Summary
Nous présentons ici un protocole afin d’évaluer le métabolisme respiratoire et fermentatif en ajustant la croissance exponentielle des Saccharomyces cerevisiae à l’équation de croissance exponentielle. Calcul des paramètres cinétiques permet le dépistage des influences de substances/composés sur la fermentation ou la respiration mitochondriale.
Abstract
Cellules de Saccharomyces cerevisiae en phase exponentielle soutiennent leur croissance par la production d’ATP par fermentation ou la respiration mitochondriale. La concentration de carbone fermentescibles principalement régit la façon dont les cellules de levure génèrent de l’ATP ; ainsi, la variation des niveaux de glucides fermentescibles lecteurs le métabolisme énergétique de S. cerevisiae. Cet article décrit une méthode de haut débit basée sur la croissance exponentielle de levure pour estimer les effets des changements de concentration et la nature de la source de carbone sur le métabolisme respiratoire et fermentatif. La croissance de S. cerevisiae est mesurée dans une microplaque ou secouée conique fiole par la détermination de la densité optique (do) à 600 nm. Ensuite, une courbe de croissance est construite par traçage OD par rapport au temps, qui permet l’identification et la sélection de la phase exponentielle et est équipé de l’équation exponentielle pour obtenir des paramètres cinétiques. Les taux de croissance spécifique faible avec des temps de doublement supérieurs représentent généralement une croissance respiratoire. À l’inverse, des taux plus élevés de croissance spécifique avec des temps de doublement inférieurs indiquent une croissance fermentaire. Seuils de doubler le temps et le taux de croissance spécifique sont estimées à l’aide de conditions respiratoires ou fermentatives bien connues, telles que les sources de carbone non fermentescibles ou des concentrations plus élevées de sucres fermentescibles. Ceci est obtenu pour chaque souche spécifique. Enfin, les paramètres cinétiques calculées sont comparées avec les valeurs de seuil pour établir si la levure montre la croissance fermentaire et/ou respiratoire. L’avantage de cette méthode est sa relative simplicité pour comprendre les effets d’un substance/composé sur le métabolisme fermentaire ou respiratoire. Il est important de souligner que la croissance est un processus biologique complexe et complex ; par conséquent, les données préliminaires de cette méthode doivent être corroborées par la quantification de la consommation d’oxygène et l’accumulation des sous-produits de la fermentation. Ainsi, cette technique peut servir comme un examen préliminaire des composés/substances susceptibles de déranger ou améliorer le métabolisme fermentaire ou respiratoire.
Introduction
Croissance de Saccharomyces cerevisiae a été un outil précieux pour identifier des dizaines de mécanismes physiologiques et moléculaires. La croissance est mesurée principalement par trois méthodes : dilutions en série pour spot test, unité formant colonie comptant et courbes de croissance. Ces techniques peuvent servir seul ou en combinaison avec une variété de substrats, les conditions environnementales, des mutants et produits chimiques pour l’étude des réponses spécifiques ou phénotypes.
La respiration mitochondriale est un processus biologique dans lequel cinétique de croissance a été appliquée avec succès pour découvrir les mécanismes inconnus. Dans ce cas, lorsqu’il s’agit de milieux de culture avec carbone non fermentescibles sources tels que le glycérol, lactate ou éthanol (qui sont exclusivement métabolisé par la respiration mitochondriale), car la seule source de carbone et d’énergie permet d’évaluer la croissance respiratoire, ce qui est importante de détecter les perturbations dans la phosphorylation oxydative activité1. En revanche, c’est compliqué à utiliser des modèles cinétiques de croissance comme méthode pour décrypter les mécanismes derrière la fermentation.
L’étude de la fermentation et de la respiration mitochondriale est essentiel afin d’élucider les mécanismes moléculaires derrière certains phénotypes comme le Crabtree et Warburg effets2,3. L’effet Crabtree est caractérisée par une augmentation du flux glycolytique, répression de la respiration mitochondriale et mise en place de la fermentation comme la voie principale pour générer de l’ATP en présence de fortes concentrations de glucides fermentescibles (> 0,8 mM)4,5. L’effet Warburg est métaboliquement analogue à l’effet Crabtree, la différence étant que dans les cellules de mammifères, le principal produit de fermentation est lactate6. En effet, l’effet Warburg est illustré par une variété de cellules cancéreuses, déclenchant l’absorption du glucose et la consommation, même en présence d’oxygène7. Ainsi, étudier la base moléculaire du passage de la respiration à la fermentation dans l’effet Crabtree possède des répercussions biotechnologiques (pour la production d’éthanol) et impacts potentiels en recherche sur le cancer.
La croissance de S. cerevisiae peut être un outil approprié pour étudier les effets de Crabtree et Warburg. Cette idée est fondée sur le fait que dans la phase exponentielle de la levure, les voies centrales utilisées pour produire de l’ATP sont la respiration mitochondriale et la fermentation, qui sont essentielles pour soutenir la croissance. Par exemple, la croissance de S. cerevisiae est intimement liée à la fonction des voies génératrices de ATP. Dans les molécules de S. cerevisiae, la respiration mitochondriale produit environ 18 ATP par molécule de glucose, alors que la fermentation ne génère que 2 molécules d’ATP, donc il est prévu que le taux de croissance a des liens serrés avec les voies métaboliques production d’ATP,8. À cet égard, lorsque la fermentation est la principale voie pour générer de l’ATP, la levure compense la faible production d’ATP en augmentant le taux d’absorption du glucose. Au contraire, la consommation de glucose par les cellules de levure qui utilisent la respiration mitochondriale comme la principale source d’ATP est faible. Cela indique qu’il est important pour la levure pour la disponibilité de glucides sens avant de déterminer comment ATP sera généré. Par conséquent, la disponibilité de glucose joue un rôle important dans le commutateur entre la fermentation et de la respiration mitochondriale dans S. cerevisiae. En présence de quantités élevées de glucose, la levure préfère fermentation comme la voie centrale pour générer de l’ATP. Fait intéressant, lorsque la levure est en train de fermenter, le taux de croissance spécifique est maintenu à son maximum. En revanche, en vertu de faibles niveaux de glucose, S. cerevisiae produit ATP à l’aide de la respiration mitochondriale, maintenir des taux de croissance inférieurs. Ainsi, la variation de la concentration de glucose et de l’utilisation d’autres sources de carbone induire des changements dans la préférence de la levure entre croissance fermentaire et respiratoire. En tenant compte de ce fait avec l’équation exponentielle, on peut obtenir la signification biologique des paramètres cinétiques telles que le doublement des temps (Dt) et le taux de croissance spécifique (µ). Par exemple, des valeurs plus faibles de µ trouvées lorsque la levure utilise la respiration mitochondriale comme la voie principale. Au contraire, dans des conditions qui favorisent la fermentation, des valeurs de µ plus élevées trouvées. Cette méthode peut être utilisée pour mesurer les mécanismes probables de tout produit chimique influant sur la fermentation et la respiration mitochondriale dans S. cerevisiae.
L’objectif de cet article est de proposer une méthode basée sur la cinétique de croissance pour contrôler les effets d’un substance donné/composé sur la respiration mitochondriale ou fermentation.
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Protocol
1. milieux de Culture et de la préparation de l’Inoculum
- Préparation de 100 mL de milieu liquide extrait-peptone-dextrose (DPJ) levure de 2 % (ajouter 1 g de levure extrait, 2 g de peptone de caséine, et 2 g de glucose pour 100 mL d’eau distillée). Diluer 3 mL des médias dans des tubes coniques stérilisable 15 mL. Autoclave les médias pendant 15 min à 121 ° C et 1,5 lb/po2.
Remarque : Les médias peuvent être stockés pendant jusqu'à un mois, 4 – 8 ° c. - Ensemencer un tube conique rempli de 3 mL de bouillon de la DPJ 2 % stérile cool avec 250 μl de cellules de S. cerevisiae conservés en glycérol à-20 ° C. Incuber pendant la nuit dans un agitateur orbital à 30 ° C sous agitation à 200 tr/min.
- Ensemencer une boîte de Pétri (60 x 15 mm2) rempli d’agar de la DPJ stérile 2 % (ajouter 10 g de levure extrait, 20 g de peptone de caséine, 20 g de glucose, et 20 g d’agar bactériologique à 1 000 mL d’eau distillée) avec les cellules cultivées dans le tube à fond conique à l’aide d’une anse stérile. Incuber le de Petri à 30 ° C jusqu'à ce que les colonies isolées montrent une croissance.
- Préparation de l’inoculum avant en inoculant une seule colonie isolée dans un tube conique contenant 10 mL de cool bouillon stérile de la DPJ 2 % et du jour au lendemain il incuber à 30 ° C sous agitation continue à 200 tr/min.
2. les milieux de Culture et les courbes de croissance en microplaques
- Préparer 10 mL de bouillon de la DPJ de 1 % (ajouter l’extrait de 0,1 g de levure, 0,2 g de peptone, et 0,1 g de glucose à 10 mL d’eau distillée), 10 mL de bouillon de la DPJ de 2 % (ajouter l’extrait de 0,1 g de levure, 0,2 g de peptone, et 0,2 g de glucose à 10 mL d’eau distillée) et 10 mL de bouillon de la DPJ de 10 % (ajouter l’extrait de 0,1 g de levure, 0,2 g de peptone, et 1 g de glucose à 10 mL d’eau distillée). Autoclave ces milieux de croissance pendant 15 min à 121 ° C et 1,5 lb/po2.
Remarque : Les milieux de culture sert à un contrôle de croissance fermentaire. - Préparer 10 mL de bouillon de 2 % levure extrait-peptone-éthanol (YPE) et 10 mL de bouillon de 2 % levure extrait-peptone-glycérol (GPJ). 2 % YPE : ajouter l’extrait de 0,1 g de levure, 0,2 g de peptone, et 0,2 mL d’éthanol à 10 mL d’eau distillée. 2 % GPJ : ajouter l’extrait de 0,1 g de levure, 0,2 g de peptone, et 0,2 mL de glycérol à 10 mL d’eau distillée. Autoclave ces milieux de croissance pendant 15 min à 121 ° C et 1,5 lb/po2.
NOTE : Glycérol et l’éthanol sont des sources de carbone non fermentescibles qui sont exclusivement métabolisés par la respiration mitochondriale. Pour cette raison, ils sont utilisés comme un contrôle de croissance respiratoire. Dans cette étape, le type et la concentration de la source de carbone dans les milieux de culture peuvent être réglées pour tester les effets sur le phénotype de la croissance en utilisant le levure extrait-peptone (YP) bouillon (10 g d’extrait de levure et 20 g de peptone de caséine dans 1 000 mL d’eau distillée) comme base. Pour tester les effets d’autres éléments nutritifs en plus de carbone, un milieu synthétique (SC) complet est complété selon le but de l’expérience. La base de la moyenne de SC est 1,8 g d’azote de levure base sans acides aminés, 5 g de sulfate d’ammonium [(NH4)2SO4], 1,4 g de phosphate monosodique (NaH2PO4), et 2 g d’abandon mélanger dans 1 000 mL d’eau distillée. Compléter les médias avec une source de carbone et la source d’azote supplémentaire dans les concentrations nécessaires. - Ajouter 145 μL de milieux de culture approprié pour le protocole expérimental dans chaque puits d’une microplaque stérile (10 x 10 puits) avec un couvercle et les ensemencer avec 5 μL de l’inoculum avant.
Remarque : Si le but est d’éliminer l’influence de substances/composés sur le métabolisme énergétique de la levure, cet substance/composé devrait être ajouté au cours de cette étape. En outre, n’importe quel type de microplaque avec un couvercle devrait être utile. - Incuber les plaques multipuits dans un lecteur de microplaques à 30 ° C sous agitation constante à 200 tr/min pendant 48 h. mesurer la densité optique (do) à 600 nm toutes les 30 ou 60 min.
Remarque : Si le lecteur de microplaque ne possède pas l’option pour incuber la microplaque, il peut être incubé dans un agitateur orbital dans les mêmes conditions entre chaque mesure de la Division d’opposition.
3. croissance courbes dans des fioles coniques secoués
- Ajouter 4,8 mL du milieu de culture approprié à l’autoclave et fioles coniques de 20 mL. Inoculer chaque fiole avec 200 μl de la culture pré inoculum à OD600nm ~ 2 dans le bouillon de la DPJ 2 % frais et stérile. Les incuber à 30 ° C sous agitation constante à 250 tr/min pendant 24 h.
Remarque : Si la période d’incubation est supérieure à 24 h, ajouter 12 mL du milieu de culture approprié à l’autoclave et fioles coniques de 50 mL. Les ensemencer avec 500 μL d’inoculum avant. Il est également important d’examiner les contrôles croissance fermentaire (médias YP avec 1 %, 2 %, soit 10 % de glucose) et les contrôles de croissance respiratoire (médias YP avec 2 % de glycérol ou éthanol). - Prendre 100 μL de la culture de la fiole conique secoué et diluez-la dans 900 μL d’eau distillée dans une cuvette de spectrophotomètre de 1 mL et mélanger doucement en pipettant également. Mesurer le diamètre extérieur à 600 nm à l’aide d’un spectrophotomètre toutes les 2 h. Pour obtenir la vraie OD, multipliez le résultat par dix.
4. traitement des données et calcul des paramètres cinétiques
-
Créez un nouveau fichier de projet dans le logiciel progiciel de statistiques. Dans la section « nouveau tableauet graphique », choisissez l’option « XY » .
- Sélectionnez l’option : « Commencer par un tableau de données vide » dans la section « Exemples de données » .
- Sélectionnez le type de graphique « Points et la ligne de connexion » . Quitter la section « X » non sélectionnée dans le segment des « Subcolumns pour des répétitions ou des valeurs erronées », et dans « Y » section Choisissez l’option : « Entrer des valeurs répétées (10) en côte à côte subcolumns et tracer la moyenne et l’erreur SD ». Cliquez sur le bouton créer.
Remarque : Le format de table comporte une colonne X et plusieurs colonnes de Y, chacune avec les 10 subcolumns choisis précédemment.
- Écrire l’heure à laquelle OD les mesures ont été prises dans la colonne de X (par exemple, 0, 30, 60, 90 min ou 0, 1, 1,5, 2 h). Dans les colonnes de Y, écrire les valeurs de OD obtenus à partir des cultures.
- Identifier la phase exponentielle de croissance transformant les données de colonne Y en logarithmes. Cliquez sur le bouton « Analyser » , choisissez l’analyse « Transformer » , sélectionnez les valeurs de Y à l’aide de Y = système. Allez à la « Galerie des résultats », sélectionnez « Transform » table de données, cliquez sur le bouton « Analyser » et choisissez l’analyse de « Régression linéaire » . Exclure les valeurs do qui ne suivent pas un comportement linéaire. Pour exclure des valeurs, sélectionnez-les dans le tableau de données, puis tapez « Ctrl + E ».
Remarque : Il est important d’exclure les valeurs qui ne suivent pas la phase exponentielle, puisque l’équation exponentielle correspond bien à la phase exponentielle. - Dans la « Galerie de tableaux de données », sélectionnez la table de données « donnée 1 ». Cliquez sur le bouton « Analyser » et choisissez l' analyse de « Régression non-linéaire (ajustement de courbe) » parmi les « analyses XY ».
- Sélectionnez les jeux de données à analyser, puis cliquez sur le bouton « OK » . Dans l’onglet « Ajuster » choisir la section « Équation exponentielle » et sélectionnez l' « équation de croissance exponentielle » (où X est la concentration cellulaire, X0 est la concentration cellulaire au temps zéro, μ est le taux de croissance spécifique, et t est le temps). Utilisez la « méthode des moindres carrés digne » comme une méthode de lissage et laisser désélectionnées la section interpoler. Cliquez sur le bouton « OK » .
Remarque : L’onglet avec les résultats de forme non linéaires est dans la « Galerie des résultats ». Le logiciel calcule doublement temps (Dt) et spécifiques au taux de croissance (μ). Le logiciel montre μ comme K dans l’onglet résultats. - Ouvrez un nouveau fichier de projet et dans la section « nouveau tableau et graphique » , sélectionnez le choix de la colonne. Choisissez l’option « Démarrer avec une table de données vide » et sélectionnez le graphe désiré. Choisissez tracer la moyenne avec la SD, sélectionnez le bouton « Créer » .
- Copier les valeurs de Dt ou de μ dans l’onglet résultats fit non linéaire qui est dans la « Galerie des résultats » et les coller dans une colonne. Enfin, cliquez sur le bouton « Analyser » et choisissez l’analyse désirée dans la section « Analyses de colonne » pour comparer les paramètres cinétiques des différentes conditions éducationnels.
Remarque : Les paramètres cinétiques obtient des contrôles croissance fermentaire (médias YP avec 1 %, 2 %, soit 10 % de glucose) et contrôles de croissance respiratoire (médias YP avec 2 % de glycérol ou éthanol) permet d’établir le seuil de la respiration par fermentation et mitochondriale, respectivement. En comparant la cinétique les paramètres de l’état nutritionnel et de la substance/composés testés avec la croissance de l’appareil respiratoire et fermentative aident à identifier l’effet possible sur le métabolisme respiratoire ou par fermentation.
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Representative Results
Courbes de croissance peuvent être utilisés pour distinguer provisoirement respiratoires et fermentatives phénotypes dans la levure S. cerevisiae . Donc, nous avons effectué des cultures en batch de S. cerevisiae (BY4742) avec des concentrations de glucose différentes qui ont été signalées pour induire la croissance par fermentation : 1 %, 2 % et 10 % (p/v)9. Les cultures présentant un phénotype fermentatif ont une phase de latence faible et une phase exponentielle de croissance avec un taux de croissance élevé (Figure 1). L’éthanol, glycérol et le lactate sont les sources de carbone qui peuvent être métabolisés uniquement par le biais de la respiration ; ainsi, nous avons réalisé des cultures de la levure à l’aide de ces sources de carbone. Des cultures qui obtiennent l’énergie principalement par la phosphorylation oxydative ont montré une phase de latence prolongée et la lenteur de la croissance au cours de la phase exponentielle (Figure 2).
Analyse des courbes de croissance fournit uniquement des informations qualitatives ; par conséquent, il est important de calculer les paramètres cinétiques pour obtenir des informations quantitatives. Nous avons calculé la Dt et μ à l’aide de l’équation exponentielle (Figure 3). Nous avons fixé un seuil pour les valeurs de croissance respiratoire à Dt ≥11.5 h et μ ≤0.059 / h. Le seuil de croissance fermentaire a été fixé à Dt ≤6.5 h et μ ≥0.149 / h (Figure 3).
Pour prouver l’utilité de cet outil de dépistage, nous avons conçu trois expériences, la première pour évaluer les effets des concentrations différentes de resvératrol (RSV) sur les cellules de S. cerevisiae BY4742 statut énergétique différent (Figure 4) dans fioles agitées. La seconde expérience visant à détecter les effets de concentrations différentes sulfate d’ammonium (NH4+) sur le métabolisme énergétique du BY4742 de S. cerevisiae (Figure 5) dans une microplaque. Enfin, le troisième visant à illustrer comment les changements dans la source de carbone affectent croissance fermentaire dans deux différentes souches de S. cerevisiae (W303 et industriel WLP530 utilisé pour la fermentation de la bière) (Figure 6). Dans l’expérience par le RSV, l’état énergétique de cellule a été modifiée en faisant varier la concentration de glucose. À 10 % de glucose, toutes les concentrations de RSV testées n’a pas changé la phase respiro-fermentaire des levures mais diminue la phase respiratoire (pendant le quart de diauxique, S. cerevisiae métabolisé l’éthanol produit au cours de la phase exponentielle de phosphorylation oxydative). Les valeurs μ a confirmé que dans toutes les conditions testées, S. cerevisiae a montré un comportement fermentaire, contrairement à son phénotype lorsqu’il est cultivé en glycérol 2 % (État comme un contrôle respiratoire) (Figure 4 a). Lorsque les cellules ont été excitées avec seulement 1 % de glucose, les valeurs μ a confirmé qu’à 0,1, 1, 10 et 100 µM RSV, comportement fermentaire dans la phase respiro-fermentaire n’était pas affecté. Toutefois, on a observé une diminution dans la phase respiratoire durant la transition diauxique. En outre, à une concentration de 1 000 µM, RSV a complètement inhibé la croissance des cellules.
Dans la seconde expérience, les cellules ont été additionnés de 10 % de glucose, une concentration jugée suffisante pour provoquer l’effet Crabtree dans S. cerevisiae. Par conséquent, nous avons pu observer l’effet promue par la supplémentation de différentes concentrations de NH4+ à métabolisme fermentatif. Les valeurs de Dt a suggéré que 0,13, 0,66 et métabolisme fermentatif de 1,99 % NH4+ faveur, et il peut être observé dans les courbes de croissance que ces concentrations prolongé la phase exponentielle de croissance de la culture. Néanmoins, à 3,31 % mM NH4+, une augmentation de la valeur de Dt a montré que cette concentration induit un métabolisme fermentatif-respiro. Ce phénotype a montré une phase de latence prolongée dans les courbes de croissance et des taux de croissance plus lente dans la phase exponentielle (Figure 5).
Dans la troisième expérience, les cellules de deux différentes souches de S. cerevisiae (W303 et WLP530) ont été cultivés dans des concentrations différentes de saccharose ou de galactose pour tester si les effets de la source de carbone sur les valeurs de Dt étaient dépendante de la souche. Qu’un contrôle fermentaire, les deux souches sont cultivées dans les 2 % de glucose et Dt valeurs ont été calculées pour définir un seuil de croissance fermentaire. La fermentation Dt des valeurs pour les souches étaient différentes, avec h pour la souche W303 et h pour le WLP530 de ≤6.84 ≤3.25 la souche. Par conséquent, il est important de souligner la nécessité pour les validant le seuil Dt pour différentes souches utilisées. En outre, quand le saccharose a été utilisé comme source de carbone, un phénotype fermentaire a été observé à 2 % et 10 % dans les deux souches. Toutefois, lorsque le galactose a été utilisé, la souche W303 n’a pas montré comportement fermentaire dans aucune des concentrations testées, alors que la souche WLP530 a montré un phénotype fermentaire à 2 % de galactose. Fait intéressant, la souche W303 a augmenté dans toutes les concentrations de ces deux sources de carbone testés. Cependant, la souche WLP530 ne montre pas de croissance à la plus faible concentration de carbone utilisé (0,01 %). C’est peut-être parce que WLP530 est utilisé dans l’industrie de la bière et les concentrations de carbone auxquels il est exposé sont généralement beaucoup plus élevé (Figure 6).
Au total, les données de ces trois expériences prouvent que les courbes de croissance et les paramètres cinétiques sont utiles pour la discrimination préliminaire entre croissance respiratoire et fermentative chez S. cerevisiae. En outre, il est important de souligner qu’il s’agit d’un outil polyvalent qui peut être utilisé dans différents aspects de la recherche sur le métabolisme énergétique.
Figure 1 : Effet des concentrations de glucose différent sur le phénotype de la croissance de S. cerevisiae . Des courbes de croissance ont été construits en mesurant la densité optique à 600 nm toutes les 30 minutes pendant 48 h. Lorsque les cellules de S. cerevisiae fermentent, cultures ont montré une phase de latence courte et le taux de croissance rapide au cours de la phase exponentielle. La phase respiro-fermentaire pourrait être suivie d’une phase de ralentissement de la croissance (phase respiratoire), où l’éthanol produit par fermentation est métabolisé en utilisant la voie de la phosphorylation oxydative, puis la phase stationnaire est atteint. Les données sont présentées comme la moyenne ± écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Effet de sources de carbone respirable sur le phénotype de la croissance de S. cerevisiae . Des courbes de croissance ont été construits en mesurant la densité optique à 600 nm toutes les 30 minutes pour les cellules de 48 h. de S. cerevisiae ont montré une phase de latence prolongée et le faible taux de croissance au cours de la phase exponentielle et généralement n’ont pas montré un changement diauxique. Les données sont présentées comme la moyenne ± écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Effet de la source de carbone et sa concentration sur les paramètres cinétiques de S. cerevisiae . (a) Dt des valeurs de croissance de S. cerevisiae BY4742 sous différentes sources de carbone ; (b) les valeurs μ de S. cerevisiae BY4742 croissance sous différentes concentrations de sources de carbone diverses. Données sont présentées sous forme de la moyenne ± écart-type. Des analyses statistiques ont été réalisées à l’aide d’une ANOVA à suivie essai de Dunnett, un (*p < 0,01 vs. 2 % de glucose). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : effet de la supplémentation en resvératrol sur statuts d’énergie cellulaire différent. (un) croissance phénotype et μ des valeurs à l’aide de 10 % de glucose ; (b) croissance phénotype et μ valeurs à l’aide de 1 % de glucose. Données de courbes de croissance sont présentées comme la moyenne ± écart-type, et les valeurs μ sont présentées comme la moyenne ± écart-type. Des analyses statistiques pour les valeurs μ ont été effectuées à l’aide d’une ANOVA à suivie de test de Dunnett, un [*p < contrôle respiratoire vs 0,01. avec 2 % de glycérol (RC)]. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Effet de la supplémentation de sulfate d’ammonium sur le métabolisme énergétique de S. cerevisiae . Courbes de croissance ont été construits en mesurant la densité optique à 600 nm toutes les 30 minutes pendant 48 h. données de courbes de croissance sont présentées comme la moyenne ± écart-type, et les valeurs μ sont présentées comme la moyenne ± écart-type. Des analyses statistiques pour les valeurs de Dt ont été effectuées à l’aide d’une ANOVA à suivie de test de Dunnett, un [* p < contrôle respiratoire vs 0,01. avec 2 % de glycérol (RC)]. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : effet de la concentration de galactose et de saccharose dans le métabolisme fermentatif de Saccharomyces cerevisiae. (a) Dt les valeurs pour le W303 lab souche et (b) Dt pour la souche industrielle de WLP530. Données sont présentées sous forme de la moyenne ± écart-type. Des analyses statistiques pour les valeurs de Dt ont été effectuées à l’aide d’une ANOVA à suivie de test de Dunnett, un [* p < 0,01 vs. 2 % de glucose (contrôle par fermentation)]. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Beaucoup de temps s’est écoulé depuis J. Monod10 exprimé que l’étude de la croissance des cultures bactériennes est la méthode de base de la microbiologie. L’avènement des outils moléculaires retarde l’utilisation et l’étude de la croissance en tant que technique. Malgré la complexité de la croissance, ce qui implique de nombreux processus interdépendants, ses mécanismes sous-jacents peuvent être décrit en utilisant des modèles mathématiques11. Il s’agit d’une approche solide qui peut être utilisée comme un outil complémentaire pour élucider les mécanismes moléculaires plus complexes12.
Pour obtenir des résultats fiables de cette méthode, il est important de considérer les étapes essentielles suivantes. Agitation à 250 tr/min est essentielle à une bonne croissance dans des sources de faible teneur en carbone qui exercent la croissance respiratoire, car lorsque vous utilisez basse vitesses d’agitation (150 – 180 tr/min), nous avons observé réduit la croissance dans les affections respiratoires. Il est important de lancer le protocole utilisant un stock frais, et il est également essentiel de maintenir un phénotype uniform dans les essais. Valeurs seuils de croissance cinétique varient selon les souches et doivent être validées en fonction de l’État pour être utilisé dans les essais. Le logiciel GraphPad Prism est proposé parce que l’équation exponentielle est déjà préchargée ; Cependant, tout autre logiciel est adapté, autant il permet la programmation de l’équation exponentielle. Dans la microplaque, il est recommandé d’inclure trois puits avec 150 μL de milieux de culture sans inoculum — il s’agit d’un contrôle qui indique si la microplaque ont souffert de la contamination.
Il est important d’indiquer que tracer les données OD sur une échelle linéaire peut rendre difficile de déterminer la phase de croissance logarithmique. Ce problème peut être surmonté en traçant les données OD dans une échelle logarithmique afin que la phase de latence et de la phase de croissance logarithmique sont clairement visibles.
Ce protocole est uniquement utilisé pour dépister un phénotype, donc les effets spécifiques sur la fermentation et de la respiration mitochondriale doivent être confirmées. Nous vous recommandons la quantification de la respiration mitochondriale par tests de consommation d’oxygène13,14, tandis que la fermentation peut être déterminée par l’accumulation des sous-produits tels que l’acétate, le succinate, glycérol et l’éthanol9 .
La croissance de S. cerevisiae a servi comme un moyen pour la compréhension des mécanismes moléculaires et des phénotypes, avec les méthodes de dépistage aux essais essais de. Néanmoins, nombreuses conceptions expérimentales dans la littérature utilisent la croissance de levure seulement comme un paramètre de qualité (p. ex., les dilutions de plaque ou de courbes de croissance), donc l’emploi de ces techniques néglige précieux témoignage. Par exemple, l’oxygène disponible dans les boîtes de gélose utilisés pour compter la population microbienne ou la fabrication de série-les dilutions est limitée, ce qui complique la mesure de la croissance dans des conditions respiratoires. En outre, lorsque deux ou plusieurs cellules restent attachés les uns aux autres, qu’une colonie est observée. Une autre limitation est l’utilisation des courbes de croissance comme un résultat visuel pour mettre en évidence des différences dans la croissance, ce qui peut laisser de côté faits au sujet des différences subtiles. Par conséquent, la traduction de l’information de croissance aux paramètres quantitatifs permet l’obtention de données précises sur le phénotype exercée. Néanmoins, la représentation mathématique de la croissance est une entreprise scientifique complexe. La plupart des études examinent pleine croissance (retard, Journal et phases stationnaires) des micro-organismes, obtenir les équations polynomiales de poids fort qui ne servent qu’une condition environnementale. Malgré la relative simplicité lors du calcul des coefficients de ces équations de régression linéaire, il est difficile de leur attribuer une signification biologique inhérente15. L’analyse de la croissance en séparant les phases de croissance est mathématiquement simple et fiable. Un exemple de ceci est l’équation exponentielle de croissance, qui repose sur la cinétique du premier ordre et correspond bien à une phase de latence courte et la phase exponentielle.
Enfin, étudier la phase log à l’aide de l’équation exponentielle est une méthode cohérente pour comprendre l’influence de la respiration mitochondriale ou fermentation sur un composé spécifique ou l’environnement. Comme une preuve de concept, quantification de croissance en phase exponentielle a démontré que RSV affecte spécifiquement la croissance respiratoire13,14. Ici, la croissance a été un outil précieux pour identifier que RIM15 suppression probable améliore le métabolisme fermentatif par inhibition partielle de la capacité de respiration dans S. cerevisiae9. Ces données corroborent qu’observant la croissance permet l’étude du métabolisme respiratoire et fermentatif et est une méthode simple et fiable. Par conséquent, cette approche permet pour contrôler les effets d’une substance spécifique sur la respiration mitochondriale ou fermentation.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce projet a bénéficié de subventions du Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (numéro de licence 293940) et Fundación TELMEX-TELCEL (numéro de licence 162005585), tous deux à IKOM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
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