Summary
여기 선물이 지 수 성장 방정식에 Saccharomyces cerevisiae 의 지 수 성장 피팅 하 여 호흡과 발효 대사를 추정 하는 프로토콜. 운동 매개 변수 계산 발효 또는 미토 콘 드리 아 호흡 물질/화합물의 영향의 심사에 대 한 수 있습니다.
Abstract
지 수 단계에 saccharomyces cerevisiae 세포 발효 및 미토 콘 드리 아 호흡을 통해 ATP를 생산 하 여 그들의 성장 유지. Fermentable 탄소 농도 주로 효 모 세포에서 ATP;를 생성 하는 방법을 제어합니다 따라서, fermentable 탄수화물 수준에 변화 S. cerevisiae의 에너지 대사를 드라이브. 이 신문은 추정의 농도 변경 효과 호흡과 발효 대사에 탄소 소스의 자연 지 수 효 모 성장에 따라 높은 처리량 방법을 설명 합니다. S. cerevisiae 의 성장 한 microplate에 측정 또는 원뿔 동요 600에서 광학 밀도 (OD)를 결정 하 여 플라스 크 nm. 그런 다음, 성장 곡선 그리기 세 시간, 식별 및 지 수 위상의 선택을 허용 하 고 운동 매개 변수를 지 수 성장 방정식은 장착 대에 의해 만들어집니다. 높은 두 배로 시간 낮은 특정 성장 속도 일반적으로 호흡기 성장을 나타냅니다. 반대로, 낮은 배로 시간 높은 특정 성장 율 일 성장을 나타냅니다. 임계값의 시간과 특정 성장 율을 두 배로 잘 알려진 호흡 또는 발효 조건, 비-fermentable 탄소 소스 등 fermentable 설탕의 높은 농도 사용 하 여 견적 된다. 이 각 특정 스트레인에 대 한 얻을 수 있습니다. 마지막으로, 계산 된 운동 매개 변수 효 모 발효 및/또는 호흡기 성장을 보여줍니다 여부 설정 임계값 값으로 비교 됩니다. 이 방법의 장점은 일 또는 호흡 대사에는 물질 또는 화합물의 효과 이해 하기 위한 상대적 단순입니다. 성장 한 복잡 하 고 복잡 한 생물 학적 과정; 강조 하는 것이 중요 하다 따라서,이 방법에서 예비 데이터 산소 소비량의 정량화와 발효 부산물의 축적에 의해 뒷받침 해야 합니다. 따라서,이 기술은 화합물/방해 하거나 발효 또는 호흡기 신진 대사를 향상 시킬 수 있는 물질의 예비 심사로 사용할 수 있습니다.
Introduction
Saccharomyces cerevisiae 성장 수십 생리 및 분자 메커니즘을 식별 하는 유용한 도구를 역임 했다. 성장 주로 세 가지 방법에 의해 측정 된다: 자리 테스트, 콜로 니 형성 단위, 및 성장 곡선에 대 한 직렬 희석. 이러한 기술은 특정 응답 또는 고기를 조사 하거나 기질, 환경 조건, 돌연변이, 그리고 화학 물질의 다양 한와 함께 사용할 수 있습니다.
미토 콘 드리 아 호흡 있는 성장 속도 론 성공적으로 적용 된 알 수 없는 메커니즘을 발견에 대 한 생물 학적 과정 이다. 이 경우에, 비 fermentable 탄소와 성장 매체의 보충 소스 글리세롤, 젖 산, 에탄올 (미토 콘 드리 아 호흡에 의해 대사만), 등 평가 대 한 수 있습니다 유일한 탄소 및 에너지 소스는 호흡기 성장, 산화 인 산화 활동1에 물결을 감지 하는 것이 중요 하다는. 다른 한편으로, 그것은 발효 뒤에 메커니즘을 파악 하기 위한 방법으로 성장 운동 모델을 사용 하 여 복잡 하다입니다.
발효와 미토 콘 드리 아 호흡의 연구 크랩 트리 및 바르 부르 크 효과2,3같은 특정 고기 뒤에 분자 메커니즘을 명료 하 게 필수적 이다. 크랩 트리 효과 glycolytic 플럭스의 증가, 미토 콘 드리 아 호흡의 억압과 fermentable 탄수화물의 높은 농도의 ATP를 생성 하는 기본 통로로 발효의 설립에 의해 특징입니다 (> 0.8 m m)4,5. 바르 부르 크 효과 되는 포유류 세포에 발효의 주요 제품 젖6metabolically 크랩 트리 효과 차이와 아날로그. 실제로, 바르 부르 크 효과 다양 한 트리거링 포도 당 통풍 관 및 산소7존재도 소비 하는 암 세포에 의해 전시 된다. 따라서, 크랩 트리 효과에 발효 호흡에서 스위치의 분자 기초 공부에 (에탄올 생산)에 대 한 바이오 영향 및 잠재적인 영향 암 연구 합니다.
S. cerevisiae 성장 크랩 트리 및 바르 부르 크 효과 공부 하는 적합 한 도구 있을 수 있습니다. 이 아이디어는 효 모 지 수 단계에서 ATP를 생산 하는 데 사용 하는 중앙 통로 미토 콘 드리 아 호흡과 발효, 성장을 유지 하기 위해 필수적인 사실에 기반. 예를 들어, S. cerevisiae 의 성장 ATP 생성 통로의 기능을 밀접 하 게 관련 되어 있습니다. 포도 당 분자 당 S. cerevisiae, 미토 콘 드리 아 호흡 생산 약 18 ATP 분자, 발효만 2 ATP 분자를 생성 하는 반면 따라서 그것 전망 이다 성장 율 변화 통로와 꽉 링크는 ATP8생산. 이와 관련, 발효 ATP를 생성 하는 주요 경로 이면 누 룩 낮은 ATP 생산 함으로써 보완 포도 당 통풍 관의 속도 증가 합니다. 그와 반대로, 미토 콘 드리 아 호흡 주요 ATP 소스로 사용 하는 효 모 세포에 의해 포도 당 소비는 낮다. 이 ATP 생성 되는 방법을 결정 하기 전에 이해 탄수화물을 효 모에 대 한 중요 한는 것을 나타냅니다. 포도 당 가용성 발효와 미토 콘 드리 아 호흡에서의 전환에 중요 한 역할을 담당 하는 따라서, S. cerevisiae. 높은 양의 포도 당의 누 룩 발효를 ATP를 생성 하는 중앙 노선으로 좋아한다. 흥미롭게도, 누 룩을 발효 하면 특정 성장 율 최대 유지 됩니다. 다른 한편으로, 포도의 낮은 수준에서 S. cerevisiae 생성 ATP 미토 콘 드리 아 호흡을 사용 하 여 낮은 성장 율을 유지 합니다. 따라서, 포도 당 및 다른 탄소 원의 사용의 농도에 변화 일 및 호흡기 성장 사이 누 룩의 기본 설정에서 변경 유도. 이 사실을 지 수 성장 방정식을 고려 하 여 한 시간 (Dt)와 특정 성장 율 (μ)를 배로 운동 매개의 생물학적 의미를 얻을 수 있습니다. 예를 들어 μ 값 효 모 미토 콘 드리 아 호흡을 사용 하 여 기본 경로로 발견 되었다. 그와 반대로, 발효를 선호 하는 조건 하에서 높은 μ 값이 발견 되었다. 이 방법론 발효 및 미토 콘 드리 아 호흡에 영향을 미치는 화학 물질의 가능한 메커니즘을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다 S. cerevisiae.
이 문서의 목적은 심사 미토 콘 드리 아 호흡 또는 발효에 주어진된 물질/화합물의 효과 대 한 성장 속도에 따라 방법 제안.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 문화 미디어와 Inoculum 준비
- 준비 2% 효 모 추출-펩-포도 당 (YPD) 액체 매체의 100 mL (1 g의 효 모 추출 물, 카 세 인 펩의 2 세대 및 2 세대 포도의 100 ml의 증류수를 추가). 15 mL 원뿔 튜브를 sterilizable으로 미디어의 3 mL을 분배. 고압 121 ° C와 1.5 psi에서 15 분에 대 한 미디어.
참고: 미디어는 4-8 ° c.에 최대 한 달 동안 저장 될 수 있다 - 가득-20 ° c.에 글리세롤에 보존 하는 S. cerevisiae 세포의 250 μ와 멋진 살 균 2 %YPD 국물의 3 mL 원뿔 튜브를 예방 200 rpm 동요와 30 ° C에서 궤도 통에서 밤새 품 어.
- 페 트리 접시 (60 x 15 m m2) 살 균 2% YPD agar 가득 행진 (10 g의 효 모 추출 물, 카 세 인 펩의 20 g 포도 당의 20 g 그리고 증류수 1000 ml의 세균 agar의 20 g 추가) 메 마른 루프를 사용 하 여 원뿔 튜브에 성장 하는 세포. 고립 된 식민지 성장을 표시 될 때까지 30 ° C에서 배양 접시를 품 어.
- 하나의 고립 된 식민지 가득한 멋진 살 균 2 %YPD 국물의 10 mL 원뿔 튜브에 접종 하 여 사전 inoculum을 준비 하 고 200 rpm에서 지속적인 동요와 30 ° C에서 밤새 품 어.
2. 문화 미디어와 Microplate에 성장 곡선
- 1 %YPD 국물의 10 mL를 준비 (0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g과 포도의 10 ml의 0.1 g에 증류수를 추가), 2 %YPD 국물의 10 mL (0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g 그리고 증류수 10 mL에 포도의 0.2 g 추가) 그리고 10 %YPD 국물의 10 mL (0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g을 증류수 10 mL에 포도의 1 g 추가). 압력솥이 성장 매체 1.5 psi 121 ° C에서 15 분.
참고: 문화 미디어 일 성장의 컨트롤 역할을 합니다. - 2% 효 모 추출 물 펩 에탄올 (형식) 국물의 10 mL와 10 mL 2% 효 모 추출 물 펩 글리세롤 (YPG) 국물을 준비 합니다. 2%에 대 한 형식: 0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g을 증류수 10 mL에 에탄올의 0.2 mL를 추가. 2 %YPG: 0.1 g의 효 모 추출 물, 펩, 0.2 g 그리고 증류수 10 mL에 글리세롤의 0.2 mL를 추가. 압력솥이 성장 매체 1.5 psi 121 ° C에서 15 분.
참고: 글리세롤과 에탄올은 독점적으로 미토 콘 드리 아 호흡에 의해 물질 대사로 변화 비 fermentable 탄소 소스. 이러한 이유로, 호흡기 성장 컨트롤로 사용 됩니다. 이 단계에서 효 모 추출 물 펩 (YP) 국물 (10 g의 효 모 추출 물 및 증류수 1000 mL에 카 세 인 펩의 20 g)를 기본으로 하 여 성장 표현 형에 영향을 테스트 유형과 문화 미디어에서 탄소 소스의 농도 변경할 수 있습니다. 탄소 이외의 다른 영양소의 효과 테스트 하려면 합성 완료 (SC) 매체 실험의 목표에 따라 보충 된다. 사우스 캐롤라이나 매체에 대 한 자료는 아미노산, 황산 암모늄 5 g 없이 기본 효 질소의 1.8 g [(NH4)2등4], 1.4 g의 글루타민 인산 염 (NaH2포4), 드롭 아웃의 2 세대 1000 mL의 증류수에 혼합. 탄소 소스와 필요한 농도에서 추가 질소 소스 미디어를 보충. - 실험 설계에 대 한 적합 한 문화 미디어의 145 μ 뚜껑 살 균 미 판 (10 x 10-잘)의 각 음을 추가 하 고 사전 inoculum의 5 μ와 예방.
참고: 지금까지 목표는 화면에 누 룩의 에너지 대사 물질/화합물의 영향, 경우에 그 물질/화합물이이 단계 동안 추가 되어야 합니다. 또한, 모든 유형의 뚜껑 microplate 유용 해야 한다. - 다 잘 접시 200 rpm에서 48 h. 측정 600에서 광학 밀도 (OD)에 대 한 지속적인 동요와 30 ° C에서 microplate 리더에 품 어 nm 매 30 또는 60 분.
참고: microplate 리더에는 미 판 품 어 하는 옵션이 없는 경우 그것은 수 있습니다 알을 품는 OD의 모든 측정 사이 동일한 조건에서 궤도 통에.
3. 성장 곡선 소동된 원뿔 플라스 크에
- 20 mL 원뿔 플라스 크 및 고압에 적합 한 문화 미디어의 4.8 mL를 추가 합니다. OD600nm ~ 2 쿨, 무 균 2 %YPD 국물에서에서 사전 inoculum 문화 200 μ와 각 플라스 크 예방 24 h에 대 한 250 rpm에서 일정 한 동요와 30 ° C에서 그들을 품 어.
참고: 잠복기 24 h 보다 높은 경우에, 50 mL 원뿔형 플라스 크 및 고압에 적합 한 문화 미디어의 12 mL를 추가 합니다. 그들의 사전 inoculum 500 μ와 예방. 그것은 또한 일 성장 컨트롤 (YP 미디어 1%, 2% 또는 10% 포도 당) 및 호흡기 성장 컨트롤 (YP 미디어 2% 글리세롤 또는 에탄올)을 고려 하는 것이 중요. - 흔들린된 원뿔 플라스 크 문화 100 μ 걸릴 하 고 900 μ 1 mL 분 광 광도 계 베트에 증류수에 희석 pipetting으로 부드럽게 혼합. 600에서 OD를 측정 nm 마다 2 h 분 광 광도 계를 사용 하 여. 진짜 세를, 10에 의해 결과 곱하면 됩니다.
4. 데이터 처리 및 운동 매개 변수 계산
-
통계 패키지 소프트웨어에서 새 프로젝트 파일을 만듭니다. "새 테이블및 그래프" 섹션에서 "XY" 옵션을 선택 합니다.
- 옵션 선택: "예제 데이터" 섹션에서 "빈 데이터 테이블로 시작" .
- "포인트 및 연결선" 그래프 유형을 선택 합니다. "X" 섹션 "복제 또는 오류 값에 대 한 Subcolumns"의 세그먼트에서 선택 하지 않은 상태로 두고 "Y" 섹션 옵션을 선택: "나란히 subcolumns에서 (10) 복제 값을 입력 하 고 작의 의미 및 오류 SD". 만들기를 클릭 합니다.
참고: 테이블 형식 X 열 및 여러 Y 열, 각각 이전 선택 10 subcolumns 있다.
- 쓰기는 OD에 측정 X 열에서 찍은 시간 (예를 들어, 0, 30, 60, 90 분 또는 0, 1, 1.5, 2 h). Y 열에서 문화에서 가져온 OD 값을 작성 합니다.
- 로그 Y 열 데이터를 변환 하는 지 수 성장 단계를 식별 합니다. "분석" 버튼을 클릭, 선택 "변환" 분석, Y를 사용 하 여 Y 값 선택 = Log(Y). "결과의 갤러리", 선택 "변환" 데이터 테이블 "분석" 버튼을 클릭 하 고 "선형 회귀" 분석을 선택 이동 합니다. 선형 동작을 따르지 않는 OD 값을 제외 합니다. 값을 제외 하려면 데이터 테이블에 그들을 선택 하 고 "Ctrl + E"를입력 합니다.
참고: 그것은 이후 지 수 성장 방정식 잘 지 수 단계에 맞는 지 수 단계를 수행 하지 값을 제외 하는 것이 중요. - "데이터 테이블 갤러리"데이터 테이블 선택 "데이터 1". "분석" 버튼을 클릭 하 고 "XY 분석" 가운데 "비선형 회귀 (곡선 적합도)" 분석을 선택 합니다.
- 분석 하 고 "확인" 버튼을 클릭 하 여 데이터 집합을 선택 합니다. "맞춤" 탭에서 "지 수 방정식" 섹션을 선택 하 고 선택 "지 수 성장 방정식" ( X 는 세포 농도, X0 는 0에, μ 셀 농도 특정 성장 속도 이며 t 는 시간). 피팅 방법으로 "최소 제곱 적합" 사용 하 고 보간 섹션 선택 되지 않은 둡니다. "확인" 버튼을 클릭 합니다.
참고: 비선형 맞는 결과 탭 "결과의 갤러리"입니다. 소프트웨어 두 배로 시간 (Dt)와 특정 계산 성장 율 (μ). 소프트웨어는 결과 탭에 K 로 μ 를 표시합니다. - 새 프로젝트 파일을 열고 "새 테이블 및 그래프" 섹션에서 열 선택을 선택 합니다. "빈 데이터 테이블로 시작" 옵션을 선택 하 고 원하는 그래프를 선택 합니다. Sd. "만들기" 버튼을 선택와 의미를 선택 합니다.
- "결과의 갤러리" 에 있는 비선형 맞는 결과 탭에서 μ 또는 Dt 값을 복사 하는 열에 붙여 넣을. 마지막으로, "분석" 버튼을 선택 하 고 다른 nutrimental 조건의 운동 매개 변수를 비교 하는 "열 분석" 섹션에 원하는 분석을 선택 합니다.
참고: 운동 매개 변수 일 성장 컨트롤 (YP 미디어 1%, 2% 또는 10% 포도 당)에서 얻은 고 호흡기 성장 컨트롤 (YP 미디어 2% 글리세롤 또는 에탄올) 발효 및 미토 콘 드리 아 호흡의 임계값을 설정 하는 데 도움이 각각. 비교는 운동 영양 상태와 물질/화합물 호흡과 발효 성장 분석에서 매개 변수는 호흡 또는 발효 대사에 가능한 영향을 식별할.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
성장 곡선 예비 호흡과 발효 효 모 S. cerevisiae 에서 고기를 구분을 사용할 수 있습니다. 따라서, 우리 일 성장을 유도에 보고 된 다른 포도 당 농도 배치 문화 S. cerevisiae (BY4742)의 수행: 1%, 2% 및 10% (w/v)9. 문화 일 형을 보여주는 작은 지연 위상 있고 높은 성장 율 (그림 1)와 지 수 단계. 에탄올, 글리세롤, 및 젖 산 염은 호흡; 통해서만 metabolized 수 탄소 소스 따라서, 우리는 그 탄소 소스를 사용 하 여 효 문화를 수행. 주로 산화 인 산화에 의해 에너지를 얻는 문화 더 긴 래그 단계 및 성장 단계에서 지 수 (그림 2)의 느린 속도 보였다.
성장 곡선의 분석 제공만 질적 정보; 따라서, 그것은 양적 정보를 얻기 위해 운동 매개 변수를 계산 하는 것이 중요입니다. 우리는 Dt 와 μ 지 수 성장 방정식 (그림 3)를 사용 하 여 계산. 우리 Dt ≥11.5 h와 μ ≤0.059 호흡기 성장 값에 대 한 임계값 설정 / h. Dt ≤6.5 h와 μ ≥0.149에서 일 성장에 대 한 임계값 설정 / h (그림 3).
이 검사 도구의 유용성을 증명 하기 위해 우리는 S. cerevisiae BY4742 셀에 다른 에너지 상태 (그림 4)에 다른 레 스 베라 트롤 (RSV) 농도의 효과 평가 하기 위한 첫 번째 3 실험을 설계 동요 플라스 크입니다. 두 번째 실험 S. cerevisiae BY4742의 에너지 대사에 다른 황산 암모늄 (NH4+) 농도의 영향을 검출 하는 목적으로 (그림 5)는 미 판에. 마지막으로, 세 번째 탄소 소스 변경 내용을 두 개의 서로 다른에 일 성장에 미치는 영향을 설명 하기 위한 S. cerevisiae 긴장 (W303 및 WLP530 맥주 발효에 사용 하는 산업) (그림 6). RSV를 사용 하 여 실험에 셀 에너지 상태는 포도 당 농도 변화 하 여 수정 되었습니다. 10% 포도 당, 모든 RSV 농도 테스트 효 respiro 발효 단계를 변경 하지 않은 하지만 호흡 단계를 감소 않았다 (diauxic shift 동안 S. cerevisiae 대사에 의해 지 수 단계 생산 하는 에탄올 산화 인 산화)입니다. Μ 값 확인 모든 조건 테스트, S. cerevisiae 2% 글리세롤 (호흡 제어로 사용 조건)에 성장 하는 때 그것의 표현 형에 반대 일 행동을 보여주었다 (그림 4a). 셀 1% 포도 당만을 격려 했다, μ 값 확인는 0.1, 1, 10, 및 100 µ M RSV, respiro 발효 단계에서 일 행동은 영향을 받지 않습니다. 그러나, diauxic 변화 하는 동안 호흡 단계에 있는 감소는 관찰 되었다. 또한, 1000 µ M의 농도에서 RSV 세포의 성장을 완전히 억제.
두 번째 실험에서 세포는 10% 포도 당 농도에 크랩 트리 효과 유발 하기에 충분 한 고려와 함께 보충 되었다 S. cerevisiae. 따라서, 우리는 뉴 햄프셔4+ 발효 대사에 다양 한 농도의 보충에 의해 추진 효과 관찰 수 있습니다. Dt 값 제안 그 0.13, 0.66, 1.99% NH4+ 호의 발효 대사, 그리고 그것은 관찰 될 수 있다 성장 곡선에 이러한 농도 문화 지 수 단계 확장. 그럼에도 불구 하 고, 3.31% mM NH4+, Dt 가치에 있는 증가이 농도 respiro 발효 대사 유도 보였다. 이 형 지 수 단계 (그림 5)에서 성장 곡선 및 느린 성장 속도에 확장된 지연 단계를 보였다.
세 번째 실험 두 개의 서로 다른 세포에서에서 S. cerevisiae 긴장 (W303 및 WLP530) 자당 또는 Dt 값에 탄소 소스의 효과 테스트를 갈 락 토스의 다른 농도에서 성장 했다 변형에 따라 다릅니다. 발효 제어로 두 종자 2% 포도에서 성장 했다 그리고 일 성장에 대 한 임계값을 설정 하려면 Dt 값 계산 했다. 일 Dt 값 긴장 했다, ≤3.25 W303 스트레인 및 ≤6.84는 WLP530에 대 한 h h와 스트레인. 따라서, 그것은 사용 하는 다른 긴장에 대 한 Dt 임계값 유효성 검사에 대 한 필요성을 강조 하는 것이 중요. 또한, 자당 탄소 소스로 사용 되었다 때 모두 긴장에서 10%와 2% 일 형 관찰 되었다. 그러나, 갈 락 토스를 사용 하면 스트레인 W303에서는 테스트, WLP530 긴장 2% 갈 락 토스에 발효 표현 형을 보였다 동안 농도에서 발효 동작을 표시 하지 않았습니다. 흥미롭게도, W303 긴장 두 탄소 소스 테스트의 모든 농도에서 성장 했다. 하지만, WLP530 긴장 탄소 사용 (0.01%)의 낮은 농도에서 성장을 보여주지 않았다. 이 WLP530 맥주 산업에서 사용 되는 노출은 탄소 농도 일반적으로 훨씬 더 높은 (그림 6) 때문에 있을 수 있습니다.
모두,이 세 가지 실험에서 데이터 성장 곡선 및 운동 매개 변수는 S. cerevisiae에 호흡과 발효 성장 사이 예비 차별 하는 데 유용 증명. 또한, 에너지 물질 대사 연구의 다양 한 측면에서 사용할 수 있는 다양 한 도구 임을 강조 하기 위해 중요 하다.
그림 1: S. cerevisiae 성장 형에 다른 포도 당 농도의 효과. 성장 곡선 600에서 광학 밀도 측정 하 여 건설 되었다 nm 48 h에 대 한 모든 30 분. S. cerevisiae 세포 발효 문화 했다 짧은 지연 위상 및 빠른 성장 율 지 수 단계. Respiro 발효 단계 성장 감속 단계 (호흡 상), 발효에 의해 생산 하는 에탄올 산화 인 산화 통로 사용 하 여 대사는 다음 고정 단계에 도달 하면 뒤에 수 있습니다. 데이터는 평균 ± 표준 오류로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: S. cerevisiae 성장 형에 호흡 탄소 원의 효과. 성장 곡선 600에서 광학 밀도 측정 하 여 건설 되었다 nm S. cerevisiae 의 48 헤 셀 마다 30 분 장기 지연 위상 및 느린 성장 율 지 수 단계 그리고 일반적으로 diauxic 변화를 보여주지 않았다. 데이터는 평균 ± 표준 오류로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 탄소 소스와 S. cerevisiae 운동 매개 변수에의 집중의 효과. 의 다른 탄소 소스; 아래 S. cerevisiae BY4742 성장 (는) Dt 값 S. cerevisiae BY4742 성장 다양 한 탄소 소스의 다른 농도에서 (b) μ 값입니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. 통계 분석 Dunnett의 테스트 뒤 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 수행 했다 (*p < 2% 포도 당 대 0.01). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 다른 셀 에너지 상태에 resveratrol 보충의 효과. 10% 포도 당;를 사용 하 여 (a) 성장 표현 형 및 μ 값 (b) 성장 표현 형 및 μ 값 1% 포도 당을 사용 하 여. 성장 곡선에서 데이터 평균 ± 표준 오류로 표시 됩니다 고 μ 값은 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. Μ 값에 대 한 통계 분석 Dunnett의 테스트 뒤 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 수행 되었다 [*p < 2% 글리세롤 (RC)과 0.01 vs. 호흡기 컨트롤]. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: S. cerevisiae 에너지 대사에 황산 암모늄 보충의 효과. 성장 곡선 600에서 광학 밀도 측정 하 여 건설 되었다 nm 48 헤에 대 한 모든 30 분 성장 곡선에서 데이터 평균 ± 표준 오차도 제공 됩니다 및 μ 값은 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. Dt 값에 대 한 통계 분석 Dunnett의 테스트 뒤 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 수행 되었다 [* p < 2% 글리세롤 (RC)과 0.01 vs. 호흡기 컨트롤]. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6:의 발효 물질 대사에 있는 갈 락 토스와 자당 농도의 효과 Saccharomyces cerevisiae. W303 실험실 긴장 및 (b) Dt 값 WLP530 산업 긴장에 대 한 (는) Dt 값입니다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. Dt 값에 대 한 통계 분석 Dunnett의 테스트 뒤 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 수행 되었다 [* p < 0.01 대 2% 포도 당 (발효 제어)]. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
오랜 시간 이후 J. Monod10 표현 세균성 문화의 성장 연구 미생물학의 기본 메서드는 통과 했다. 분자의 출현 지연 사용 및 연구 기법으로 성장 합니다. 수많은 상호 프로세스를 포함 하는 성장의 복잡성에도 불구 하 고 그것의 근본적인 메커니즘 수학적 모델11을 사용 하 여 설명할 수 있습니다. 이것은 가장 복잡 한 분자 메커니즘12명료 하 상호 보완적인 도구로 사용할 수 있는 강력한 접근입니다.
이 방법에서 신뢰할 수 있는 결과 얻으려면, 그것은 다음 중요 한 단계를 고려 하는 것이 중요입니다. 250 rpm 동요 호흡기 성장, 교 반 속도 (150-180 rpm) 우리가 관찰 호흡기 조건에서 성장 감소 낮은 사용 하는 경우 때문에 발휘 하는 낮은 탄소 소스에서 좋은 성장을 달성 하는 데 매우 중요 하다. 신선한 소재를 사용 하는 프로토콜을 시작 하는 것이 중요 하다 고도 분석 실험에서 균일 한 표현 형을 유지 하기 위해 필수적 이다. 성장 속도 임계값 긴장 사이에서 변화 하 고는 분석에 사용 되는 조건에 따라 유효성을 검사 해야 합니다. 때문에 지 수 성장 방정식은 이미 사전 로드; GraphPad Prism 소프트웨어 제안 그러나, 다른 소프트웨어 프로그래밍 지 수 성장 방정식의 수 제공, 적당 하다. 미 판, 것이 좋습니다 inoculum 없이 성장 매체의 150 μ와 3 개의 우물을 포함-microplate 웰 스 오염 당한 경우를 나타내는 컨트롤입니다.
그것은 선형 눈금에 OD 데이터 플로팅 수 있습니다 그것을 로그 성장 단계를 결정 하기 위해 하드를 나타냅니다 해야 합니다. 지연 위상 및 로그 성장 명확 하 게 표시 되도록 로그 눈금의 OD 데이터를 그려서이 문제를 극복할 수 있습니다.
이 프로토콜은 발효와 미토 콘 드리 아 호흡에 특정 효과 확인 해야 합니다 그래서 표현 형, 화면에 사용 됩니다. 발효 에탄올9, 글리세롤, 호박, 아세테이트 등 부산물의 축적에 의해 결정 될 수 있다 하는 동안 산소 소비 분석 실험13,14, 미토 콘 드리 아 호흡의 부 량 권장 .
S. cerevisiae 성장 했다 분자 메커니즘을 이해 하기 위한 수단으로 고 고기, 심사에서 테스트 하는 방법에 있는. 분석 실험 문학에서 많은 실험적인 디자인에서 효 모 성장 질적 매개 변수 (예: 접시 희석 또는 성장 곡선) 으로만 사용 하는 그럼에도 불구 하 고, 그래서 이러한 기술의 고용 귀중 한 증거를 무시 한다. 예를 들어 산소 미생물 인구를 계산 또는 직렬 희석을 만들기 위해 사용 하는 한 천 배지에서 사용할 수 제한, 호흡기 조건 하에서 성장 측정을 복잡 하 게 됩니다. 게다가, 두 개 이상의 셀 남아 서로 연결 된 하나의 식민지 관찰 됩니다. 또 다른 한계는 성장, 미묘한 차이 대 한 사실을 제쳐두고 수에 차이 강조 하기 위해 시각적 결과적으로 성장 곡선의 사용 이다. 따라서, 양적 매개 변수를 성장 정보 번역 발휘 표현 형에 대 한 정확한 데이터의 성과 허용 한다. 그럼에도 불구 하 고, 성장의 수학적 표현을 복잡 한 과학 기업입니다. 대부분의 연구 검토 한 환경 조건을 제공 하는 상위 다항식 방정식을 얻는 미생물의 전체 성장 (지연, 로그, 및 고정 단계). 상대적 단순 선형 회귀 하 여이 방정식의 계수를 계산할 때에 불구 하 고 고유한 생물 학적 의미15에 할당 하기가 어렵습니다. 성장 단계를 구분 하 여 성장의 분석은 수학적으로 안정적이 고 간단 합니다. 이 예는 1 차 속도에 따라 잘 짧은 지연 위상 및 지 수 단계에 맞는 지 수 성장 방정식입니다.
마지막으로, 지 수 성장 방정식을 사용 하 여 로그 단계를 공부 하 고 특정 화합물 또는 환경에 미토 콘 드리 아 호흡 또는 발효 작용의 영향을 이해 하는 일관 된 방법입니다. 개념의 증거로 서 지 수 단계에 성장의 정량화 RSV는 특히 호흡기 성장13,14영향을 설명 했다. 여기, 성장 역임 식별에 유용한 도구 RIM15 삭제 가능성이 S. cerevisiae9호흡 능력의 부분적인 억제 하 여 발효 대사를 향상 시킵니다. 이러한 데이터 확증 발효와 호흡 물질 대사 연구에 대 한 수 있습니다 성장 관찰을 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 따라서,이 방법은 미토 콘 드리 아 호흡 또는 발효에 특정 물질의 효과 차단 할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 프로젝트를 지원 하 여 부여 Consejo 나시오날 드 많은 y 과학 (보조금 번호 293940)와 Fundación TELMEX TELCEL (보조금 번호 162005585)의 IKOM를 둘 다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
- Parrella, E., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease. Methods. 46 (4), 256-262 (2008).
- Rosas Lemus, M., et al. The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
- Xu, X. D., et al. Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism. Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).
- De Deken, R. H. The Crabtree effect: a regulatory system in yeast. Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).
- Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).
- Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction? Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).
- Keating, E., Martel, F. Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism. Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).
- Pfeiffer, T., Morley, A. An evolutionary perspective on the Crabtree effect. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).
- Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).
- Cui, S., Xu, S. Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation. Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).
- Benzekry, S., et al. Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth. Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).
- Ramos-Gomez, M., et al. Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).
- Madrigal-Perez, L. A., et al. Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).
