kütle cut-off ile istihdam FASP Protein sindirimi Kit tarafından verilen numune hazırlama protokolü izledik. Aksi takdirde sonraki peptid ayırma ile müdahale yüksek molekül ağırlıklı maddeler (proteinler ve DNA) korumak yeteneği ile deterjan kaldırma, arabellek değişimi, protein sindirimi ve peptid elüsyon için bir araç olarak filtre üniteyi servis 21. kısaca, örnek ile üre içeren karışık oldu tampon ve adımları iodoacetamide çözüm olarak iplik ile birimi spin filtresi yüklendi, tripsin çözüm ve sodyum klorür çözüm (elüsyon) sonradan eklenmiştir. Sindirilir peptidler bulunan son filtrate TFA tarafından acidified, desalted ve kütle spektrometresi analiz için saklanan. Bu yöntemi kullanarak, ancak, zarlarını sükroz toplu sürekli aralıklarla işleme ve adımları zor yıkama filtre üst kısmında birikmiş.

Aseton yağış ve kloroform/metanol yağış için solventler birden fazla miktarda protein örneği tek bir birimden çökelti ihtiyaç vardı. Bu yağış 1,5 mL tüpler (protein düşük tutma tüpler) gerçekleştirildiğinde uygulanan örnek birimin boyutunu sınırlı. De, sükroz yapışkan çamur yağış her iki yöntem için sonra tüpler dibinde biriken ve aseton yağış ve kloroform/metanol yağış sonra tüp alt ve sıvı arayüzü görünür hiçbir granül vardı, anılan sıraya göre.

Tablo 3 ve Şekil 7 deneysel bizim iş akışı en iyi duruma getirmek için kullanılan dört protein çıkarma yöntemlerinin karşılaştırılması göster. Her Yöntem (Şekil 7) verilen kırmızı sayıları kütle spektrometresi tarafından tanımlananların proteinlerin sayısını gösterir (bkz: Bölüm 5.2 ve 5.3). Her yöntem için kullanılan örnek birimleri farklı olmasına rağmen kloroform/metanol ve TCA ihtimali tespit proteinler en fazla sayıda sonuçlandı. Ancak, (örnek ses kısıtlaması ve sukroz yağış) belirtildiği dezavantajları nedeniyle biz TCA yağış sonraki deneyler için seçti.

İşleme örnek için en uygun koşulları bulmak için TCA yağış çeşitli sıcaklık ve TCA konsantrasyonları22,23,24gerçekleştirilmiştir. Böylece, bir yağış %10.7 ile gerçekleştirilen TCA 4 ° C ile -20 ° C ve daha da TCA ek 60 µL ile supernatants çöktürülmüş (final %19,4 TCA) sonra parçaları toplanmıştır. Bu kütle spektrometresi tarafından ayrılmış analiz edildi dört granül sonuçlandı. Buna ek olarak, biz iki kez elde edilen sonuçları tekrarlanabilir edildi emin olmak için tüm protokol tekrarladı. İş akışı ve proteinler 4 ° C ile -20 ° C koşulları, granül iki tekrarlanan deney ile tanımlanan sayısı Şekil 7 (kırmızı sayılar) gösterilir. Granül analizini türetilmiş, ancak supernatants proteinler (85 ve 60 4 ° C; 81've 55-20 ° C'de); ek bir dizi vermiştir proteinler bir çoğunluğu zaten ilk granül tespit edildi ve böylece, %10,7 kullanmayı tercih TCA tüm sonraki deneyler için. TCA yağış nedeniyle çeşitli yararları keşhaneye inip içiyorduk kloroform/metanol yağış tespit proteinler TCA yağış için karşılaştırıldığında benzer bir dizi sonuçlandı rağmen: Ben) çözücü proteinler (60 µL TCA, acele için gerekli küçük hacmi vs 1.28 mL kloroform/metanol/su) daha büyük örnek birimleri Eğer kullanmanızı süre 1,5 mL tüpler yağış, II için elverişli bir konuma sahip kullanarak) tüp alt ve III Pelet görünürlüğünü) sükroz sırasında hiçbir birikimi yağış adımları.

Translasyonel durumu ile ilgili ayrıntılı fonksiyonel bilgi sunan rağmen bu yöntemin önemli bir dezavantajı taze ve büyük Başlangıç materyali için ihtiyaç vardır. Birçok çalışma koşullarını hücreleri veya doku küçük hacimli kullanarak optimize etmek veya açılan RNA ve proteinler25verimliliğini artırmak için adımlar için çalıştık. Yine de, aynı deneysel koşullarda farklı hayvanlardan elde edilen dokular birlikte, Eğer çıkardı olabilir olması.

Sonuç olarak, bu iletişim kuralı mRNA, miRNA ve kesirler iskemi/reperfüzyon içinde ilgili düzenleyici mekanizmaları incelemek için profil oluşturma polysome elde edilen protein eşzamanlı analizi için izin verir. Ancak, daha fazla çalışmaları çeviri mRNA'ların iskemi veya reperfüzyon sonra indüklenen vardır ve onlar stres kaldırma üzerine kapalı olacak eğer görmek için gereklidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

NIH P01 HL112730 (bez, JVE), NIH R01 HL132075 (bez, JVE), Barbra Streisand kadın kalp Merkezi (bez, JVE), Dorothy ve E. Phillip Lyon sandalye moleküler Kardiyoloji (bez), Erika Glazer donatılmış sandalye kadın kalp sağlığı (JVE) ve Çek bilim Kurumsal Destek RVO: 68081715 (MS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pentobarbital Vortech Phamaceuticals 9373 for euthansia
Heparin Sagent 103424 used in langendorff preparation
forceps Fine Science Tools 91110-10 used to hang the heart
Langendorff system Radnoti + home made n/a A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths
NaCl Sigma S7653-5KG Krebs buffer and Sucrose gradient
KCl Sigma P5405 Krebs buffer and Lysis buffer
KH2PO42 Sigma P-5504 Krebs buffer
MgSO4 Sigma M7774-500G Krebs buffer
Glucose Sigma G5767 Krebs buffer
CaCl2 Sigma C1016-500G Krebs buffer
Sucrose powder Sigma S0389-1KG Sucrose gradient
MgCl2 Sigma 208337 Sucrose gradient and Lysis buffer
Tris-base Sigma T1503-1KG Sucrose gradient and Lysis buffer
Xylene Cyanole Sigma X-4126 Sucrose gradient
Cycloheximide Sigma-aldrich 239763 Sucrose gradient and Lysis buffer
RNaseOUT Life Technologies C00019 RNAse inhibitor for Lysis buffer
Igepal CA-360 (NP40) Sigma I3021 Lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free Roche 5056489001
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 mm x 89 mm Beckman Coulter 344059
Ultracentrifuge Beckman LE-80K Ultracentrifugation of the gradients
Rotor Beckman SW41 Ultracentrifugation of the gradients
Biologic LP (pump) Biorad 731-8300 Fractionation of the gradients
BioFrac Biorad 741-0002 Fractionation of the gradients
Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube Sigma Z666513-100EA Gradient fraction and RNA extraction
TRIzol Reagent Life technologies AM9738 RNA extraction
Luciferase Control RNA Promega L4561 RNA extraction
Chloroform Fisher Scientific C606-4 RNA extraction
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 RNA extraction
Isopropanol Sigma I9516 RNA extraction
Ethanol Sigma E7023-1L RNA extraction
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 170-8891 Reverse transcription
iTaq Universal SYBR Green Supermix BioRad 175-5122 Quantative PCR
miRNeasy Micro Kit (50) Qiagen 217084 Kit for total RNA isolation
miScript II RT Kit (50) Qiagen 218161 Kit for miRNA reverse transcription
miScript Sybr Green PCR Kit (200) Qiagen 218073 Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs
Centrifuge 5424R Eppendorf For centrifugation of 1.5 mL or 2.0 mL tubes at different temperatures. Max speed - 21130 x g
Centrifuge 5810R Eppendorf For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed - 2039 x g
My Cycler Thermal Cycler Bio-Rad For reverse transcription
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad For real-time PCR analysis
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610 For quality control of RNA isolation
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear Bio-Rad HSP9641 For real-time PCR analysis
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical Bio-Rad MSB1001 For real-time PCR plate sealing
Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL Eppendorf UX-24505-02 For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P20 Gilson F123600G For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P200 Gilson F144565 For pipetting
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL Gilson 17011782 For pipetting
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 Improves total RNA isolation efficiency
Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color Denville C2170 RNA isolation and storage; reagent mix
Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically Denville C18098-4 (1000910) Reverse transcription reaction
Sharp 10 Precision barrier Tips Denville P1096-FR For pipetting
Sharp 20 Precision barrier Tips Denville P1121 For pipetting
Sharp 200 Precision barrier Tips Denville P1122 For pipetting
Tips LTS 1 mL Filter Rainin RT-L1000F For pipetting
miScript Primer Assay (200) Qiagen (it changes according to the miRNA) For real-time PCR analysis
Gradient Master ver 5.3 Model 108 BioComp Instruments For preparation of sucrose gradients
trichloroacetic acid Sigma Aldrich T6399
acetone Sigma Aldrich 650501
Tris hydrochloride Amresco M108
dithiothreitol Fisher Scientific BP172
iodoacetamide Gbiosciences RC-150
sequencing grade modified trypsine, porcine Promega V5111
ammonium bicarbonate BDH BDH9206
formic acid, Optima LC/MS Fisher Chemical A117
methanol, Optima LC/MS Fisher Chemical A454
acetonitrile, Optima LC/MS Fisher Chemical A996
Protein LoBind tubes 0.5 mL Eppendorf AG 22431064
Protein LoBind tubes 1.5 mL Eppendorf AG 22431081
HLB µElution plate 30 µm Oasis 186001828BA
SpeedVac concentrator Thermo Scientific Savant SPD2010
sonicator Qsonica Oasis180
centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend micro 21R
LC trap column PepMap 100 C18 Thermo Scientific 160454
LC separation column PepMap RSLC C18 Thermo Scientific 164536
mass spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer
MSConvert software ProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST software Sage-N Research, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).
  2. Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303 (2017).
  3. Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  4. Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
  5. Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
  6. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. (2014).
  7. Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).
  8. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  9. He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
  10. Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
  11. Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
  12. Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
  13. Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
  14. Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
  15. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
  16. Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 360-365 (2004).
  17. Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
  18. Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. E3815-E3824 (2014).
  19. McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
  20. Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
  21. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
  22. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
  23. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
  24. Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
  25. Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).
Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).More

Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter