Summary

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Published: August 29, 2018
doi:

Summary

Burada izole periosteum fare kalp üzerinde profil oluşturma polysome gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Biz kalp perfüzyon, profil oluşturma polysome ve polysome kesirler ile ilgili mRNA’ların, miRNAs ve polysome Proteom analizi için yöntemler açıklanmaktadır.

Abstract

Dinamik değişiklikleri protein çeviri çalışmaları özel yöntemler gerektirir. Burada biz yeni sentezlenmiş protein iskemi ve polysome profil oluşturma ile birleştiğinde izole periosteum fare kalp kullanarak reperfüzyon karşısında değişiklikler incelenmiştir. Daha fazla protein çeviri dinamik değişiklikleri anlamak için biz sitozolik ribozomlara (polyribosomes veya polizomlar) ile doluydu ve aynı zamanda mitokondrial polizomlar kurtarıldı ve mRNA ve protein dağıtım karşılaştırıldığında mRNA’ların karakterize yüksek verimli kesirler (çok sayıda ribozom mRNA için bağlı), düşük-verimlilik (daha az ribozom bağlı) mitokondriyal polizomlar ve tercüme kesirler de dahil. miRNAs Ayrıca, böylece çeviri verimliliğini azaltmak tercüme ediliyor mRNA ile ilişkilendirebilirsiniz, arasında kesirler miRNAs dağılımı incelenmiştir. MRNA’ların, miRNAs ve proteinler dağıtım 30 dk küresel akış olmayan iskemi ve reperfüzyon 30 dk sonra sonunda periosteum bazal koşullar altında incelenmiştir. Burada bu çözümlemeyi gerçekleştirmek için kullanılan yöntemleri mevcut — özellikle protein çekme–dan sükroz degrade, bu duruma getirilmesi için yaklaşım önce tarif edilmiştir değil — ve temsilcisi bazı sonuçlar sağlar.

Introduction

Kalp hasar iskemi (ı) ve reperfüzyon (R) dinamik bir şekilde yanıt verir. Ancak, tepki sırasında protein sentezi akut değişiklikler içine küçük fikir yoktur. Bu sorunu çözmek için biz yansıtmaktadır ribozomlar ve polizomlar, sitozol translasyonel düzenleyici faktörler yeniden dağıtılması protein bolca değişiklikleri tanımlamak için1 profil oluşturma polysome köklü yöntemi kullandı ve Yeni sentezlenmiş protein (NSP) artırın. Ben ortamda / R, yeni protein sentezi artış oluşur bir süre içinde yeni mRNA’ların2; transkripsiyon ile tutarsız Ayrıca, uyumsuzluk mRNA ifade düzeyleri ile protein bereket bildirilen3olmuştur. Bu nedenlerden dolayı biz protein çeviri tarafından yansıtıldığı gibi dinamik Proteom değişiklikleri analiz etmek seçti. Bunu yapmak için mRNA polysome kesirler ölçmek ve polysome kesirler protein bileşiminde analiz. Çünkü mikroRNA (miRs) mRNA’ların çeviri için kullanılabilirliğini düzenleyen ve protein çeviri4,5verimliliği ile engelleyebilir, son olarak, biz miRs polysome kesirler dağıtımını odaklanan muayene Ben Yanıt / R.

Sürekli perfüzyon, sonra 30 dk küresel akış olmayan iskemi ve iskemi reperfüzyon 30 min tarafından takip 30 dk sonra bazal koşullar altında hasat doku ve izole fare Langendorff perfüzyon model kullanmayı seçtiniz. Daha sonra kalp doku çözündürüldükten ve polizomlar sükroz degrade üzerinde ayrılmış proteomik analizi ve seçmeli olarak algılanması mRNA’ların ve miRNAs PCR ve Mikroarray, sırasıyla izledi. Bu yöntemlerin bileşimini eşzamanlı olarak algılanması mRNA, miRNA ve NSP’ler yanı sıra, düzenleyici proteinler, miRNA ve mRNA dağıtılması arasında nontranslating kesirler Etkinleştirme dinamik Proteom anlamak için güçlü bir yaklaşım temsil eder, düşük verimli polizomlar ve yüksek verimli polizomlar (bkz. Şekil 1). Dinamik yönetmelik bu sürecin içine anlayışlar daha fazla çözümleme eIF2α veya mTOR gibi anahtar düzenleyici faktörler fosforilasyon tarafından uzatılacak. Şimdi tek tek adımları ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Protocol

Tüm hayvan çalışmaları kurumsal kılavuzlarınıza uygun olarak gerçekleştirilen ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Cedars-Sinai Tıp Merkezi tarafından onaylanmış. 1. Langendorff perfüzyon fare kalp Langendorff perfüzyon fare kalp iskemi reperfüzyon ile Mayi Fentobarbital sodyum yönetmek 70 mg/kg yetişkin fare (8-hafta-yaşlı, Erkek, C57BL6/j). Derin anestezi çimdik baştan aşağı çekilmesi eksikliğinden onaylayın….

Representative Results

mRNA AnalizimRNA sonuçları bir dağıtım her kesir (Şekil 3A); belirli bir mRNA olarak ifade miktar için polyribosomal çeviri kesirler birleştirmek ve mRNA bereket nontranslating kesirler çeviri içinde oranında sunulması sigara çevirme kesir (Şekil 3B), karşılaştırın. Ek bilgi yüksek verim polysome kesirler ayrı olarak düşük verimli polysome kesirler (ve ayrı nontranslating kesirler) inceleyer…

Discussion

Polysome profil analiz protein çeviri çalışması için belirli bir mRNA veya tüm transcriptome6,7translasyonel durumu analiz ederek sağlar. Yerel synaptosomes8gibi okudu gerektiğinde de çok yardımcı olur. Geleneksel olarak, bu yöntem mono – ve polyribosomes ve ilişkili mRNA’ların hangi ile genomik birleştiğinde olabilir sükroz degrade veya istediğiniz sonuçları6,9</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NIH P01 HL112730 (bez, JVE), NIH R01 HL132075 (bez, JVE), Barbra Streisand kadın kalp Merkezi (bez, JVE), Dorothy ve E. Phillip Lyon sandalye moleküler Kardiyoloji (bez), Erika Glazer donatılmış sandalye kadın kalp sağlığı (JVE) ve Çek bilim Kurumsal Destek RVO: 68081715 (MS).

Materials

Pentobarbital Vortech Phamaceuticals 9373 for euthansia
Heparin Sagent 103424 used in langendorff preparation
forceps Fine Science Tools 91110-10 used to hang the heart
Langendorff system Radnoti + home made n/a A 'four heart' system consisting of custom blown glass, tubing and water baths
NaCl Sigma S7653-5KG Krebs buffer and Sucrose gradient
KCl Sigma P5405 Krebs buffer and Lysis buffer
KH2PO4 Sigma P-5504 Krebs buffer
MgSO4 Sigma M7774-500G Krebs buffer
Glucose Sigma G5767 Krebs buffer
CaCl2 Sigma C1016-500G Krebs buffer
Sucrose powder Sigma S0389-1KG Sucrose gradient
MgCl2 Sigma 208337 Sucrose gradient and Lysis buffer
Tris-base Sigma T1503-1KG Sucrose gradient and Lysis buffer
Xylene Cyanole Sigma X-4126 Sucrose gradient
Cycloheximide Sigma-aldrich 239763 Sucrose gradient and Lysis buffer
RNaseOUT Life Technologies C00019 RNAse inhibitor for Lysis buffer
Igepal CA-360 (NP40) Sigma I3021 Lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail tablets, EDTA free Roche 5056489001
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 mL, 14 x 89 mm Beckman Coulter 344059
Ultracentrifuge Beckman LE-80K Ultracentrifugation of the gradients
Rotor Beckman SW41 Ultracentrifugation of the gradients
Biologic LP (pump) Biorad 731-8300 Fractionation of the gradients
BioFrac Biorad 741-0002 Fractionation of the gradients
Eppendorf RNA/DNA LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL tube Sigma Z666513-100EA Gradient fraction and RNA extraction
TRIzol Reagent Life technologies AM9738 RNA extraction
Luciferase Control RNA Promega L4561 RNA extraction
Chloroform Fisher Scientific C606-4 RNA extraction
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 RNA extraction
Isopropanol Sigma I9516 RNA extraction
Ethanol Sigma E7023-1L RNA extraction
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 170-8891 Reverse transcription
iTaq Universal SYBR Green Supermix BioRad 175-5122 Quantative PCR
miRNeasy Micro Kit (50) Qiagen 217084 Kit for total RNA isolation
miScript II RT Kit (50) Qiagen 218161 Kit for miRNA reverse transcription
miScript Sybr Green PCR Kit (200) Qiagen 218073 Kit for real-time PCR expression analysis of miRNAs
Centrifuge 5424R Eppendorf For centrifugation of 1.5ml or 2.0ml tubes at different temperatures. Max speed – 21130g
Centrifuge 5810R Eppendorf For real-time PCR plate centrifugation at different temperatures. Max speed – 2039g
My Cycler Thermal Cycler Bio-Rad For reverse transcription
CFX96 Real-Time System/C1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad For real-time PCR analysis
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610 For quality control of RNA isolation
Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, green/clear Bio-Rad HSP9641 For real-time PCR analysis
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical Bio-Rad MSB1001 For real-time PCR plate sealing
Research plus Single-Channel Pipette, Gray; 0.5-10 µL Eppendorf UX-24505-02 For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P20 Gilson F123600G For pipetting
PIPETMAN Classic Pipets, P200 Gilson F144565 For pipetting
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS Pipette 100-1000 µL Gilson 17011782 For pipetting
Glycogen, RNA grade Thermo Fisher Scientific R0551 Improves total RNA isolation efficiency
Posi-Click 1.7 mL Tubes, natural color Denville C2170 RNA isolation and storage; reagent mix
Thermal Cycling Tubes -0.2 mL Individual Caps, Standard 0.2 mL tubes with optically Denville C18098-4 (1000910) Reverse transcription reaction
Sharp 10 Precision barrier Tips Denville P1096-FR For pipetting
Sharp 20 Precision barrier Tips Denville P1121 For pipetting
Sharp 200 Precision barrier Tips Denville P1122 For pipetting
Tips LTS 1 mL Filter Rainin RT-L1000F For pipetting
miScript Primer Assay (200) Qiagen (it changes according to the miRNA) For real-time PCR analysis
Gradient Master ver 5.3 Model 108 BioComp Instruments For preparation of sucrose gradients
trichloroacetic acid Sigma Aldrich T6399
acetone Sigma Aldrich 650501
Tris hydrochloride Amresco M108
dithiothreitol Fisher Scientific BP172
iodoacetamide Gbiosciences RC-150
sequencing grade modified trypsine, porcine Promega V5111
ammonium bicarbonate BDH BDH9206
formic acid, Optima LC/MS Fisher Chemical A117
methanol, Optima LC/MS Fisher Chemical A454
acetonitrile, Optima LC/MS Fisher Chemical A996
Protein LoBind tubes 0.5 mL Eppendorf AG 22431064
Protein LoBind tubes 1.5 mL Eppendorf AG 22431081
HLB µElution plate 30 µm Oasis 186001828BA
SpeedVac concentrator Thermo Scientific Savant SPD2010
sonicator Qsonica Oasis180
centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend micro 21R
LC trap column PepMap 100 C18 Thermo Scientific 160454
LC separation column PepMap RSLC C18 Thermo Scientific 164536
mass spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Elite ion trap mass spectrometer
MSConvert software ProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUEST software Sage-N Research, Inc.

References

  1. Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750 (2015).
  2. Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M., Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303 (2017).
  3. Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  4. Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
  5. Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
  6. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
  7. Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi (2013).
  8. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  9. He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
  10. Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
  11. Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
  12. Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
  13. Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
  14. Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
  15. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
  16. Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).
  17. Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
  18. Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).
  19. McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
  20. Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R., Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
  21. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
  22. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
  23. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
  24. Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
  25. Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3 (2018).

Play Video

Cite This Article
Stastna, M., Thomas, A., Germano, J., Pourpirali, S., Van Eyk, J. E., Gottlieb, R. A. Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion. J. Vis. Exp. (138), e58079, doi:10.3791/58079 (2018).

View Video