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Immunology and Infection

सृजन रिकॉमबिनेंट एवियन Herpesvirus वैक्टर with CRISPR/Cas9 जीन संपादन

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58193
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1The Pirbright Institute & UK-China Centre of Excellence for Research on Avian Diseases, 2Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Academy & UK-China Centre of Excellence for Research on Avian Diseases

Summary

तुर्की के Herpesvirus (HVT) व्यापक रूप से एवियन रोगों की एक संख्या के खिलाफ रिकॉमबिनेंट टीके की पीढ़ी के लिए एक वेक्टर मंच के रूप में प्रयोग किया जाता है । यह लेख एक एकीकृत NHEJ-CRISPR/Cas9 और Cre-लोक्स प्रणाली का उपयोग रिकॉमबिनेंट HVT-वैक्टर टीके की पीढ़ी के लिए एक सरल और तेजी से दृष्टिकोण का वर्णन करता है ।

Abstract

तुर्कियों के Herpesvirus (HVT) एक आदर्श वायरल वेक्टर रिकॉमबिनेंट टीके की एक संख्या के खिलाफ एवियन रोगों, एवियन इंफ्लूएंजा (ऐ), न्यूकैसल रोग (एन डी), और संक्रामक bursal रोग (आईबीडी), बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्र का उपयोग कर के खिलाफ की पीढ़ी के लिए है ( बीएसी) mutagenesis या पारंपरिक पुनर्संयोजन तरीकों । संकुल नियमित रूप से palindromic दोहराया (CRISPR)/Cas9 प्रणाली सफलतापूर्वक कई बड़े डीएनए वायरस जीनोम के हेरफेर सहित जीन संपादन के लिए कई सेटिंग्स में इस्तेमाल किया गया है । हम एक तेजी से और कुशल CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन पाइपलाइन रिकॉमबिनेंट HVT उत्पंन करने के लिए विकसित किया है । इस विधि के संभावित उपयोग को अधिकतम करने के लिए, हम यहां IBDV के VP2 प्रोटीन व्यक्त रिकॉमबिनेंट HVT पैदा करने की कार्यप्रणाली के बारे में विस्तृत जानकारी प्रस्तुत करते हैं । VP2 अभिव्यक्ति कैसेट HVT जीनोम में एक NHEJ (nonhomologous अंत में शामिल होने के)-निर्भर मरंमत मार्ग के माध्यम से डाला जाता है । एक ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) अभिव्यक्ति कैसेट पहले आसान दृश्य के लिए संमिलित करने के लिए संलग्न है और फिर Cre-LoxP प्रणाली के माध्यम से हटा दिया । यह दृष्टिकोण रिकॉमबिनेंट टीकों के तेजी से विकास के लिए HVT जीनोम में अंय वायरल एंटीजन शुरू करने के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता है ।

Introduction

ब्रांडों के रोग (MD) Herpesvirusके उपपरिवार में जीनस GAHV के सीरोटाइप 1 (Gallid Mardivirus 2 [Alphaherpesvirinae-2]) द्वारा प्रेरित मुर्गियों की एक lymphoproliferative बीमारी है । Mardivirus भी दो गैर रोगजनक serotypes: सीरोटाइप 2 (GaHV-3) और सीरोटाइप 3 (MeHV-1, ऐतिहासिक HVT के रूप में जाना जाता है) जो एमडी के खिलाफ टीके के रूप में इस्तेमाल किया जाता है शामिल हैं । लाइव HVT वैक्सीन (FC-१२६ तनाव) एमडी वैक्सीन की पहली पीढ़ी 1970 के दशक में इस्तेमाल किया है और अभी भी bivalent और polyvalent वैक्सीन योगों में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जा रहा है के लिए एमडी के खिलाफ एक बढ़ाया सुरक्षा प्रदान करते हैं । HVT भी व्यापक रूप से एक टीके के रूप में प्रयोग किया जाता है के लिए एवियन अपनी बहुमुखी प्रतिभा और दोनों ovo और चमड़े के नीचे मछली पालने का प्रशासन और क्षमता के लिए सुरक्षा के कारण रोगों के एक नंबर के खिलाफ सुरक्षा प्रेरित करने के लिए एक आजीवन उन्मुक्ति प्रदान करते हैं । रणनीति रिकॉमबिनेंट HVT टीके उत्पंन करने के लिए या तो वायरस में पारंपरिक मुताबिक़ पुनर्संयोजन पर आधारित है संक्रमित कोशिकाओं, अतिव्यापी cosmid DNAs, या बीएसी mutagenesis2। हालांकि, इन तरीकों आम तौर पर समय लेने वाली है और श्रम प्रधान, स्थानांतरण वैक्टर के निर्माण की आवश्यकता होती है, ई कोलाई, पट्टिका शुद्धिकरण में वायरल जीनोम के रखरखाव, और बीएसी अनुक्रम और चयन को हटाने संपादित वायरस3,4से मार्कर ।

CRISPR/एसोसिएटेड (Cas9) हाल के वर्षों में अपनी बहुमुखी प्रतिभा और विशिष्टता के कारण सबसे लोकप्रिय जीन संपादन उपकरण है । CRISPR/Cas9 प्रणाली सफलतापूर्वक आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं और पशु मॉडल के कुशल पीढ़ी में इस्तेमाल किया गया है5,6,7,8,9,10, के रूप में अच्छी तरह के रूप में कई बड़े डीएनए वायरस जीनोम के हेरफेर में11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20. HVT जीनोम21संपादित करने के लिए CRISPR/Cas9 प्रणाली का उपयोग कर एक सरल और कुशल विधि रिपोर्टिंग के बाद, हम रिकॉमबिनेंट HVT22की तेजी से और कुशल पीढ़ी के लिए एक पाइपलाइन विकसित की है ।

इस विधि के संभावित अनुप्रयोग का विस्तार करने के लिए, हम इस रिपोर्ट में UL45/46 लोकस पर IBDV के VP2 जीन व्यक्त रिकॉमबिनेंट HVT वैक्सीन की पीढ़ी के लिए विस्तृत कार्यप्रणाली का वर्णन करते हैं । दृष्टिकोण को जोड़ती है NHEJ-CRISPR/Cas9 डालने के लिए VP2 जीन के साथ टैग GFP रिपोर्टर जीन और एक Cre-LoxP प्रणाली को हटाने के लिए GFP अभिव्यक्ति कैसेट बाद में । पारंपरिक पुनर्संयोजन और बीएसी recombineering तकनीक की तुलना में, हम प्रदर्शित करते है कि NHEJ-CRISPR/Cas9 एक Cre-लोक्स प्रणाली के साथ एक तेजी से और कुशल दृष्टिकोण रिकॉमबिनेंट HVT वैक्सीन उत्पंन करने के लिए है ।

Protocol

1. Cas9/gRNA अभिव्यक्ति और दाता के निर्माण की तैयारी

  1. Cas9/gRNA अभिव्यक्ति plasmids का निर्माण
    1. UL45 और HVT के UL46 जीन के बीच intergenic क्षेत्र लक्ष्यीकरण एक gRNA अनुक्रम डिजाइन के रूप में पहले22वर्णित है । HVT जीनोम में किसी भी संभावित बंद लक्ष्य अनुक्रम बाहर शासन करने के लिए HVT जीनोम के खिलाफ गाइड-आरएनए लक्ष्य अनुक्रम संरेखित करें । संश्लेषित और gRNA अनुक्रम लक्ष्यीकरण UL45/46 क्षेत्र और एसजी-pX459-V2 में प्रकाशित डेटा23 से एक अनुक्रम पहले22वर्णित के रूप में । U6-Fwd प्राइमर24का उपयोग कर सैंज sequencing द्वारा क्लोन gRNA अनुक्रम सत्यापित करें ।
  2. दाता प्लाज्मिड का निर्माण
    1. एक दाता प्लाज्मिड VP2 अभिव्यक्ति एक हटाने योग्य GFP रिपोर्टर कैसेट, डिजाइन ओलिगोस्पर्मिया दाता-एफ और दाता-आर निंनलिखित तत्वों से युक्त के साथ टैग कैसेट युक्त उत्पंन करने के लिए (1 चित्रा और चित्रा 3ए): एक एसजी-एक दोनों सिरों पर लक्ष्य अनुक्रम, एक PacI साइट GFP रिपोर्टर कैसेट क्लोनिंग और उत्पाद शुल्क के लिए दो LoxP दृश्यों के साथ, और दो VP2 अभिव्यक्ति कैसेट की क्लोनिंग के लिए SfiI साइटों ।
    2. एक pGEM में अनुक्रम क्लोन-टी आसान सदिश और, फिर, GFP और VP2 जीन कैसेट के परिणामस्वरूप वेक्टर में दाता प्लाज्मिड pGEM-sgA-GFP-VP222के रूप में निर्दिष्ट उत्पंन करने के लिए क्लोन ।
      नोट: किसी भी क्लोनिंग वेक्टर दाता प्लाज्मिड के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. प्लाज्मिड डीएनए वडा
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर DNAs प्लाज्मिड दोनों दाता प्लाज्मिड और Cas9/gRNA अभिव्यक्ति तैयार करें ।

2. CRISPR/Cas9-मध्यस्थता में दस्तक: अभिकर्मक और संक्रमण

  1. अभिकर्मक से पहले दिन, अभिकर्मक/संक्रमण के लिए चिकी भ्रूण fibroblasts (CEFs) तैयार, M199 माध्यम में 10 दिन पुराने भ्रूण का उपयोग 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक, 10% tryptose फॉस्फेट शोरबा, १०० U/एमएल पेनिसिलिन-streptomycin, और ०.२५ µ g/मब fungizone. बीज १.३ x 106 मध्यम की मिलीलीटर में एक अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में 5 कोशिकाओं के प्रति ।
    नोट: CEF कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 डी के लिए रखा जा सकता है ।
  2. Transfect CEF cells (चरण २.१ में तैयार) के साथ ०.५ µ g of UL45/46-gRNA, ०.५ µ g of sg-A, and 1 µ g of pGEM-sgA-GFP-VP2 निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उपयुक्त अभिकर्मक एजेंट का उपयोग कर रहा है । एक मशीन में 12 घंटे के लिए (5% CO2के साथ ३८.५ ° c) में कोशिकाओं की मशीन ।
  3. Cas9/gRNA और दाता plasmids के 12 ज posttransfection HVT कल्चर मीडियम के साथ M199 virus स्टॉक को पतला कर 1 x 105 pfu/ transfected कोशिकाओं की एक अच्छी तरह से पतला वायरस के १३० µ एल जोड़ें और वायरस की एक ही मात्रा के साथ एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में untransfected कोशिकाओं की एक अच्छी तरह से सेट । 5% CO2के साथ ३८.५ ° c में 3 डी के लिए transfected/संक्रमित कोशिकाओं की मशीन । सभी प्रक्रियाओं का उपयोग कर संयुक् त कोड ऑफ प्रैक्टिस (JCoPR) funders द्वारा अनुमोदित ।

3. कटाई और HVT रिकॉमबिनेंट वायरस की शुद्धि

  1. प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग
    1. तैयार २ ९६-अच्छी तरह से छंटाई से पहले दिन के अनुसार 2 x 104 CEF कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त प्लेटें ।
    2. Trypsinize transfected/संक्रमित CEFs 3 घ postinfection. एक अच्छी तरह से मध्यम महाप्राण और फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ सेल शीट कुल्ला । लगभग 5 मिनट के लिए ३८.५ ° c मशीन में कक्षों को trypsinize करने के लिए ०.०५% trypsin-EDTA (०.४८ mM) की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    3. resuspend और FBS के ५० µ एल के साथ एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में कोशिकाओं स्थानांतरण । 5 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक ।
    4. 1% FBS के साथ पंजाब के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड । किसी hemocytometer का उपयोग करके कक्ष संख्याओं को गिनना और कक्षों की संख्या को 1 x 106 कक्षों/
      नोट: कोशिकाओं बर्फ पर 1-2 एच के लिए रखा जा सकता है ।
    5. अपने छलनी टोपी के माध्यम से एक polystyrene छंटाई ट्यूब के लिए कोशिकाओं स्थानांतरण । ९६ में GFP व्यक्त करने वाले एकल कक्षों को क्रमबद्ध करें-अच्छी तरह से प्लेटें निर्माता के निर्देश के अनुसार सेल सॉर्टर का उपयोग कर CEFs के साथ वरीयता प्राप्त. 5% सह2के साथ ३८.५ डिग्री सेल्सियस पर 5 डी के लिए क्रमबद्ध कोशिकाओं की मशीन ।
      नोट: रिकॉमबिनेंट वायरस का एक अंश छंटाई से पहले की जरूरत हो सकती है अगर वहां भी कई एकल GFP-अभिव्यक्ति कोशिकाओं और कुछ GFP-मूल अच्छी तरह से सकारात्मक सजीले टुकड़े हैं ।
  2. रिकॉमबिनेंट वायरस का Passaging
    1. 6-अच्छी तरह से तैयार प्लेटें १.३ x 106 के साथ वरीयता प्राप्त 5 दिन बीतने से पहले के प्रति CEF कोशिकाओं । 5 डी postsorting, ९६ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत अच्छी तरह से प्लेटों की जांच करें । एक एकल GFP-सकारात्मक पट्टिका युक्त कुओं को चिह्नित करें ।
      नोट: एक प्रतिनिधि GFP-सकारात्मक पट्टिका के लिए चित्रा 2ए देखें ।
    2. Trypsinize प्रत्येक GFP-सकारात्मक अच्छी तरह से ५० µ एल के साथ trypsin-EDTA के 3 मिनट के लिए, संस्कृति माध्यम के ५० µ एल जोड़ने के लिए, resuspend और एक अच्छी तरह से एक 6-अच्छी थाली के साथ CEFs में कोशिकाओं हस्तांतरण । यह रिकॉमबिनेंट HVT की पहली पीढ़ी होगी ।
    3. फसल रिकॉमबिनेंट वायरस की पहली पीढ़ी 3 डी बाद में, एक की एक शीशी नीचे फ्रीज के 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) युक्त मध्यम, 10% dimethyl sulfoxide (DMSO), और ८०% संस्कृति मध्यम, और तरल नाइट्रोजन में वायरस की दुकान के 1 मिलीलीटर में ।
      नोट: फसल के समय 2-4 डी से राशि और वायरस के प्रसार की क्षमता के आधार पर बदलता है ।
    4. प्रत्येक पहली पीढ़ी के वायरस के 1 x 105 कोशिकाओं लीजिए, उंहें केंद्रापसारक, और supernatant त्यागें । डीएनए निष्कर्षण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को स्टोर ।
  3. पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा जीनोमिक लन का पता लगाना
    1. डीएनए निष्कर्षण के लिए, और squishing बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल [पीएच 8], 1mM EDTA, 25 मिमी NaCl, और २०० µ जी/एमएल Proteinase कश्मीर) के ५० µ एल के साथ कदम 3.2.4 से सेल गोली resuspend और 30 मिनट के लिए ६५ ° c पर नमूने लाइसे और , फिर, Proteinase K को निष्क्रिय करने के लिए 2 मिनट के लिए ९५ ° c पर ।
    2. एक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) 3 ' जंक्शन प्राइमरों (तालिका 1) के साथ प्रदर्शन डीएनए नमूने के 1 µ एल का उपयोग कर । प्रत्येक नमूने के लिए, बर्फ पर निंनलिखित 20 µ एल रिएक्शन मिश्रण तैयार करें: 2x पीसीआर मास्टर मिश्रण (10 µ एल), 10 µ मीटर ऊपर प्राइमर (०.५ µ एल), 10 µ मीटर बहाव प्राइमर (०.५ µ एल), डीएनए टेंपलेट (1 µ एल), और nuclease-मुफ्त पानी (8 µ एल) । प्रवर्धन कार्यक्रम है: 2 मिनट के लिए ९५ ° c; 30 एस के लिए ९५ ° c, ५५ ° c 30 s के लिए, और ७२ ° c ३५ चक्र के लिए ४० s के लिए; ७२ ° c 7 min. Load के लिए 2 µ एल प्रवर्धन उत्पादों के 1% जेल ट्रो के लिए agarose जेल के लिए एक अच्छी तरह से ।
      नोट: 3 ' जंक्शन पीसीआर के एक प्रतिनिधि परिणाम के लिए चित्रा 2ए देखें ।

4. Cre-लोक्स प्रणाली के जरिए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन का उत्पाद

  1. रिकॉमबिनेंट वायरस से GFP जीन को दूर करने के लिए, transfect 2 µ जी Cre recombinase अभिव्यक्ति की 6-खैर थाली में प्लाज्मिड CEF कोशिकाओं के साथ बीज, निर्माता के निर्देश के बाद एक अभिकर्मक एजेंट का उपयोग कर ।
  2. 12 ज posttransfection, तरल नाइट्रोजन से रिकॉमबिनेंट वायरस की एक शीशी को फिर से स्थगित, बीज ५० µ एल transfected कोशिकाओं के प्रत्येक कुआं में, और एक अच्छी तरह से वायरस की एक ही राशि के साथ नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेट । 5% CO2के साथ ३८.५ ° c में पर 3 डी के लिए मशीन ।

5. पट्टिका शुद्धि

  1. प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग
    1. बीज २ ९६-अच्छी तरह से 2 x 104 CEF कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से दिन छंटाई से पहले के साथ प्लेटें ।
    2. सॉर्ट करने के लिए संक्रमित कक्षों को तैयार करने के लिए चरण ३.१ ७२ h postinfection (से चरण 4) में वर्णित कार्यविधियों का पालन करें । ९६-अच्छी तरह से CEFs के साथ वरीयता प्राप्त प्लेटों में एकल nonfluorescence कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें ।
  2. Passaging के रिकॉमबिनेंट वायरस और पीसीआर की पुष्टि
    1. चुनें 5-10 एकल nonfluorescence सजीले टुकड़े 5 डी postsorting, उंहें trypsinize के साथ ५० µ एल के trypsin-EDTA के लिए ३८.५ ° c पर 3 मिनट के लिए, और जोड़ने के ५० µ एल संस्कृति माध्यम के कोशिकाओं resuspend करने के लिए ।
      नोट: एक प्रतिनिधि GFP-नकारात्मक पट्टिका के लिए चित्रा 2बी देखें ।
    2. एक 6-अच्छी तरह से दूसरी पीढ़ी के रूप में CEFs के साथ बीज थाली के प्रत्येक कुआं में कोशिकाओं के आधे से गुजारें ।
    3. 5 मिनट के लिए २०० x g पर प्रत्येक क्लोन के शेष कोशिकाओं केंद्रापसारक, supernatant त्यागें, और ५० µ एल के साथ कोशिकाओं resuspend squishing बफर के डीएनए निष्कर्षण के लिए ।
    4. के साथ पीसीआर प्रदर्शन 5 ' जंक्शन प्राइमरों (तालिका 1) डीएनए टेम्पलेट के 1 µ l का उपयोग करते हुए एक ही पीसीआर प्रतिक्रिया हालत के रूप में चरण 3.3.2 में वर्णित.
      नोट: 5 ' जंक्शन पीसीआर के एक प्रतिनिधि परिणाम के लिए चित्रा 2बी देखें ।
    5. पीसीआर के नतीजों के आधार पर आगे बीतने और सत्यापन के लिए रिकॉमबिनेंट HVT के तीन से पांच पॉजिटिव क्लोन चुनें ।

6. रिकॉमबिनेंट HVT का सत्यापन

  1. अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख
    1. रिकॉमबिनेंट HVT की दूसरी पीढ़ी के साथ संक्रमित CEFs 24-खैर प्लेट में ५.२ कदम से प्राप्त २.५ x 105 के साथ बीज संक्रमण से पहले दिन CEFs । सेल कल्चर मीडियम ४८ h postinfection को निकालें और इन कोशिकाओं को ठीक करने के लिए पंजाब में 4% paraformaldehyde के ५०० µ l को जोड़ें । 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली मशीन और फिर, निर्धारण हटाने और पंजाबियों के साथ 3x सेल परत धो लो ।
      नोट: कई हफ्तों के लिए इस कदम पर कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
    2. पंजाबियों निकालें और ०.१% ट्राइटन एक्स-१०० के ५०० µ एल जोड़ने के लिए कोशिकाओं को permeabilize के लिए 15 मिनट. पंजाबियों के साथ सेल परत 3x धो लो ।
    3. 1 h के लिए ब्लॉकिंग बफ़र (पंजाब में 5% गोजातीय सीरम) जोड़कर विशिष्ट बाइंडिंग ब्लॉक करना ।
    4. पतला प्राथमिक एंटीबॉडी विरोधी VP2 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी HH7-या HVT-संक्रमित चिकन सीरम 1:200 पर बफर अवरुद्ध में, अच्छी तरह से प्रति २०० µ एल जोड़ने के लिए, और 1 h. पंजाब के साथ सेल परत 3x धो के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    5. माध्यमिक एंटीबॉडी बकरी विरोधी माउस आईजीजी alexa ५६८ या बकरी विरोधी चिकन आईजीजी alexa ४८८ 1:200 पर बफर अवरुद्ध में पतला, ठीक प्रति २०० µ एल जोड़ें, 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी, और पंजाब के साथ 3x कोशिकाओं धो लो । प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत प्रोटीन अभिव्यक्ति की जाँच करें ।
      नोट: एक प्रतिनिधि VP2 धुंधला परिणाम के लिए चित्रा 4 देखें ।
  2. VP2 जीन के अनुक्रमण
    1. डीएनए अनुक्रम बढ़ाना उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ और प्राइमरों UL45-F1 और UL46-R1 (तालिका 1) के साथ UL45 और UL46 intergenic क्षेत्र फैले पूरे प्रविष्टि का पता लगाने के लिए ।
    2. निंनलिखित ५० µ एल रिएक्शन मिक्स तैयार करें: 5 µ एल ऑफ़ 10x Pfx रिएक्शन मिक्स, १.५ µ एल ऑफ़ 10 µ मी ऊपर और बहाव प्राइमरी मिक्स, 1 µ एल ऑफ़ 10 एमएम dNTP मिक्स, 1 µ l की ५० mM MgSO4, dna टेम्पलेट की 1 µ l, और ०.५ µ l की Pfx dna पोलीमरेज़ , और nuclease-नि: शुल्क जल को ५० µ l में जोड़ें । प्रवर्धन कार्यक्रम है: 2 मिनट के लिए ९५ ° c; ९५ ° c के लिए 15 एस, ५५ ° c 30 s के लिए, और ६८ ° c ३५ चक्र के लिए 3 मिनट के लिए । जेल ट्रो के लिए 1% agarose जेल के लिए पीसीआर उत्पाद के सभी लोड ।
    3. एक डीएनए जेल शोधन किट के निर्देश के बाद पीसीआर उत्पाद शुद्ध । VP2 जीन की दस्तक की पुष्टि करने के लिए एक sequencing कंपनी के लिए पीसीआर उत्पाद (30 एनजी/µ एल) के 10 µ एल भेजें ।

7. रिकॉमबिनेंट वायरस की स्थिरता

  1. बीज २.६ x 106 CEF कोशिकाओं प्रत्येक T25 कुप्पी में वायरस के विस्तार से पहले दिन ।
  2. गल से कम तीन सकारात्मक क्लोनों ५.२ कदम; प्रत्येक T25 कुप्पी में कोशिकाओं की एक शीशी/ 5% सह2 के साथ ३८.५ ° c पर मशीन जब तक एक ५०% cytopathic प्रभाव मनाया जाता है ।
  3. संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं फसल; अगली पीढ़ी के लिए CEF कोशिकाओं के साथ एक नया T25 कुप्पी के लिए संक्रमित ५० µ एल । passaging रिकॉमबिनेंट वायरस को कम से 15 पीढ़ियों तक रखें । VP2 अनुक्रम की उपस्थिति के लिए और अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख (आइएफए) द्वारा VP2 अभिव्यक्ति के लिए रिकॉमबिनेंट वायरस की स्थिरता का आकलन करने के लिए पीसीआर द्वारा वायरस के प्रत्येक पीढ़ी का विश्लेषण ।

Representative Results

रिकॉमबिनेंट HVT वैक्सीन की पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया रणनीति चित्रा 1में उल्लिखित है, जो शामिल है कि कैसे दाता प्लाज्मिड निर्माण (चित्रा 1एक) और प्रक्रियाओं रिकॉमबिनेंट HVT उत्पंन करने के लिए (1 चित्राबी ). पांच से तीस GFP-जंगली प्रकार पट्टिकाओं से घिरे सकारात्मक सजीले टुकड़े प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप 3 डी posttransfection और संक्रमण के तहत जीन खट-कुओं में मनाया जा सकता है । शुद्ध वायरस एकल सेल छँटाई के बाद प्राप्त (चित्रा 2ए) 3 ' जंक्शन पीसीआर, जो अपेक्षित आकार (चित्रा 2ए, नीचे पैनल) के एक पीसीआर उत्पाद से पता चलता है द्वारा विश्लेषण किया गया था । Cre recombinase द्वारा GFP संवाददाता के उत्पाद के बाद, पट्टिकाओं के ५०% से अधिक अपने GFP अभिव्यक्ति खो दिया है । GFP उत्पाद के बाद शुद्ध पट्टिका (चित्रा 2ख) एकल सेल छंटाई द्वारा आगे 5 ' जंक्शन पीसीआर, जो सही आकार पीसीआर (चित्रा 2बी, नीचे पैनल) से पता चलता है की पुष्टि की थी । चित्रा 3 अलग रंग तत्वों के साथ दोनों जंक्शन पीसीआर उत्पादों के अनुक्रमण परिणाम से पता चलता है । चित्रा 4में, प्रोटीन अभिव्यक्ति VP2-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और विरोधी HVT चिकन सीरम के साथ आइएफए द्वारा पुष्टि की गई थी । के रूप में की उंमीद है, पैतृक HVT से संक्रमित कोशिकाओं को केवल विरोधी HVT सीरम (हरा) से दाग हो सकता है, जबकि रिकॉमबिनेंट HVT-संक्रमित कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से VP2 जीन (लाल) की अभिव्यक्ति दिखाई ।

Figure 1
चित्रा 1: एक रिकॉमबिनेंट HVT-वैक्टर वैक्सीन की पीढ़ी के लिए रणनीति। (क) इस पैनल के दाता प्लाज्मिड निर्माण के लिए क्लोनिंग रणनीति के एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व से पता चलता है । प्रमुख तत्वों में शामिल जारी करने के लिए दो Cas9 लक्ष्य साइटों (sgA), एक रिपोर्टर GFP GFP के उत्पाद के लिए LoxP अनुक्रम के साथ पार्श्व कैसेट, और VP2 अभिव्यक्ति कैसेट । (ख) इस पैनल के एक दो कदम जीन दस्तक रणनीति का अवलोकन से पता चलता है । GFP और VP2 अभिव्यक्ति कैसेट के सम्मिलित अंश Cas9/sgA क्लीवेज द्वारा जारी किया गया है और HVT के अंदर UL45 जीनोम में डाला/46 loci via NHEJ-CRISPR/Cas9 । GFP-सकारात्मक रिकॉमबिनेंट वायरस तो हल और एकल सेल प्रतिदीप्ति-सक्रिय कोशिका छँटाई (FACS) द्वारा शुद्ध है. बाद में, GFP रिपोर्टर जीन Cre recombinase द्वारा उत्पाद है और रिकॉमबिनेंट वायरस शुद्ध और विशेषता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : रिकॉमबिनेंट HVT का सत्यापन । (क) यह पैनल एक GFP-सकारात्मक पट्टिका (HVT-GFP-VP2) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (शीर्ष पैनल) के तहत visualized और HVT-GFP-VP2 के पीसीआर सत्यापन के साथ प्राइमरों VP2-F & UL46-R1 3 ' जंक्शन के लिए दिखाता है । (B) यह पैनल HVT-GFP-VP2 के GFP उत्पादीकरण के बाद की गई एक पट्टिका (HVT-VP2) का दृश्य दिखाता है, Cre recombinase के HVT-VP2 का उपयोग करके प्राइमरी UL45-F1 और VP2-R1 के लिए 5 ' जंक्शन के लिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : रिकॉमबिनेंट HVT वायरस के अनुक्रम विश्लेषण । (क) इस पैनल में विभिन्न रंगों में प्रमुख तत्वों का जुगाड़ HVT intergenic क्षेत्र के बीच UL45/46 के बीच gRNA लक्ष्य अनुक्रम को रेखांकित किया गया है और एक तीर Cas9 दरार साइट दिखा रहा है, अंत में दृश्यों के साथ VP2 अभिव्यक्ति कैसेट इटैलिक लोअरकेस, एसजी-Cas9 दरार साइट दिखा तीर के साथ लाल रंग में एक लक्ष्य अनुक्रम, हरे रंग में LoxP साइट अनुक्रम, और दो SfiI साइटों को नीले रंग में अनुक्रम । (ख) इस पैनल के sequencing परिणामों से पता चलता है 5 ' और 3 ' जंक्शनों और दृश्यों में प्रस्तुत इसी रंग के साथ प्रमुख तत्वों के साथ HVT-VP2 की एक योजनाबद्ध प्रस्तुति. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : रिकॉमबिनेंट HVT-VP2 के लक्षण वर्णन । यह पैनल एंटी-VP2 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी HH7 (रेड) के साथ अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख (आइएफएस) द्वारा संक्रमित CEFs में VP2 की सफल अभिव्यक्ति की पुष्टि को दर्शाता है । HVT संक्रमण HVT-संक्रमित चिकन सीरम (हरा) के साथ आइएफए द्वारा की पुष्टि की है । स्केल बार = 20 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

CRISPR/Cas9 प्रणाली जीन संपादन में एक मूल्यवान उपकरण बन गया है । इस तरह के मुताबिक़ पुनर्संयोजन13 और बीएसी mutagenesis25प्रौद्योगिकी के रूप में रिकॉमबिनेंट HVT वेक्टर विकास, के लिए पारंपरिक प्रौद्योगिकियों, आमतौर पर वेक्टर क्लोनिंग और चयन के कई दौर शामिल है, साथ ही बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग, जिसमें कई महीने लग सकते हैं । प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक NHEJ-CRISPR/Cas9 आधारित Cre-लोक्स प्रणाली और एकल सेल छंटाई के साथ संयुक्त रणनीति का उपयोग कर और अधिक एक सुविधाजनक, कुशल है, और रिकॉमबिनेंट वैक्सीन पीढ़ी में तेजी से दृष्टिकोण । इस पाइपलाइन का प्रयोग, रिकॉमबिनेंट वायरस केवल 1-2 सप्ताह24के भीतर प्राप्त किया जा सकता है, और पट्टिका शुद्धि कदम भी एक गोल जुदाई प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष17छंटाई का उपयोग कर कम किया जा सकता है । पूरी प्रक्रिया, gRNA डिजाइन और दाता निर्माण से शुद्ध रिकॉमबिनेंट HVT वायरस प्राप्त करने के लिए, 1 महीने के भीतर प्राप्त किया जा सकता है । सफल रिकॉमबिनेंट HVT पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण कदम वायरल जीनोम को लक्षित करने के लिए उच्च दक्षता gRNA चयन शामिल विदेशी जीन प्रविष्टि के लिए कुशल दरार सुनिश्चित करने के लिए, उच्च अभिकर्मक क्षमता Cas9 के लिए मौका अधिकतम करने के लिए/ gRNAs और वायरस के संपादन के लिए एक ही सेल में मिलने के लिए, और दाता और gRNA plasmids और वायरल संक्रमण के अभिकर्मक के बीच 12 घंटे के अंतराल के लिए अनुमति देने के लिए Cas9 और gRNA वायरस कोशिकाओं में हो जाता है पहले एक उचित स्तर पर व्यक्त की है ।

HVT रिकॉमबिनेंट पीढ़ी के लिए सीमा जंक्शन पीसीआर द्वारा GFP-पॉजिटिव क्लोनों की पहचान की जटिलता है । GFP-VP2 कैसेट या तो अभिविंयास में डाला जा सकता है । यहां बताई गई जंक्शन पीसीआर सिर्फ नब्ज ओरिएंटेशन में डालने वालों की पहचान के लिए ही है । antisense उंमुखीकरण में डालने के मामले में, पीसीआर का उपयोग कर प्राइमर जोड़े काम नहीं होता वर्णित है, और आंतरिक प्राइमरों इस प्रयोजन के लिए बदली जा सकता है । एक और संभावित समस्या यह है कि दाता का निर्माण केवल एक ही वायरस में जीन प्रविष्टि के लिए Cre उपचार द्वारा GFP हटाने के बाद शेष LoxP अनुक्रम के अस्तित्व के कारण इस्तेमाल किया जा सकता है । एक नए दाता एक संस्करण LoxP अनुक्रम के साथ निर्माण के बजाय एक बहु प्रविष्टि उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

NHEJ और HDR (समरूपता-निर्देशित मरंमत) के दो रास्ते है Cas926,27द्वारा बनाई गई डबल-कतरा टूट (DSBs) की मरंमत । NHEJ अधिक कुशल के रूप में यह सेल चक्र28भर में होता है, जबकि HDR कम कुशल है और केवल एस और G2 चरणों6,29,30के दौरान होता है । हम और अधिक कुशल NHEJ मरंमत मार्ग यहां का दोहन करने के लिए लक्षित स्थानों में विदेशी जीन परिचय । हालांकि NHEJ मरंमत indels संगत या क्षतिग्रस्त डीएनए में शामिल होने से एक समरूपता-स्वतंत्र mechanistically लचीली प्रक्रिया31,३२ के बीच के माध्यम से शुरू हो सकता है सट दाता अनुक्रम और जीनोमिक डीएनए, indels केवल sgA के क्लीवेज साइटों पर हो सकता है, और विदेशी जीन-अभिव्यक्ति कैसेट प्रभावित नहीं है । इस दृष्टिकोण का एक और लाभ यह है कि NHEJ समरूपता बांह निर्माण के प्रतिबंध से मुक्त है, क्लोनिंग कदम बहुत सीधा बना । यह विदेशी जीन प्रविष्टि के लिए NHEJ के आवेदन के लिए एक महान क्षमता का संकेत है । विदेशी जीन कैसेट के दोनों सिरों पर एक सार्वभौमिक gRNA लक्ष्य साइट की शुरूआत की प्रक्रिया को और अधिक तेजी के रूप में दाता टेंपलेट विशिष्ट gRNA चयन के लिए कोई ज़रूरत नहीं के साथ सीधे का निर्माण किया जा सकता है । sgA लक्ष्य साइटों, LoxP साइटों, और PacI और SfiI साइटों युक्त दाता प्लाज्मिड की रीढ़ भी अलग रिपोर्टर जीन के बीच व्यापक रूप से साझा किया जा सकता है, विदेशी जीन-अभिव्यक्ति कैसेट, और विभिंन वायरस वैक्टर, इस नए दृष्टिकोण का लाभ दे अनुकूलन.

इस पांडुलिपि में प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए HVT-हार्बर VP2 डालने का प्रयोग किया गया; तथापि, एक ही दृष्टिकोण को HVT जीनोम के विभिंन जीनोमिक स्थानों पर और अधिक वायरल जीन डालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है multivalent रिकॉमबिनेंट HVT वैक्टर टीके के विकास के लिए वांछित इसी अनुक्रम लक्ष्यीकरण gRNA का उपयोग कर । अन्य MDV वैक्सीन उपभेदों, जैसे एसबी-१ और CVI988, अन्य एवियन herpesviruses, जिनमें संक्रामक laryngotracheitis वायरस और बतख आंत्रशोथ वायरस भी शामिल हैं, और अन्य एवियन डीएनए वायरस, जैसे चेचक विषाणु और एडिनोवायरस भी, उसी का उपयोग कर इंजीनियर हो सकते हैं. multivalent रिकॉमबिनेंट वैक्सीन के विकास के लिए दृष्टिकोण । यहां वर्णित CRISPR/Cas9 प्रणाली मंच का उपयोग कर नए multivalent वैक्टर टीके का विकास अत्यधिक पोल्ट्री रोगों के खिलाफ की रक्षा करने के लिए पोल्ट्री उद्योग के लिए बेहद फायदेमंद होगा ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक फोकल इमेजिंग के साथ मदद करने के लिए Pippa Hawes धंयवाद । इस परियोजना को जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद् (BBSRC) अनुदान किउ/E/I/00007034 और BB/L014262/1 द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M199 medium, Earle's Salts Life technology 11150059 cell culture medium
Fetal Bovine Serum Sigma F0926 cell culture medium
Penicillin and Streptomycin Life technology 15140148 antibiotics
Fungizone Sigma 1397-89-3 antifunigal
Tryptose Phosphate Broth Sigma T8782 cell culture medium
HVT Fc126 strain Avian Disease and Oncology Laboratory wildtype HVT virus
pX459-v2 Addgene Plasmid #62988 Cas9 and gRNA expression vector
pGEM-T Easy Vector Systems promega A1360 donor vector cloning
Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells Invitrogen 18265-017 transformation
PacI NEB rR0547S donor vector cloning
SfiI NEB R0123S donor vector cloning
T4 DNA Ligase NEB M0202S cloning
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 plasmid extraction
TransIT-X2 Mirus MIR 6004 transfection
Cell Culture 6-well Plate Thermofisher 140675 cell culture
GoTaq Master Mixes Promega M7123 junction PCR amplification
Platinum Pfx DNA Polymerase Thermofisher 11708021 PCR amplification of full insert
Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A-11039 immunoflourescence staining
Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568 Invitrogen A-11004 immunoflourescence staining
Confocal laser scanning microscope Leica Microsystems Leica TCS SP5 LASAF immunoflourescence
FACS cell sorter BD biosciences BD FACSAria single cell sorting
Paraformaldehyde (4% in PBS) Santa cruz biotechnology SC-281692 cell fixation
Triton X-100 GeneTex GTX30960 permeabilization

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १४३ CRISPR/Cas9 NHEJ Cre-LoxP HVT रिकॉमबिनेंट वैक्सीन एवियन रोग
सृजन रिकॉमबिनेंट एवियन Herpesvirus वैक्टर with CRISPR/Cas9 जीन संपादन
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Tang, N., Zhang, Y., Pedrera, M.,… More

Tang, N., Zhang, Y., Pedrera, M., Chang, P., Baigent, S., Moffat, K., Shen, Z., Nair, V., Yao, Y. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (143), e58193, doi:10.3791/58193 (2019).

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