Summary
Герпеса индеек (HVT) широко используется как платформа вектор для поколения рекомбинатных вакцин против ряда болезней птиц. Эта статья описывает простой и быстрый подход для создания рекомбинантных вакцин представлена векторная HVT, используя интегрированный NHEJ-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и Cre-Lox системы.
Abstract
Герпеса индеек (HVT) является идеальным вирусный вектор для поколения рекомбинатных вакцин против ряда болезней птиц, таких как птичий грипп (AI), ньюкаслской болезни (ND) и инфекционные заболевания bursal (IBD), с помощью бактериальных искусственных хромосом ( BAC) мутагенеза или обычных рекомбинации методы. Кластеризованный регулярно interspaced рецидивирующий повторяется (ТРИФОСФАТЫ) / Cas9 система успешно используется во многих параметров для гена редактирования, включая манипуляции нескольких крупных ДНК вируса геномов. Мы разработали быстрого и эффективного ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной генома редактирования трубопровода для создания рекомбинантных HVT. Чтобы максимизировать потенциал использования этого метода, мы представляем здесь подробную информацию о методологии создания рекомбинантных HVT, выражая VP2 белок IBDV. VP2 выражение кассета вставляется в HVT генома через NHEJ (nonhomologous конце присоединения)-зависимых ремонт пути. Кассетный выражение протеина (ГПУП) Зеленая Флуоресценция сначала прикрепляется к вставка для легкой визуализации и затем удаляются через Cre-LoxP системы. Этот подход обеспечивает эффективный способ представить других вирусных антигенов в геном HVT для быстрой разработки рекомбинантных вакцин.
Introduction
Болезни Марека (MD) является Лимфопролиферативные заболевания кур, вызванных серотип 1 (Gallid герпеса 2 [GAHV-2]) род Mardivirus в подсемейство Альфагерпесвирусы. Mardivirus также включает в себя два непатогенных серотипов: серотипа 2 (GaHV-3) и серотипа 3 (MeHV-1, исторически известен как HVT) которые используются в качестве вакцины против MD. Живая вакцина HVT (FC-126 штамм)-это первое поколение MD вакцины, используемых в начале 1970-х и до сих пор используется широко в двухвалентное и поливалентных вакцин для обеспечения расширенной защиты от MD. HVT также широко используется как вектор вакцины побудить защиту от ряда болезней птиц из-за его универсальность и безопасность как в ovo и подкожной инкубатора администрации и способности предоставлять пожизненный иммунитет. Стратегия создания рекомбинантных вакцин HVT основе либо обычных гомологичная рекомбинация инфицированные вирусом клетки, перекрывающиеся cosmid ННО или BAC мутагенеза2. Однако эти методы, как правило, длительный и трудоемкий, требующий строительство передачи векторов, поддержание вирусного генома в Escherichia coli, доска очищения, удаления BAC последовательности и выбор маркер от редактируемого вирусов3,4.
ТРИФОСФАТЫ/связанные (Cas9) является наиболее популярные ген инструмент редактирования в последние годы благодаря своей универсальности и специфичности. ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система успешно используется в эффективное создание генетически модифицированных клеток и Животные модели5,6,,78,9,10, как также как и манипуляции нескольких крупных ДНК вируса геномов11,12,13,14,,1516,17, 18,19,20. После представления простой и эффективный метод, с помощью системы ТРИФОСФАТЫ/Cas9 для редактирования HVT генома21, мы разработали трубопровод для быстрого и эффективного поколения рекомбинантного HVT22.
Для того, чтобы расширить возможности применения этого метода, мы описываем подробная методология для поколения рекомбинантные вакцины HVT, выражая VP2 гена IBDV в локусе UL45/46, в настоящем докладе. Этот подход сочетает в себе NHEJ-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 для вставки VP2 гена с меткой Репортер ген GFP и Cre-LoxP системы для последующего удаления кассеты выражение гена GFP. По сравнению с традиционными рекомбинации и BAC recombineering методы, мы продемонстрировать, что NHEJ-ТРИФОСФАТЫ/Cas9 вместе с КРР-Lox системы является быстрый и эффективный подход к генерации рекомбинантом HVT.
Protocol
1. Подготовка Cas9/gRNA выражения и доноров конструкции
-
Строительство Cas9/gRNA выражение плазмиды
- Дизайн gRNA последовательность ориентации intergenic область между UL45 и UL46 генов HVT, как описано ранее22. Выравнивание гид РНК последовательности против HVT генома, чтобы исключить любые потенциальные пробить последовательности в геноме HVT. Синтезировать и клонировать последовательности gRNA, ориентированные на UL45/46 региона и sg-A последовательность из опубликованных данных23 в pX459-V2, как описано ранее22. Проверьте последовательность клонированных gRNA Сэнгером виртуализации с помощью U6-передний грунт24.
-
Строительство доноров плазмиды
- Для создания доноров плазмида, содержащий выражение кассеты с VP2, отмеченных съемной кассеты репортер GFP, Дизайн oligos доноров-F и доноров-R, содержащие следующие элементы (рис. 1A и Рисунок 3A): sg-A последовательности целевых объектов на концах, Голд сайт, окруженный с двух LoxP последовательностей для GFP репортер кассеты клонирования и иссечения и два ГИФКУ сайты для клонирования VP2 выражение кассеты.
- Клонировать последовательности в pGEM-T-легко вектор и, затем, клонировать кассеты гена GFP и VP2 в результирующий вектор для создания плазмида доноров, как pGEM-sgA-GFP-VP222.
Примечание: Любой вектор клонирования может использоваться для построения доноров плазмиды.
-
Подготовка плазмида ДНК
- Подготовьте доноров плазмиды и Cas9/gRNA выражение плазмида ДНК с помощью коммерческих комплект экстракции ДНК согласно инструкциям производителя.
2. ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной забивные: Transfection и инфекции
- За день до трансфекции, подготовиться трансфекции/инфекции, используя 10 - дневных эмбрионов в среде M199 дополнена плода бычьим сывороточным (ФБС) 5%, 10% tryptose фосфат бульон, пенициллин 100 ед/мл стрептомицином, куриных эмбрионов фибробластов (CEFs) и fungizone 0,25 мкг/мл. Семя 1.3 x 106 клеток на колодец в каждой скважине 6-ну плиты в 2,5 мл среды.
Примечание: CEF клетки могут храниться в течение 3 d при 4 ° C. - Transfect клетки (подготовленные в шаг 2.1) CEF с 0,5 мкг UL45/46-gRNA, 0,5 мкг sg-a и 1 мкг pGEM-sgA-GFP-VP2, используя соответствующие трансфекции реагент согласно инструкциям производителя. Инкубируйте клетки для 12 h в инкубаторе (на 38,5 ° C с 5% CO2).
- 12 ч posttransfection Cas9/gRNA и доноров плазмид, разбавляют HVT вирус складе с M199 культуры среднего до 1 x 105 ОРП/мл. 130 мкл разбавленного вируса в каждой скважине transfected клеток и установить один из хорошо untransfected клеток как отрицательный контроль же количеством вируса. Инкубируйте инфицированных/transfected клеток для 3 d на 38,5 ° C с 5% CO2. Провести все процедуры, с помощью совместного кодекса практики (JCoPR) утверждена спонсоров.
3. уборка и очистка HVT рекомбинантных вируса
-
Сортировки активирован флуоресценции клеток
- Подготовьте два 96-луночных пластины, указывать ответы с 2 х 104 CEF клетки в хорошо день до сортировки.
- Trypsinize инфицированных transfected/CEFs 3 d postinfection. Аспирационная среднего от каждой скважины и промывать ячейки листа с фосфат амортизированное saline (PBS). Добавьте 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА (0.48 мм) для trypsinize клеток в инкубаторе 38,5 ° C приблизительно 5 минут.
- Ресуспензируйте и передачи клетки в 1,5 мл трубку microcentrifuge с 50 мкл FBS. Центрифуга на 200 x g за 5 мин.
- Ресуспензируйте клеток в 1 мл 1% раствора PBS FBS. Подсчет числа клеток с помощью Горяева и отрегулировать количество клеток до 1 x 106 клеток/мл.
Примечание: Клетки могут храниться на льду для 1-2 ч. - Передать полистирола, сортировка трубку через ее сетчатый фильтр крышки клетки. Сортировать отдельные ячейки, выражая GFP в 96-луночных пластины семенами с CEFs, с использованием клеток сортировщик согласно инструкции производителя. Инкубируйте сортировки клеток для 5 d на 38,5 ° C с 5% CO2.
Примечание: Один проход рекомбинантных вируса могут быть необходимы перед сортировки, если есть слишком много одной клетки экспрессия гена GFP и несколько GFP-позитивных бляшек в оригинальной хорошо.
-
Пассированый рекомбинантных вирусов
- Подготовка 6-ну пластины семенами с 1.3 x 106 клеток CEF хорошо день до прохождения. 5 d postsorting, проверить 96-луночных пластины под флуоресцентным микроскопом. Марк Уэллс, содержащий один налет GFP-положительных.
Примечание: Смотрите Рисунок 2A для представителя GFP-позитивных налета. - Trypsinize каждый GFP-положительных хорошо с 50 мкл трипсина ЭДТА на 3 мин, добавьте 50 мкл питательной среды, Ресуспензируйте и передачи ячеек в одну скважину 6-ну плиты с CEFs. Это будет первое поколение рекомбинантного HVT.
- Урожай первого поколения рекомбинатных вирусов 3 d позднее, заморозить вниз один флакон каждого в 1 мл замораживания среднего содержащие плода теленка 10% сыворотки (FCS), 10% диметилсульфоксида (ДМСО) и 80% питательной среды и хранения вирусов в жидком азоте.
Примечание: Время сбора урожая варьируется от 2-4 d в зависимости от суммы и распространения способности вируса. - Собирать 1 х 105 клеток каждого первого поколения вирусов, центрифуга их и удалить супернатант. Храните клетки при-20 ° C для экстракции ДНК.
- Подготовка 6-ну пластины семенами с 1.3 x 106 клеток CEF хорошо день до прохождения. 5 d postsorting, проверить 96-луночных пластины под флуоресцентным микроскопом. Марк Уэллс, содержащий один налет GFP-положительных.
-
Обнаружение геномной вставки полимеразной цепной реакции
- Для экстракции ДНК, оттаивания и Ресуспензируйте клетки гранулы из шага 3.2.4 с 50 мкл squishing буфера (10 мм трис-HCl [рН 8], 1 ЭДТА, 25 мм NaCl и 200 мкг/мл протеиназы K) и лизируйте образцы на 65 ° C для 30 мин и , затем, на 95 ° C в течение 2 минут, чтобы инактивировать K. протеиназы
- Выполните полимеразной цепной реакции (ПЦР) с 3' Джанкшен грунтовки (Таблица 1) с помощью 1 мкл образца ДНК. Для каждого образца, подготовить следующие реакции микс 20 мкл на льду: 2 x ПЦР Мастер микс (10 мкл), 10 мкм вверх по течению грунтовка (0.5 мкл), 10 мкм течению грунтовка (0.5 мкл), ДНК шаблон (в 1 мкл) и свободной от нуклеиназы вода (8 мкл). Программа усиления: 95 ° C на 2 мин; 95 ° C за 30 сек, 55 ° C за 30 s и 72 ° C для 40 s для 35 циклов; 72 ° C для 7 мин нагрузки 2 мкл усиление продукции одной скважиной гель агарозы 1% для электрофореза геля.
Примечание: Смотрите Рисунок 2A для представителя результат перекрестка 3' ПЦР.
4. иссечение флуоресцентные Репортер ген через Cre-lox системы
- Чтобы удалить гена GFP из рекомбинантных вирус, transfect 2 мкг Cre рекомбиназа выражение плазмида в пластину 6-ну указывать ответы с CEF клетки, с помощью трансфекции реагент после инструкции производителя.
- 12 h posttransfection, размораживание 1 флакон рекомбинантных вируса из жидкого азота, нежно ресуспензируйте, семян 50 мкл в каждой скважине transfected клеток и задать один колодец как отрицательный контроль с тем же количеством вируса. Инкубируйте 3 d на 38,5 ° C с 5% CO2.
5. доска очистки
-
Сортировки активирован флуоресценции клеток
- Семя два 96-луночных пластины с 2 х 104 CEF клетки в хорошо день до сортировки.
- Выполните процедуры, описанные в шаг 3.1 72 h postinfection (из шага 4) подготовить инфицированных клеток для сортировки. Сортировка одного nonfluorescence клетки в 96-луночных пластины семенами с CEFs.
-
Пассированый рекомбинантных вирусов и PCR подтверждения
- Выберите 5-10 одной nonfluorescence 5 d postsorting, trypsinize их с 50 мкл трипсина ЭДТА на 38,5 ° C в течение 3 мин и добавьте 50 мкл культуры средних Ресуспензируйте клетки.
Примечание: Смотрите Рисунок 2B для табличкой представитель GFP-отрицательные. - Передайте половина клеток в каждой скважине 6-ну плиты указывать ответы с CEFs в качестве второго поколения.
- Центрифуга оставшиеся ячейки каждого клона на 200 x g 5 минут, удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 50 мкл squishing буфер для экстракции ДНК.
- Выполняйте ПЦР с 5' Джанкшен грунтовки (Таблица 1) с помощью 1 мкл ДНК шаблона с же условие реакции PCR, как описано в пункте 3.3.2.
Примечание: Смотрите Рисунок 2B для представителя результат 5' Джанкшен ПЦР. - На основании результатов ПЦР, выберите три-пять положительных клонов рекомбинантных HVT дальнейшие ходы и проверки.
- Выберите 5-10 одной nonfluorescence 5 d postsorting, trypsinize их с 50 мкл трипсина ЭДТА на 38,5 ° C в течение 3 мин и добавьте 50 мкл культуры средних Ресуспензируйте клетки.
6. контроль рекомбинантный HVT
-
Непрямой иммунофлюоресценции пробирного
- Заразить CEFs второго поколения рекомбинантного полученные HVT из шага 5.2 в пластине 24-ну семенами с 2.5 x 105 CEFs за день до инфекции. Удалить ячейку культуры среднего 48 h postinfection и 500 мкл параформальдегида 4% в PBS исправить клетки. Инкубировать пластины при комнатной температуре за 30 мин, затем снимите фиксатор и вымыть клетки слоя 3 x с PBS.
Примечание: Клетки могут храниться при температуре 4 ° C на этот шаг в течение нескольких недель. - Удаление PBS и 500 мкл 0,1% тритон X-100 для разрушения клеток для 15 минут вымыть клетки слоя 3 x с PBS.
- Блок неспецифического связывания, добавив блокирующий буфер (5% бычьим сывороточным в PBS) за 1 ч.
- Разбавить основного антитела анти VP2 моноклональных антител HH7 - или HVT-инфицированных курица сыворотки при 1: 200 в блокирующем буфере, 200 мкл в колодец и инкубации при комнатной температуре за 1 ч. вымыть клетки слоя 3 x с PBS.
- Разбавить вторичное антитело коза анти мыши IgG Alexa 568 или Коза анти курица Alexa 488 IgG в 1: 200 в блокирующем буфере, 200 мкл в колодец, инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч и вымыть клетки 3 x с PBS. Проверка выражения протеина под флуоресцентным микроскопом.
Примечание: Смотрите Рисунок 4 для представителя VP2 пятнать результат.
- Заразить CEFs второго поколения рекомбинантного полученные HVT из шага 5.2 в пластине 24-ну семенами с 2.5 x 105 CEFs за день до инфекции. Удалить ячейку культуры среднего 48 h postinfection и 500 мкл параформальдегида 4% в PBS исправить клетки. Инкубировать пластины при комнатной температуре за 30 мин, затем снимите фиксатор и вымыть клетки слоя 3 x с PBS.
-
Секвенирование гена VP2
- Усилить последовательности ДНК, охватывающих UL45 UL46 intergenic регионе и с высокой точностью ДНК-полимеразы и праймеры UL45-F1 и UL46-R1 (Таблица 1) для обнаружения весь вставки.
- Приготовить следующую смесь реакции 50 мкл: 5 мкл 10 x Pfx реакции микс, 1,5 мкл 10 мкм вверх по течению и течению грунтовка микс, 1 мкл 10 мм dNTP смеси, 1 мкл 50 мм MgSO4, 1 мкл шаблона дна и 0,5 мкл Pfx ДНК полимеразы и добавьте 50 мкл нуклеиназы свободной воды. Программа усиления: 95 ° C на 2 мин; 95 ° C 15 s, 55 ° C за 30 s и 68 ° C 3 мин для 35 циклов. Загрузите все ПЦР продукта гель агарозы 1% для электрофореза геля.
- Очищайте продукт PCR после инструкция набор ДНК гель для очистки. Отправьте 10 мкл продукта PCR (30 нг/мкл) виртуализации компании для подтверждения забивные VP2 гена.
7. стабильность рекомбинантных вируса
- Семя 2.6 x 106 клеток CEF в каждой T25 колбу за день до расширения вирус.
- Размораживание по меньшей мере три положительных клонов из шага 5.2; Добавьте один флакон клеток/вирусов в каждой T25 колбу. Инкубируйте на 38,5 ° C с 5% CO2 до 50% цитопатического эффекта наблюдается.
- Урожай клетки в 2 мл питательной среды; заразить 50 мкл на новый флакон T25 указывать ответы с CEF клетки для следующего поколения. Держите пассированый рекомбинантных вирус для по крайней мере 15 поколений. Анализируйте каждое поколение вирусов методом ПЦР на наличие VP2 последовательности и непрямой иммунофлюоресценции assay (IFA) для VP2 выражение для оценки стабильности рекомбинантных вирусов.
Representative Results
Стратегия, используемая для генерирования рекомбинантом HVT изложена в Рисунок 1, который включает как плазмида доноров — построены (рис. 1А) и процедуры для создания рекомбинантных HVT (рис. 1Б ). Пяти до тридцати GFP-позитивных бляшек, окруженный одичал тип бляшки можно наблюдать в ген стучать в скважины под флуоресцентным микроскопом 3 d posttransfection и - инфекции. Очищенный вирус, полученные после одну ячейку Сортировка (рисA) был проанализирован 3' Джанкшен PCR, который показывает продукт PCR ожидаемого размера (рис. 2А, Нижняя панель). После иссечения GFP репортер, КРР рекомбиназа свыше 50% металлических пластинк потеряли их экспрессия гена GFP. Очищенный налета после иссечения GFP (рис. 2B) на одну ячейку сортировку далее было подтверждено 5' Джанкшен PCR, который показывает продукта PCR право размера (рис. 2B, Нижняя панель). Рисунок 3 показывает результаты секвенирования оба перехода продуктов ПЦР с различными цветными элементами. На рисунке 4выражение протеина был подтвержден ИФА с VP2-специфических моноклональных антител и анти HVT курица сыворотки. Как и ожидалось, клеток, инфицированных родителей HVT может только быть запятнана анти HVT сыворотки (зеленый), хотя рекомбинантных HVT-инфицированные клетки ясно показали экспрессии гена VP2 (красный).
Рисунок 1: стратегия для поколения рекомбинантные вакцины представлена векторная HVT. (A) Эта группа показывает схематическое представление клонирования стратегии доноров плазмидные конструкции. Основные элементы включают два Cas9 целевых сайтов (СЕО) для освобождения вставки, репортер GFP кассету с LoxP последовательностей для обрезания GFP и VP2 выражение кассеты. (B) Эта группа показывает обзор двухэтапный гена стук в стратегии. Вставить фрагмент GFP и кассет выражение VP2 выпущенное Cas9/sgA расщепления и вставляется в геноме HVT в UL45/46 локусов через NHEJ-ТРИФОСФАТЫ/Cas9. GFP-инфицированных рекомбинантного вирус затем сортируются и очищенный сингл активированной флуоресценции клеток сортируя (FACS). Впоследствии Репортер ген GFP иссечена от Cre рекомбиназа и очищается и охарактеризовал рекомбинантный вирус. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Контроль рекомбинантный HVT. (A) группа показывает GFP-положительных налета (HVT-GFP-VP2), визуализированы под флуоресцентным микроскопом (Верхняя панель) и ПЦР проверки HVT-GFP-VP2 с грунтовки VP2-F & UL46-R1 на стыке 3'. ()B) Эта группа показывает налета (HVT-VP2) визуализирована после иссечения GFP HVT-GFP-VP2, используя рекомбиназа КРР и ПЦР проверка HVT-VP2 с праймерами UL45-F1 и VP2-R1 на стыке 5'. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Последовательный анализ рекомбинатных вируса HVT. (A) последовательности ключевых элементов различных цветов в этой панели HVT intergenic область между UL45/46 с gRNA последовательности подчеркнул и стрелка, указывающая на сайте расщепления Cas9, VP2 выражение кассету с концом последовательности в строчные курсивом, sg-A последовательности в красном с стрелка, указывающая на сайте расщепления Cas9, последовательность сайта LoxP в зеленых и две последовательности сайтов ГИФКУ синим цветом. (B) Эта группа показывает результаты секвенирования 5' и 3' развязок и схематическое представление HVT-VP2 с ключевыми элементами с соответствующими цветами, представленные в последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Характеристика рекомбинантных HVT-VP2. Эта панель показывает подтверждение успешного выражения VP2 в зараженных CEFs по непрямой иммунофлюоресценции анализа (ИФА) с анти VP2 моноклональных антител HH7 (красный). HVT инфекция подтверждена ИФА с HVT-инфицированных курица сыворотки (зеленый). В баре шкалы = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
ТРИФОСФАТЫ/Cas9 система стала ценным инструментом редактирования ген. Традиционные технологии рекомбинантной HVT вектор развития, таких как гомологичная рекомбинация13 и BAC мутагенеза технологии25, обычно включают в себя несколько раундов вектор клонирования и отбора, а также крупномасштабных скрининга, который может занять несколько месяцев. Протокол, описанный здесь с помощью NHEJ ТРИФОСФАТЫ/Cas9-на основе стратегии, в сочетании с системой Cre-Lox и одну ячейку Сортировка является более удобным, эффективным и быстрее подход в поколения рекомбинатных вакцин. Используя этот трубопровод, рекомбинантных вируса могут быть получены в течение только 1-2 недели24, и доска очистки шагов также может быть уменьшена до разделения один тур с помощью активированного флуоресценции клеток, сортировка17. Весь процесс, от gRNA строительство дизайн и доноров для получения очищенного рекомбинантных HVT вирус, может быть достигнуто в течение 1 месяца. Важнейших шагах для его успешной рекомбинантной HVT поколения включают в себя высокоэффективные gRNA выбор для ориентации вирусного генома для обеспечения эффективного расщепления для вставки иностранных гена, эффективность высокая трансфекции увеличить шанс для Cas9 / Оформления и вирус встретиться в ту же ячейку для редактирования и 12-часовой интервал между трансфекции доноров и gRNA плазмидов и вирусной инфекции Cas9 и gRNA выражаться на разумном уровне, прежде чем вирус проникает в клетки.
Ограничением для HVT рекомбинантного генерации является сложность определения GFP-положительных клоны стыком ПЦР. GFP-VP2 кассеты могут быть включены в любой ориентации. Перекрестка, ПЦР описал здесь является только для идентификации вставки в смысле ориентации. В случае вставки в антисмысловых ориентации ПЦР, используя праймер пар описал не будет работать, и внутренние грунтовки может местами для этой цели. Еще одна потенциальная проблема является, что конструкция доноров может использоваться только для вставки одного гена в тот же вирус из-за существования оставшихся LoxP последовательности после удаления GFP лечения КРР. Конструкцию новым доноров с вариантом LoxP последовательность может использоваться для нескольких целей вставки.
Два пути для ремонта двуцепочечные разрывы (DSBs) созданный Cas926,27NHEJ и HDR (ориентированные на гомологии ремонт). NHEJ является более эффективным, как это происходит на протяжении клеточного цикла28, в то время как HDR является менее эффективным и происходит только во время S и G2 фазы6,29,30. Мы использовали более эффективный путь NHEJ ремонт здесь ввести чужеродных генов в указанных местоположениях. Хотя ремонт NHEJ может ввести indels, присоединившись к noncompatible или поврежденной ДНК заканчивается через гомологии независимые механистически гибкий процесс31,32 между рассеченного доноров последовательности и геномной ДНК, indels может произойти только на сайтах расщепления sgA, и кассеты иностранных экспрессии генов не влияет. Другим преимуществом этого подхода является NHEJ бесплатно от ограничения гомологии руку строительства, делая клонирования шаг очень прост. Это побуждает большой потенциал для применения NHEJ для вставки иностранных ген. Введение всеобщего gRNA целевого сайта на обоих заканчивается иностранных гена кассеты делает процесс более быстрым, как шаблон доноров может быть построена сразу, без необходимости для выбора конкретных gRNA. Костяк доноров плазмида, содержащие sgA целевые сайты, сайты LoxP и Голд и ГИФКУ сайты могут также совместно широко различных репортер генов, кассеты иностранных экспрессии генов и различных вирусных векторов, давая этот новый подход преимущество настройки.
Укрывательство HVT VP2 вставки был использован для описания протокола в этой рукописи; Однако такой же подход может использоваться для вставки более вирусных генов в различных местах геномной HVT генома с помощью gRNA ориентации желаемого соответствующей последовательности для развития многовалентных рекомбинантных вакцин HVT представлена векторная. Другие MDV штаммов, как SB-1 и CVI988, другие птичьего Герпесвирусы, включая вирус инфекционной ларинготрахеит и утка энтерит вирус, а также другие птичьего ДНК вирусов, таких как оспа вирусов и аденовирусы, также могут быть спроектированы с использованием тех же подход к разработке многовалентных рекомбинантных вакцин. Развитие новых многовалентных векторного вакцин, с использованием ТРИФОСФАТЫ/Cas9 системы платформы описанных здесь будет весьма полезно для птицеводческой промышленности для защиты от нескольких заболеваний птицы.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы благодарят за помощь с конфокальная томография Pippa Hawes. Этот проект был поддержан биотехнологии и биологических наук исследовательский совет (СИББН) предоставляет BBS/E/я/00007034 и BB/L014262/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M199 medium, Earle's Salts | Life technology | 11150059 | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | cell culture medium |
| Penicillin and Streptomycin | Life technology | 15140148 | antibiotics |
| Fungizone | Sigma | 1397-89-3 | antifunigal |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8782 | cell culture medium |
| HVT Fc126 strain | Avian Disease and Oncology Laboratory | wildtype HVT virus | |
| pX459-v2 | Addgene | Plasmid #62988 | Cas9 and gRNA expression vector |
| pGEM-T Easy Vector Systems | promega | A1360 | donor vector cloning |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | transformation |
| PacI | NEB | rR0547S | donor vector cloning |
| SfiI | NEB | R0123S | donor vector cloning |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | cloning |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | plasmid extraction |
| TransIT-X2 | Mirus | MIR 6004 | transfection |
| Cell Culture 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | cell culture |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7123 | junction PCR amplification |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Thermofisher | 11708021 | PCR amplification of full insert |
| Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | immunoflourescence staining |
| Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | immunoflourescence staining |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP5 LASAF | immunoflourescence |
| FACS cell sorter | BD biosciences | BD FACSAria | single cell sorting |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Santa cruz biotechnology | SC-281692 | cell fixation |
| Triton X-100 | GeneTex | GTX30960 | permeabilization |
References
- Witter, R. L., Solomon, J. J. Experimental infection of turkeys and chickens with a herpesvirus of turkeys (HVT). Avian Diseases. 16 (1), 34-44 (1972).
- Baigent, S. J., et al. Herpesvirus of turkey reconstituted from bacterial artificial chromosome clones induces protection against Marek's disease. Journal of General Virology. 87, Pt 4 769-776 (2006).
- Messerle, M., Crnkovic, I., Hammerschmidt, W., Ziegler, H., Koszinowski, U. H. Cloning and mutagenesis of a herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (26), 14759-14763 (1997).
- Zhao, Y., Nair, V. Mutagenesis of the repeat regions of herpesviruses cloned as bacterial artificial chromosomes. Methods in Molecular Biology. 634, 53-74 (2010).
- Ma, Y., et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Research. 24 (1), 122-125 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via. Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156 (4), 836-843 (2014).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature Biotechnology. 32 (6), 551-553 (2014).
- Zhang, Y., et al. CRISPR/Cas9 mediated chicken Stra8 gene knockout and inhibition of male germ cell differentiation. PLoS One. 12 (2), 0172207 (2017).
- Bi, Y., et al. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases. PLoS Pathogens. 10 (5), 1004090 (2014).
- Bierle, C. J., Anderholm, K. M., Wang, J. B., McVoy, M. A., Schleiss, M. R. Targeted mutagenesis of guinea pig cytomegalovirus using CRISPR/Cas9-mediated gene editing. Journal of Virology. 90 (15), 6989-6998 (2016).
- Suenaga, T., Kohyama, M., Hirayasu, K., Arase, H. Engineering large viral DNA genomes using the CRISPR-Cas9 system. Microbiology and Immunology. 58 (9), 513-522 (2014).
- Xu, A., et al. A simple and rapid approach to manipulate pseudorabies virus genome by CRISPR/Cas9 system. Biotechnology Letters. 37 (6), 1265-1272 (2015).
- Yuan, M., et al. Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system. Journal of Virology. 89 (9), 5176-5179 (2015).
- Yuen, K. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing of Epstein-Barr virus in human cells. Journal of General Virology. 96, Pt 3 626-636 (2015).
- Liang, X., et al. A CRISPR/Cas9 and Cre/Lox system-based express vaccine development strategy against re-emerging Pseudorabies virus. Scientific Reports. 6, 19176 (2016).
- Zou, Z., et al. Construction of a highly efficient CRISPR/Cas9-mediated duck enteritis virus-based vaccine against H5N1 avian influenza virus and duck Tembusu virus infection. Scientific Reports. 7 (1), 1478 (2017).
- Peng, Z., et al. Pseudorabies virus can escape from CRISPR-Cas9-mediated inhibition. Virus Research. 223, 197-205 (2016).
- Tang, Y. D., et al. Live attenuated pseudorabies virus developed using the CRISPR/Cas9 system. Virus Research. 225, 33-39 (2016).
- Yao, Y., Bassett, A., Nair, V. Targeted editing of avian herpesvirus vaccine vector using CRISPR/Cas9 nucleases. Journal of Vaccine and Technologies. 1, (2016).
- Tang, N., et al. A simple and rapid approach to develop recombinant avian herpesvirus vectored vaccines using CRISPR/Cas9 system. Vaccine. 36 (5), 716-722 (2018).
- He, X., et al. Knock-in of large reporter genes in human cells via. CRISPR/Cas9-induced homology-dependent and independent DNA repair. Nucleic Acids Research. 44 (9), 85 (2016).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Petherbridge, L., et al. Cloning of Gallid herpesvirus 3 (Marek's disease virus serotype-2) genome as infectious bacterial artificial chromosomes for analysis of viral gene functions. Journal of Virological Methods. 158 (1-2), 11-17 (2009).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (1), 7-18 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
