Summary
Her presenterer vi en protokoll for å beregne respiratory og fermentative metabolismen av passende Saccharomyces cerevisiae eksponensiell vekst i eksponensiell vekst formelen. Beregning av kinetic parametere tillater screening av påvirkninger av stoffer/forbindelser på gjæring eller mitokondrie åndedrett.
Abstract
Saccharomyces cerevisiae celler i eksponentiell fase opprettholde sin vekst ved å produsere ATP gjennom gjæring og/eller mitokondrie åndedrett. Fermentable karbon konsentrasjonen styrer hovedsakelig hvordan gjærceller generere ATP; dermed stasjoner variasjonen i fermentable karbohydrater nivåer energisk metabolismen av S. cerevisiae. Dette dokumentet beskriver en høy gjennomstrømming metode basert på eksponentiell gjær vekst å beregne effekten av konsentrasjon endringer og natur karbon kilden på respiratory og fermentative metabolisme. Veksten av S. cerevisiae er målt i en microplate eller ristet konisk kolbe ved å bestemme optisk densitet (OD) på 600 nm. Deretter er en vekstkurve bygget av inntegningsrekkefølgen OD versus tid, som kan identifisere og velge den eksponentielle fasen, og er utstyrt med eksponentiell vekst ligningen som oppnå kinetic parametere. Lav bestemt vekstrater med høyere dobling ganger representerer vanligvis en åndedretts vekst. Derimot vise høyere bestemt vekstrater med lavere dobling ganger fermentative vekst. Terskelverdier for dobling tid og spesifikk vekstrate er beregnet ved hjelp av kjente luftveis- eller fermentative forhold, som ikke-fermentable karbon kilder eller høyere konsentrasjoner av fermentable sukker. Dette oppnås for hver bestemt stamme. Til slutt er beregnet kinetic parameterne sammenlignet med terskelverdier å etablere om gjær viser fermentative og/eller åndedretts vekst. Fordelen med denne metoden er sin relative enkelhet for å forstå virkningene av et stoff/sammensatt på fermentative eller respirasjonssykdommer metabolisme. Det er viktig å understreke at veksten er en intrikate og komplekse biologisk prosess; Derfor må foreløpige data fra denne metoden være bekreftet av kvantifisering av oksygenforbruk og akkumulering av gjæring biprodukter. Dermed, kan denne teknikken bli brukt som en foreløpig screening forbindelser/stoffer som kan forstyrre eller øke fermentative eller respirasjonssykdommer stoffskifte.
Introduction
Saccharomyces cerevisiae veksten har vært et verdifullt verktøy for å identifisere dusinvis av fysiologiske og molekylære mekanismer. Vekst måles av tre metoder: føljetong fortynninger for spot testing, colony-forming enhet teller og vekst kurver. Disse teknikkene kan brukes alene eller i kombinasjon med en rekke underlag, miljøforhold, mutanter og kjemikalier for å undersøke bestemte svar eller fenotyper.
Mitokondrielt åndedrett er en biologisk prosess der vekst kinetics har vært anvendt for å oppdage ukjent mekanismer. I dette tilfellet kosttilskudd vekst medier med ikke-fermentable karbon kilder som glyserol, laktat eller etanol (som metaboliseres utelukkende av mitokondrie åndedrett), som eneste karbon og energi kilde for å vurdere den åndedretts vekst, som er viktig å oppdage forstyrrelser i oxidative fosforylering aktivitet1. På den annen side, er det komplisert å bruke vekst kinetic modeller for å tyde mekanismene bak gjæring.
Studiet av gjæring og mitokondrie åndedrett er viktig å belyse molekylære mekanismer bak visse fenotyper som Crabtree og Warburg effekter2,3. Crabtree effekten er preget av en økning av glycolytic forandring, undertrykkelse av mitokondrie åndedrett, og etableringen av gjæring som den primære sti å generere ATP i nærvær av høye konsentrasjoner av fermentable karbohydrater (> 0,8 mM)4,5. Warburg effekten er metabolically analog til Crabtree effekten, med forskjellen at i pattedyrceller, hovedproduktet av gjæring er laktat6. Faktisk er Warburg effekten utstilt ved en rekke kreftceller, utløser glukose opptak og forbruk selv i nærvær av oksygen7. Dermed har studere molekylære grunnlaget for overgangen fra åndedrett til gjæring i Crabtree effekten både bioteknologisk konsekvenser (for etanolproduksjon) og mulige konsekvenser i kreftforskning.
S. cerevisiae vekst kan være et egnet verktøy for å studere virkningene Crabtree og Warburg. Denne ideen er basert på det faktum at i gjær eksponentiell fase, sentrale veier brukt til å produsere ATP er mitokondrie åndedrett og gjæring, som er avgjørende for å opprettholde vekst. For eksempel er veksten av S. cerevisiae nært knyttet til funksjonen av ATP-generering. S. cerevisiae, mitokondrie åndedrett produserer ca 18 ATP molekylene per glukose molekylet, mens gjæring bare genererer 2 ATP molekylene, er derav det forventet at veksten har tette forbindelser med metabolske veier produsere ATP8. I denne forbindelse når gjæringen er den viktigste ruten å generere ATP, kompenserer gjær for lite ATP produksjonen ved å øke hastigheten av glukose opptak. Tvert imot, er glukose forbruket gjærceller bruke mitokondrie åndedrett som hovedkilden ATP lav. Dette indikerer at det er viktig for gjær følelse karbohydrater tilgjengelighet før du bestemmer hvordan ATP skal genereres. Derfor glukose tilgjengelighet spiller en viktig rolle i Bytt mellom gjæring og mitokondrie respirasjon i S. cerevisiae. I nærvær av høye mengder glukose foretrekker gjær fermentering som sentrale ruten å generere ATP. Interessant, når gjær er gjæring, beholdes den spesifikk vekstraten på maksimumsnivå. På den annen side, under lave nivåer av glukose produserer S. cerevisiae ATP ved hjelp mitokondrie åndedrett, opprettholde lavere vekstrater. Dermed indusere variasjon i konsentrasjon av glukose og bruk av andre karbon kilder endringer i gjær og preferanse mellom fermentative og luftveier. Ved å ta hensyn til dette faktum med eksponentiell vekst ligningen, kan man få biologiske betydningen av kinetic parametre som dobling tid (Dt) og spesifikk vekstrate (μ). For eksempel ble lavere μ verdier funnet under gjær bruker mitokondrie åndedrett som den primære stien. Tvert imot, under forhold som favoriserer gjæring, ble høyere µ verdier funnet. Denne metoden kan brukes til å måle sannsynlig mekanismer for noen kjemikalier påvirker gjæring og mitokondrie åndedrett i S. cerevisiae.
Målet med denne utredningen er å foreslå en metode basert på vekst kinetics for screening effekten av en gitt stoffet/sammensatt på mitokondrie åndedrett eller gjæring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kultur medier og Inoculum forberedelser
- Forberede 100 mL 2% gjær ekstrakt-pepton-druesukker (YPD) flytende medium (legge 1 g av gjær ekstra, kasein pepton 2 g og 2 g av glukose til 100 mL destillert vann). Dispensere 3 mL media i 15 mL sterilisert konisk rør. Autoclave media i 15 min 121 ° C og 1,5 psi.
Merk: Mediene kan lagres i opptil en måned på 4-8 ° C. - Vaksinere et konisk rør fylt med 3 mL kule sterilt 2% YPD buljong med 250 μL S. cerevisiae celler i glyserol på 20 ° C. Ruge over natten i en orbital shaker på 30 ° C med agitering på 200 rpm.
- Strek en Petriskål (60 x 15 mm2) fylt med sterilt 2% YPD agar (legge 10 g gjær ekstra, 20 g kasein pepton 20 g glukose, og 20 g bakteriologiske agar til 1000 mL destillert vann) med celler dyrket i konisk røret med en bakteriefri loop. Inkuber Petriskål på 30 ° C til isolerte koloniene viser vekst.
- Forberede den pre inoculum av vaksinere enkelt isolert kolonien i en konisk rør fylt med 10 mL av kule sterilt 2% YPD kjøttkraft og ruge det overnatting på 30 ° C med kontinuerlig agitering på 200 rpm.
2. kultur medier og vekst kurver i Microplate
- Forberede 10 mL 1% YPD kjøttkraft (Legg til 0,1 g gjær ekstra, 0.2 g pepton og 0,1 g av glukose til 10 mL destillert vann), 10 mL av 2% YPD kjøttkraft (Legg til 0,1 g gjær ekstra, 0.2 g pepton og 0.2 g glukose til 10 mL destillert vann) , og 10 mL 10% YPD kjøttkraft (Legg til 0,1 g gjær ekstra, 0.2 g pepton og 1 g av glukose til 10 mL destillert vann). Autoclave disse wspomagaczy i 15 min 121 ° C og 1,5 psi.
Merk: Kultur media fungerer som en kontroll med fermentative vekst. - Forberede 10 mL av 2% gjær ekstrakt-pepton-etanol (YPE) kjøttkraft og 10 mL av 2% gjær ekstrakt-pepton-glyserol (YPG) kjøttkraft. 2% YPE: legge til 0,1 g gjær ekstrakt, 0.2 g pepton og 0,2 mL etanol 10 mL destillert vann. 2% YPG: legge til 0,1 g gjær ekstrakt, 0.2 g pepton og 0,2 mL glyserol til 10 mL destillert vann. Autoclave disse wspomagaczy i 15 min 121 ° C og 1,5 psi.
Merk: Glyserol og etanol er ikke-fermentable karbon kilder som metaboliseres utelukkende av mitokondrie åndedrett. Derfor brukes de som en åndedretts vekst kontroller. I dette trinnet kan type og konsentrasjonen av karbon kilde i kultur media endres for å teste effekten på veksten fenotypen med gjær ekstrakt-pepton (YP) kjøttkraft (10 g gjærekstrakt og 20 g kasein pepton i 1000 mL destillert vann) som base. For å teste effekten av andre næringsstoffer i tillegg karbon, er syntetiske komplett (SC) medium supplert etter målet av eksperimentet. SC medium er 1,8 g av gjær nitrogen base uten aminosyrer, 5 g av ammonium sulfate [(NH4)2SO4], 1,4 g monosodium fosfat (NaH2PO4), og 2 g frafallet bland i 1000 mL destillert vann. Supplere media med karbon kilde og ekstra nitrogen kilde i de nødvendige konsentrasjonene. - Legg 145 μL egnet kultur medier for eksperimentell design hver brønn av et sterilt microplate (10 x 10-vel) med lokk og vaksinere dem med 5 μL før inoculum.
Merk: Hvis målet er å skjermen påvirker stoffer/stoffer energisk metabolismen av gjær, at stoffet/sammensatte bør legges i dette trinnet. Alle typer microplate med lokk bør også være nyttig. - Inkuber flere godt platen i en microplate leser på 30 ° C med konstant agitering på 200 rpm for 48 h. mål optisk densitet (OD) på 600 nm hvert 30 eller 60 min.
Merk: Hvis microplate leseren ikke har muligheten til å ruge på microplate, kan det være ruges i en orbital shaker på samme forhold mellom hver måling av OD.
3. vekst kurver i ristet konisk flasker
- Legge til 4,8 mL passer kultur media 20 mL konisk kolber og autoclave. Vaksinere hver flasken 200 μL av pre inoculum kultur på OD600nm ~ 2 i kule, sterile 2% YPD buljong. Inkuber dem på 30 ° C med konstant agitasjon på 250 rpm for 24 timer.
Merk: Hvis inkubasjonstiden er høyere enn 24 h, legge 12 mL passer kultur media 50 mL konisk flasker og autoclave. Vaksinere dem med 500 μL før inoculum. Det er også viktig å vurdere fermentative vekst kontrollene (YP media med 1% og 2% 10% glukose) og respiratoriske vekst kontroller (YP media med 2% glyserol eller etanol). - Ta 100 μL ristet konisk kolbe kulturen og fortynne den i 900 μL destillert vann i 1 mL spektrofotometer søppel, og bland forsiktig av pipettering. Måle OD på 600 nm bruker et spektrofotometer hver 2T. For å få ekte OD, multipliserer du resultatet med ti.
4. databehandling og kinetisk parametere beregning
-
Opprett en ny prosjektfil i statistikkpakke programvaren. I delen "ny tabell og graph", velg "XY" .
- Velg alternativet: «Start med en tom datatabell» i delen "Eksempeldata" .
- Velg "Poeng og koble linjen" grafen. La delen "X" ikke valgt i segmentet av "Subcolumns for gjentak eller feilverdier" og i "Y" delen Velg: "Angi (10) Repliker verdier i sidestilt subcolumns og plotte middelverdi og feil SD". Klikk Opprett-knappen.
Merk: Tabellformatet har en X-kolonne og flere Y kolonner, hver med 10 subcolumns valgt tidligere.
- Skrive tiden som OD målinger ble tatt i X-kolonnen (f.eks 0, 30, 60, 90 min eller 0, 1, 1.5, 2 h). I kolonnene Y skrive OD verdiene fra kulturer.
- Identifisere eksponentiell vekstfase transformere kolonnedata Y til logaritmer. Klikk "Analysere" , velger "Transform" analyse, Velg Y-verdier ved hjelp av Y = Log(Y). Gå til "Galleri resultater", velg "Transform" datatabellen, velger du knappen "Analysere" og velg "Lineær regresjon" analyse. Utelate OD verdiene som ikke følger en lineær atferd. Hvis du vil utelate verdiene, velger dem i tabellen og Skriv "Ctrl + E".
Merk: Det er viktig å Utelat verdier som ikke følger den eksponentielle fasen siden eksponentiell vekst ligningen passer godt med den eksponentielle fasen. - Merk datatabellen i "Datatabeller Galleri" "Data 1". Klikk knappen "Analysere" og velg "Lineær regresjon (kurve fit)" analyse blant "XY analysene".
- Velg datasettene analysere og klikk "OK" -knappen. I kategorien "Fit" velger du delen "Eksponentiell ligning" og "eksponentiell vekst ligning" (, der X er cellen konsentrasjon, X0 er cellen konsentrasjon på null tid, μ spesifikk vekstrate, og t er tid). Bruke "minste kvadraters" som en passende metode og la umerkede delen interpolere. Klikk på "OK" -knappen.
Merk: Kategorien med lineære passer resultatene er i "Galleri resultater". Programvaren beregner dobling tid (Dt) og spesifikk vekstrate (μ). Programvaren viser μ som K i kategorien resultater. - Åpner en ny prosjektfil, og velg kolonnen valget i delen "ny tabell og graph" . Velg "Start med en tom datatabell" og velg ønsket grafen. Velg tegne gjennomsnittet med SD. Velg " Opprett".
- Kopiere μ eller Dt verdier fra kategorien ikke-lineære passer resultater i "Galleri resultater" og lime dem inn i en kolonne. Til slutt Velg knappen "Analysere" og velg ønsket analyse i delen "Kolonnen analyser" sammenligne kinetic parametrene av forskjellige nutrimental.
Merk: Parameterne kinetic innhentet fra fermentative vekst kontrollene (YP media med 1% og 2% 10% glukose) og respiratoriske vekst kontroller (YP media med 2% glyserol eller etanol) bidrar til å etablere terskelen til fermentative og mitokondrie åndedrett, henholdsvis. Sammenligne den kinetiske parametere fra ernæringsmessige tilstand og stoff/sammensatte assayed med respiratory og fermentative veksten å identifisere mulig effekt på luftveiene eller fermentative metabolisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vekst kurver kan brukes å foreløpig forskjellsbehandle respiratory og fermentative fenotyper i S. cerevisiae gjær. Derfor vi utført satsvise kulturer av S. cerevisiae (BY4742) med ulike glukose konsentrasjoner som er rapportert å indusere fermentative vekst: 1% og 2% 10% (w/v)9. Kulturer viser en fermentative fenotypen har en liten lag fase og en eksponentiell fase med høy vekst (figur 1). Etanol, glyserol og laktat er karbon kilder som kan være metaboliseres bare gjennom åndedrett; Derfor utført vi kulturer av gjær bruker disse karbon kilder. Kulturer som får energi hovedsakelig av oxidative fosforylering viste en lengre lag fase og trege hastigheten av vekst i eksponentiell fasen (figur 2).
Analyse av vekst kurvene gir bare kvalitativ informasjon; Derfor er det viktig å beregne kinetic parameterne for å få kvantitativ informasjon. Vi beregnet Dt og μ ved hjelp av eksponensiell vekst formelen (Figur 3). Vi satt en terskel for åndedretts vekst verdier på Dt ≥11.5 h og μ ≤0.059 / t. Terskelen for fermentative vekst ble satt på Dt ≤6.5 h og μ ≥0.149 / h (Figur 3).
For å bevise nytten av screening verktøyet utviklet vi tre eksperimenter, med først for å vurdere effekten av ulike resveratrol (RSV) konsentrasjoner på S. cerevisiae BY4742 celler med forskjellige energisk status (Figur 4) i ristet flasker. Andre forsøket å påvise effekter av ulike ammonium sulfate (NH4+) konsentrasjoner på energi metabolismen av S. cerevisiae BY4742 (figur 5) i en microplate. Til slutt, tredje rettet å illustrere hvordan endringer i karbon kilde påvirker fermentative vekst i to forskjellige S. cerevisiae stammer (W303 og industrielle WLP530 brukes for øl gjæring) (figur 6). I eksperimentere med RSV, ble celle energisk status endret av varierende glukose konsentrasjon. 10% glukose, alle RSV konsentrasjoner testet ikke endre respiro-fermentative fasen av gjær men redusere respiratoriske fasen (under diauxic skiftet, S. cerevisiae metaboliseres etanol produsert i eksponentiell fasen av oxidative fosforylering). Μ verdiene bekreftet at under alle forhold testet, S. cerevisiae viste fermentative situasjonen, i motsetning til sin fenotypen når dyrket i 2% glyserol (stand brukt som en åndedretts) (figur 4a). Når celler var energi med 1% glukose bare bekreftet μ verdiene at på 0,1, 1, 10 og 100 µM RSV, fermentative atferd i respiro-fermentative fase ikke ble påvirket. Imidlertid ble en nedgang i luftveiene fase under diauxic skiftet observert. Videre i en konsentrasjon av 1000 µM hemmet RSV helt cellevekst.
I andre forsøket, celler ble supplert med 10% glukose, en konsentrasjon anses tilstrekkelig til å indusere Crabtree effekten i S. cerevisiae. Derfor kunne vi observere effekten fremmes av kosttilskudd av ulike konsentrasjoner av NH4+ i fermentative metabolisme. Dt verdier foreslo at 0,13 0,66 og 1,99% NH4+ tjeneste fermentative metabolisme, og det kan observeres i vekst kurvene at disse konsentrasjonene utvidet kulturen eksponentiell fase. Likevel, på 3.31% mM NH4+, en økning i Dt verdien viste at denne konsentrasjonen induserer en respiro-fermentative metabolisme. Denne fenotypen viste en utvidet lag fase i vekst kurver og lavere vekst i eksponentiell fase (figur 5).
I tredje forsøket, cellene i to forskjellige S. cerevisiae stammer (W303 og WLP530) ble dyrket i ulike konsentrasjoner av sukrose eller galaktose å teste om effektene av karbon på Dt verdier var belastning-avhengige. Som en fermentative, både stammer ble dyrket i 2% glukose og Dt verdier ble beregnet til å angi en grense for fermentative vekst. Den fermentative Dt verdier for stammene var annerledes, med ≤3.25 h for W303 belastning og ≤6.84 h for WLP530 belastning. Derfor er det viktig å understreke behovet for validering Dt terskelen for forskjellige stammene brukes. Videre, når sukrose ble brukt som karbon kilde, en fermentative fenotypen ble observert på 2% og 10% i begge stammer. Når galaktose ble brukt, viste belastningen W303 men ikke fermentative oppførsel i noen av konsentrasjonene testet, mens WLP530 belastningen viste en fermentative fenotypen på 2% galaktose. Interessant, vokste W303 belastningen i alle konsentrasjoner av både karbon kilder testet. Men viser WLP530 belastningen ikke vekst på laveste konsentrasjonen av karbon brukes (0,01%). Dette kan skyldes at WLP530 brukes i øl industrien og karbondioksid konsentrasjoner som det er utsatt er generelt mye høyere (figur 6).
Sammen bevise data fra disse tre eksperimentene at veksten kurver og kinetisk parametere er nyttig for foreløpige diskriminering mellom respiratory og fermentative vekst i S. cerevisiae. Også er det viktig å understreke at dette er et allsidig verktøy som kan brukes i ulike aspekter av metabolismen energiforskning.
Figur 1: Effekten av ulike glukose konsentrasjoner på S. cerevisiae vekst fenotypen. Vekst kurver ble bygget ved å måle optisk densitet ved 600 nm enhver 30 min 48 h. Når S. cerevisiae celler gjære, kulturer viste en kort lag fase og rask vekst i eksponentiell fasen. Respiro-fermentative fasen kan bli etterfulgt av en vekst retardasjon fase (åndedretts fase), der etanol produsert av gjæring er metabolized bruker oxidative fosforylering veien, så den stasjonære fasen er nådd. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± standardfeilen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Effekten av respirabelt karbon kilder på S. cerevisiae vekst fenotypen. Vekst kurver ble bygget ved å måle optisk densitet ved 600 nm enhver 30 min for 48 h. celler av S. cerevisiae viste en langvarig lag fase og langsom vekst i eksponentiell fasen og generelt ikke viser en diauxic endring. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± standardfeilen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Effekten av karbon kilde og konsentrasjonen på S. cerevisiae kinetic parametere. (en) Dt verdier S. cerevisiae BY4742 vekst under forskjellige karbon kilder; (b) μ verdier S. cerevisiae BY4742 vekst under ulike konsentrasjoner av forskjellige karbon kilder. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± standardavviket. Statistiske analyser ble utført med en enveis ANOVA etterfulgt av en Dunnett test (*p < 0,01 vs 2% glukose). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: effekten av resveratrol kosttilskudd på ulike celle energi statuser. (en) vekst fenotypen og μ verdier ved hjelp av 10% glukose; (b) vekst fenotypen og μ verdier ved hjelp av 1% glukose. Data fra vekst kurver presenteres som gjennomsnittlig ± standardfeilen og μ verdier presenteres som gjennomsnittlig ± standardavviket. Statistiske analyser for μ verdier ble utført med en enveis ANOVA etterfulgt av en Dunnett test [*p < 0,01 vs. åndedretts kontroll med 2% glyserol (RC)]. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Effekten av ammonium sulfate tilskudd på S. cerevisiae energi metabolism. Vekst kurver ble bygget ved å måle optisk densitet ved 600 nm enhver 30 min for 48 h. Data fra vekst kurver presenteres som gjennomsnittlig ± standardfeilen og μ verdier presenteres som gjennomsnittlig ± standardavviket. Statistiske analyser for Dt verdier ble utført med en enveis ANOVA etterfulgt av en Dunnett test [* p < 0,01 vs. åndedretts kontroll med 2% glyserol (RC)]. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: effekten av galaktose og sukrose konsentrasjon i fermentative metabolismen av Saccharomyces cerevisiae. (en) Dt verdier for W303 lab belastning og (b) Dt verdiene for WLP530 industrielle belastningen. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± standardavviket. Statistiske analyser for Dt verdier ble utført med en enveis ANOVA etterfulgt av en Dunnett test [* p < 0,01 vs 2% glukose (fermentative control)]. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lang tid har gått siden J. Monod10 uttrykt at studiet av veksten av bakteriekulturer er den grunnleggende metoden for mikrobiologi. Ankomsten av molekylære verktøy forsinker forbruket og studie av vekst som en teknikk. Til tross for kompleksiteten i vekst som involverer mange beslektede prosesser, kan dens underliggende mekanismer beskrives ved hjelp av matematiske modeller11. Dette er en robust tilnærming som kan brukes som et supplerende verktøy for å belyse de mest intrikate molekylære mekanismer12.
For å få pålitelige resultater fra denne metoden, er det viktig å vurdere kritisk følgende. Omrøring på 250 rpm er avgjørende for å oppnå god vekst i lav karbon kilder at luftveiene vekst, siden når du bruker lavere omrøring hastigheten (150-180 rpm) observerte vi redusert vekst i åndedrettsproblemer. Det er viktig å starte protokollen ansette en fersk lager, og det er også viktig å opprettholde en jevn fenotypen i analyser. Vekst kinetics terskelverdier varierer mellom stammer og må valideres i henhold til vilkår i analyser. GraphPad-prisme programvaren foreslått fordi eksponentiell vekst ligningen er allerede forhåndslastet; men er noen annen programvare egnet, forutsatt kan programmering av eksponensiell vekst ligningen. Microplate, er det anbefalt å ta tre brønner med 150 μL av veksten medier uten inoculum-dette er en kontroll som viser hvis microplate brønnene har lidd forurensning.
Det er viktig å angi at plotting OD data på en lineær skala kan gjøre det vanskelig å finne ut i logaritmisk vekstfase. Dette problemet kan løses ved å plotte OD data i log skala slik at lag fase og logaritmisk vekstfase er synlig.
Denne protokollen brukes bare til skjermen en fenotype, så bestemte effekter på gjæring og mitokondrie åndedrett må bekreftes. Vi anbefaler kvantifisering av mitokondrie åndedrett av oksygen inntak analyser13,14, mens gjæring kan bestemmes av akkumulering av biprodukter som acetate, succinate, glyserol og etanol9 .
S. cerevisiae vekst har tjent som et middel for å forstå molekylære mekanismer og fenotyper, metoder fra screening for å teste søk. Likevel, mange eksperimentell design i litteraturen bruke gjær vekst som en kvalitativ parameter (f.eks plate fortynninger eller vekst kurver), slik at bruken av disse teknikkene forsømmer verdifulle bevis. For eksempel er oksygen tilgjengelig i agar platene brukes for telling mikrobiell befolkningen eller gjør føljetong-fortynninger begrenset, kompliserer vekst måling under åndedrettsproblemer. Dessuten, når to eller flere celler er knyttet til hverandre, bare en koloni er observert. En annen begrensning er bruken av veksten kurver resultatet visuelle å utheve forskjellene i vekst, som kan føre til side fakta om subtile forskjeller. Derfor tillater oversettelsen av vekst informasjon til kvantitative parametere oppnåelse av nøyaktige data om utøvet fenotypen. Likevel er matematiske representasjon av vekst en komplisert vitenskapelig virksomhet. De fleste studier undersøke full vekst (lag, logg og stasjonære faser) av mikroorganismer, få høye polynom ligninger som kun tjener en miljøtilstand. Til tross for relativt enkle ved koeffisientene til disse ligninger av lineær regresjon, er det vanskelig å tilordne dem til en iboende biologisk betydning15. Analyse av vekst ved å skille vekstfaser er matematisk pålitelige og enkle. Et eksempel på dette er eksponentiell vekst ligningen, som er basert på første orden kinetics og passer godt med en kort lag fase og eksponentiell fase.
Endelig, studerer Logg fasen med eksponentiell vekst ligningen er en konsistent måte å forstå innflytelsen av mitokondrie åndedrett eller gjæring på en bestemt sammensatte eller miljø. Som et bevis på konseptet vist kvantifisering av vekst i eksponentiell fase at RSV spesielt påvirker åndedretts vekst13,14. Her tjenestegjorde vekst som et verdifullt verktøy for å identifisere at RIM15 sletting sannsynlig forbedrer fermentative metabolisme av delvis hemming av åndedrett kapasiteten i S. cerevisiae9. Disse dataene bekrefte at observere vekst tillater for studier av fermentative og respiratoriske metabolisms og er en enkel og pålitelig metode. Derfor gir denne tilnærmingen screening effekten av et bestemt stoff på mitokondrie åndedrett eller gjæring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet av tilskudd av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (bevilgning nummer 293940) og Fundación TELMEX-TELCEL (bevilgning nummer 162005585), både til IKOM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | 4353 | For inoculum incubation or conical fask cultures |
| Bioscreen | Growth curves | C MBR | For batch cultures in microplates |
| Glucose | Sigma | G7021 | For YPD broth preparation |
| Peptone from casein, enzymatic digest | Sigma | 82303 | For YPD broth preparation |
| Yeast extract | Sigma | 09182-1KG-F | For YPD broth preparation |
| Bacteriological Agar | Sigma | A5306 | For YPD agar preparation |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | For SC broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | For SC broth preparation |
| Yeast nitrogen base without amino acids and ammonium sulfate | Sigma | Y1251 | For SC broth preparation |
| Yeast synthetic drop-Out medium supplements | Sigma | Y1501 | For SC broth preparation |
| Ammonium sulfate granular | J.T. Baker | 0792-R | For medium supplementation example |
| Resveratrol | Sigma | R5010 | For medium supplementation example |
| Galactose | Sigma | G8270 | For medium supplementation example |
| Sucrose | Sigma | S7903 | For medium supplementation example |
| Absolut ethanol | Merck | 107017 | For medium supplementation example |
| Glycerol | J.T. Baker | 2136-01 | For medium supplementation example |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | For data analysis | |
| Honeycomb microplates | Thermo Scientific | 9502550 | For microplate cultures |
References
- Parrella, E., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae to study mitochondrial dysfunction and disease. Methods. 46 (4), 256-262 (2008).
- Rosas Lemus, M., et al. The role of glycolysis-derived hexose phosphates in the induction of the Crabtree effect. Journal of Biological Chemistry. , (2018).
- Xu, X. D., et al. Warburg effect or reverse Warburg effect? A review of cancer metabolism. Oncology Research and Treatment. 38 (3), 117-122 (2015).
- De Deken, R. H. The Crabtree effect: a regulatory system in yeast. Journal of General Microbiology. 44 (2), 149-156 (1966).
- Hagman, A., Sall, T., Piskur, J. Analysis of the yeast short-term Crabtree effect and its origin. The FEBS Journal. 281 (21), 4805-4814 (2014).
- Hammad, N., Rosas-Lemus, M., Uribe-Carvajal, S., Rigoulet, M., Devin, A. The Crabtree and Warburg effects: Do metabolite-induced regulations participate in their induction? Biochim Biophys Acta. 1857 (8), 1139-1146 (2016).
- Keating, E., Martel, F. Antimetabolic Effects of Polyphenols in Breast Cancer Cells: Focus on Glucose Uptake and Metabolism. Frontiers in Nutrition. 5, 25 (2018).
- Pfeiffer, T., Morley, A. An evolutionary perspective on the Crabtree effect. Frontiers in Molecular Biosciences. 1, 17 (2014).
- Olivares-Marin, I. K., et al. Interactions between carbon and nitrogen sources depend on RIM15 and determine fermentative or respiratory growth in Saccharomyces cerevisiae. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (10), 4535-4548 (2018).
- Monod, J. The growth of bacterial cultures. Annual Review of Microbiology. 3 (1), 371-394 (1949).
- Cui, S., Xu, S. Analysis of mathematical models for the growth of tumors with time delays in cell proliferation. Journal of Mathematical Analysis and Applications. 336 (1), 523-541 (2007).
- Benzekry, S., et al. Classical mathematical models for description and prediction of experimental tumor growth. Public Library of Science Computational Biology. 10 (8), e1003800 (2014).
- Ramos-Gomez, M., et al. Resveratrol induces mitochondrial dysfunction and decreases chronological life span of Saccharomyces cerevisiae in a glucose-dependent manner. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 241-251 (2017).
- Madrigal-Perez, L. A., et al. Energy-dependent effects of resveratrol in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 33 (6), 227-234 (2016).
- Peleg, M., Corradini, M. G. Microbial growth curves: what the models tell us and what they cannot. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 51 (10), 917-945 (2011).
