Summary
Herpesvirus Puten (HVT) ist als ein Vektor-Plattform für die Generation von rekombinanten Impfstoffen gegen eine Reihe von Vogelkrankheiten verbreitet. Dieser Artikel beschreibt einen einfachen und schnellen Ansatz für die Erzeugung von rekombinanten HVT vektorielle Impfstoffe mit einem integrierten NHEJ-CRISPR/Cas9 und Cre Lox System.
Abstract
Herpesvirus Puten (HVT) ist eine ideale viralen Vektoren für die Generation von rekombinanten Impfstoffen gegen eine Reihe von Vogelkrankheiten, wie aviäre Influenza (AI), Newcastle-Krankheit (ND) und infektiöse bursal Krankheit (IBD), durch bakterielle künstliches Chromosom ( BAC) Mutagenese oder konventionelle Rekombination Methoden. Die gruppierten regelmäßig dazwischen palindromische Wiederholungen (CRISPR) / Cas9-System erfolgreich eingesetzt in vielen Einstellungen für die Bearbeitung von gen, einschließlich der Manipulation von mehreren großen DNA-Virus Genomen. Wir haben eine schnelle und effiziente CRISPR/Cas9-vermittelten Genom Bearbeitung Pipeline um rekombinante HVT generieren entwickelt. Um den möglichen Einsatz dieser Methode zu maximieren, präsentieren wir Ihnen hier detaillierte Informationen über die Methodik rekombinante HVT mit dem Ausdruck des IBDV VP2 Proteins zu erzeugen. Die VP2 Expressionskassette wird eingefügt in der HVT Genom über eine NHEJ (nonhomologous Ende-Beitritt)-abhängige Reparatur Weg. Eine grüne Fluoreszenz Protein (GFP) Expressionskassette wird zunächst auf den Einsatz für einfache Visualisierung befestigt und dann über die Cre-LoxP System entfernt. Dieser Ansatz bietet eine effiziente Möglichkeit, andere virale Antigene in der HVT Genom für die schnelle Entwicklung von rekombinanten Impfstoffen einzuführen.
Introduction
Marek Krankheit (MD) ist eine Lymphoproliferative Erkrankung der Hühner durch Serotyp 1 (Gallid Herpesvirus 2 [GAHV-2]) der Gattung Mardivirus in der Unterfamilie Alphaherpesvirinaeinduziert. Mardivirus beinhaltet auch zwei apathogen Serotypen: Serotyp 2 (GaHV-3) und Serotyp 3 (MeHV-1, historisch bekannt als HVT) die als Impfstoffe gegen MD verwendet werden HVT Lebendimpfstoff (FC-126-Stamm) ist die erste Generation der MD-Impfstoff in den frühen 1970er Jahren verwendet und ist noch in bivalenten und polyvalenten Impfstoff Formulierungen ermöglichen einen verstärkten Schutz gegen MD verbreitet wird HVT dient auch häufig als Impfstoff Vektor induzieren den Schutz gegen eine Reihe von Vogelkrankheiten aufgrund seiner Vielseitigkeit und Sicherheit für sowohl in Ovo und subkutane Brüterei Verwaltung und Fähigkeit, eine lebenslange Immunität zu liefern. Die Strategie zur rekombinante Impfstoffen HVT generieren basiert auf entweder konventionelle homologe Rekombination in Virus-infizierten Zellen, überlappende Cosmid DNAs oder BAC Mutagenese2. Diese Verfahren sind jedoch in der Regel zeitaufwendig und arbeitsintensiv, erfordert den Bau von Transfer-Vektoren, die Wartung des Virusgenoms in Escherichia coli, Plaque Reinigungen und die Entfernung von der BAC-Reihenfolge und Auswahl Marker aus bearbeiteten Viren3,4.
CRISPR/verbunden sind (Cas9) ist das beliebteste gen editing-Tool in den letzten Jahren aufgrund seiner Vielseitigkeit und Spezifität. Das CRISPR/Cas9-System erfolgreich in die effiziente Erzeugung von genetisch veränderten Zellen und Tiermodellen5,6,7,8,9,10, als eingesetzt sowie die Manipulation von mehreren großen DNA-Virus Genome11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20. Nach der Meldung einer einfachen und wirkungsvolle Methode, die Verwendung der CRISPR/Cas9-System zum Bearbeiten von HVT Genom21, entwickelten wir eine Pipeline für die schnelle und effiziente Erzeugung von rekombinanten HVT22.
Zur Erweiterung der Anwendungsmöglichkeiten dieser Methode beschreiben wir die detaillierte Methodik zur Erzeugung von rekombinanten HVT Impfstoff das VP2 gen des IBDV an den UL45/46-Locus in diesem Bericht zum Ausdruck zu bringen. Der Ansatz verbindet NHEJ-CRISPR/Cas9 zum Einfügen des VP2-Gens mit dem Stichwort GLP-Reporter-gen und ein Cre-LoxP-System, die GFP Expressionskassette später zu entfernen. Im Vergleich zu traditionellen Rekombination und BAC Restriktionsenzymen Techniken, beweisen wir, dass NHEJ-CRISPR/Cas9 zusammen mit einem Cre Lox-System eine schnelle und effiziente Herangehensweise an rekombinanten HVT Impfstoff zu generieren.
Protocol
1. Vorbereitung des Cas9/gRNA Ausdruck und Spender baut
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Bau von Cas9/gRNA Ausdruck Plasmide
- Entwerfen einer gRNA Sequenz targeting intergenetischer Region zwischen UL45 und UL46 gen der HVT bereits22beschrieben. Richten Sie die Zielsequenz Reiseführer-RNA gegen HVT Genoms keine potenziellen Ziel Sequenzen im Genom HVT auszuschließen. Synthetisieren Sie und Klonen Sie die gRNA Sequenz targeting UL45/46 Region und sg-A-Sequenz von veröffentlichten Daten23 in pX459-V2 bereits22beschrieben. Überprüfen Sie die geklonten gRNA Sequenz von Sanger-Sequenzierung mit der U6-Fwd Grundierung24.
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Bau des Spenders plasmid
- Um eine Spender-Plasmid enthält die VP2 Expressionskassette getaggt mit einer abnehmbaren GFP-Reporter-Kassette zu generieren, entwerfen Oligos Spender-F und Spender-R enthält die folgenden Elemente (Abbildung 1A und Abbildung 3A): ein sg-A Zielsequenz an beiden Enden, eine PacI Seite flankiert von zwei LoxP-Sequenzen für die GFP Reporter Kassette Klonen und Exzision und zwei SfiI Standorte für das Klonen der VP2 Expressionskassette.
- Die Sequenz in einem pGEM-T-easy Vektor zu klonen und dann Klonen der GFP und VP2 gen-Kassetten in den resultierenden Vektor der Spender-Plasmid als pGEM-SgA-GFP-VP222generieren.
Hinweis: Jeden Klonen Vektor kann verwendet werden, um Spender Plasmid zu konstruieren.
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Plasmid DNA-Vorbereitung
- Bereiten Sie Spender Plasmid und Cas9/gRNA Ausdruck Plasmid DNA mit einem kommerziellen DNA Extraktion Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
(2) CRISPR/Cas9-vermittelten Knock-in: Transfektion und Infektion
- Am Vortag Transfection Küken Embryos Fibroblasten (CEFs) bereiten die Transfektion/Infektion, mit 10 - Tage alten Embryonen in M199 Medium mit 5 % fetalen bovine Serum (FBS), 10 % Tryptose Phosphat Brühe, 100 U/mL Penicillin-Streptomycin, ergänzt und 0,25 µg/mL Fungizone. 1.3 x 106 Samenzellen pro Bohrloch in jede Vertiefung eine 6-Well-Platte im 2,5 mL des Mediums.
Hinweis: CEF Zellen können für 3-d bei 4 ° c aufbewahrt werden - Transfizieren Sie CEF Zellen (vorbereitet in Schritt 2.1) mit 0,5 µg UL45/46-gRNA, 0,5 µg von sg-A und 1 µg pGEM-SgA-GFP-VP2 über eine entsprechende Transfection Reagens gemäß den Anweisungen des Herstellers. Inkubieren Sie die Zellen für 12 h im Inkubator (bei 38,5 ° C mit 5 % CO2).
- 12 h Posttransfection von Cas9/gRNA und Spender Plasmide, verdünnen den HVT Virus bestand mit M199 Kulturmedium bis 1 x 105 Pfu/mL. 130 µL des verdünnten Virus in jede Vertiefung der transfizierten Zellen und ein gut von den untransfected Zellen als Negativkontrolle mit der gleichen Menge des Virus. Inkubieren Sie die transfiziert/infizierte Zellen für 3-d bei 38,5 ° C mit 5 % CO2. Führen Sie alle Verfahren, die mit der gemeinsamen Code of Practice (JCoPR) genehmigt durch die Geldgeber.
3. Ernte und Reinigung des HVT rekombinanten Virus
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Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung
- Bereiten Sie zwei 96-Well-Platten mit 2 x 104 CEF Zellen pro gut am Vortag Sortierung voreingestellt.
- Transfiziert/infiziert CEFs 3 d Postinfection trypsinize. Aspirieren Sie das Medium aus jedem Brunnen und spülen Sie die Zelle Blatt mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Fügen Sie 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA (0,48 mM) auf die Zellen im Inkubator 38,5 ° C für ca. 5 min trypsinize.
- Aufschwemmen Sie und übernehmen Sie die Zellen in einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 50 µL der FBS. Zentrifuge bei 200 X g für 5 Minuten.
- Aufschwemmen der Zellen in 1 mL PBS mit 1 % FBS. Zählen Sie die Zellzahlen unter Verwendung einer Hemocytometer und passen Sie die Anzahl der Zellen, 1 x 106 Zellen/mL.
Hinweis: Zellen können für 1-2 h auf Eis gehalten werden. - Übertragen Sie die Zellen auf Polystyrol Rohr durch Schutzkappe Sieb sortieren. Sortieren Sie die einzelnen Zellen GFP in 96-Well-Platten ausgesät mit CEFs mit der Zelle Sorter nach Anweisungen des Herstellers zum Ausdruck zu bringen. Inkubieren Sie die sortierten Zellen für 5D bei 38,5 ° C mit 5 % CO2.
Hinweis: Eine Passage des rekombinanten Virus kann erforderlich sein, vor dem sortieren gibt es zuviele GFP-Ausdruck Einzelzellen und einigen GFP-positiven Plaques in den ursprünglichen Brunnen.
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Passagierung rekombinante Viren
- Bereiten Sie 6-Well-Platten mit 1,3 x 106 CEF Zellen auch täglich vor der Passage ausgesät. 5D postsorting, überprüfen Sie die 96-Well-Platten unter dem Fluoreszenzmikroskop. Markieren Sie die Brunnen mit einer einzigen GFP-positiven-Plakette.
Hinweis: Siehe Abbildung 2A für eine repräsentative GFP-positiven-Plakette. - Trypsinize jede GFP-positiven gut mit 50 µL Trypsin-EDTA für 3 min, 50 µL Kulturmedium hinzufügen, Aufschwemmen und übertragen Sie die Zellen in einem Brunnen einer 6-Well-Platte mit CEFs. Dies wird die erste Generation der rekombinanten HVT sein.
- Ernten Sie die erste Generation von rekombinanten Viren 3 d später, unten ein Fläschchen jeweils in 1 mL des Einfrierens Medium mit 10 % fetalen Kälberserum (FCS), 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und 80 % Kulturmedium fixieren Sie und speichern Sie die Viren in flüssigem Stickstoff.
Hinweis: Die Erntezeit variiert von 2 bis 4 d je nach Umfang und Verbreitung des Virus. - Sammeln Sie 1 x 105 Zellen jeder erste Generation von Viren zu, Zentrifugieren sie und verwerfen Sie den überstand. Speichern Sie die Zellen bei-20 ° C für DNA-Extraktion.
- Bereiten Sie 6-Well-Platten mit 1,3 x 106 CEF Zellen auch täglich vor der Passage ausgesät. 5D postsorting, überprüfen Sie die 96-Well-Platten unter dem Fluoreszenzmikroskop. Markieren Sie die Brunnen mit einer einzigen GFP-positiven-Plakette.
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Erkennung von genomischen Einfügung durch Polymerase-Kettenreaktion
- Für die DNA-Extraktion, Auftauen und Aufschwemmen der Zelle Pellet aus Schritt 3.2.4 mit 50 µL Puffer anquetschen (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1mM EDTA, 25 mM NaCl, und 200 µg/mL Proteinase K) und lösen Sie die Proben bei 65 ° C für 30 min und , dann, bei 95 ° C für 2 min, inaktivieren die Proteinase K.
- Führen Sie eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit Verzweigung Zündkapseln 3' (Tabelle 1) mit 1 µL DNA-Probe. Für jede Probe bereiten die folgenden 20 µL Reaktion Mischung auf Eis: 2 x PCR Master Mix (10 µL), 10 µM upstream Primer (0,5 µL), 10 µM nachgelagerten Grundierung (0,5 µL), DNA-Vorlage (1 µL) und Nuklease-freies Wasser (8 µL). Die Verstärkung-Programm ist: 95 ° C für 2 min; 95 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s und 72 ° C für 40 s für 35 Zyklen; 72 ° C für 7 min. Last 2 µL der Amplifikationsprodukte zu einem Brunnen von 1 % Agarose-Gel für die Gelelektrophorese.
Hinweis: Siehe Abbildung 2A für ein repräsentatives Ergebnis der Kreuzung 3' PCR.
(4) Exzision von fluoreszierenden Reporter-Gen über die Cre Lox System
- Um das GFP-gen aus der rekombinanten Virus entfernen, transfizieren Sie 2 µg der Cre-Rekombinase-Expressionsplasmid in der 6-Well-Platte mit CEF Zellen, mit einem Transfection Reagens nach Anweisung des Herstellers voreingestellt.
- 12 h Posttransfection, Auftauen einer Ampulle des rekombinanten Virus von flüssigem Stickstoff, Aufschwemmen sanft Samen 50 µL in jede Vertiefung von transfizierten Zellen und setzen einen Brunnen als Negativkontrolle mit der gleichen Menge des Virus. 3 d bei 38,5 ° c mit 5 % CO2inkubieren.
(5) Plaque Reinigung
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Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung
- Samen zwei 96-Well-Platten mit 2 x 104 CEF Zellen pro gut am Vortag sortieren.
- Folgen Sie den Anweisungen in Schritt 3.1 72 h Postinfection (von Schritt 4) beschrieben, um die infizierten Zellen sortieren vorzubereiten. Sortieren Sie die einzelnen Nonfluorescence Zellen in 96-Well-Platten mit CEFs ausgesät.
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Passagierung rekombinante Viren und PCR-Bestätigung
- Wählen Sie 5-10 einzelne Nonfluorescence Plaques 5D postsorting, trypsinize sie mit 50 µL Trypsin-EDTA bei 38,5 ° C für 3 min und 50 µL Kulturmedium zu Aufschwemmen der Zellen hinzufügen.
Hinweis: Siehe Abbildung 2B für eine repräsentative GFP-negativ-Plakette. - Übergeben Sie die Hälfte der Zellen in jeder Brunnen ein 6-Well-Platte als zweite Generation mit CEFs voreingestellt.
- Die verbleibenden Zellen von jeder Klon bei 200 X g für 5 min Zentrifugieren, überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen mit 50 µL Puffer für DNA-Extraktion zu zerquetschen.
- Durchführen Sie PCR mit 5' Verzweigung Zündkapseln (Tabelle 1) mit 1 µL DNA Schablone mit der gleichen Bedingung der PCR-Reaktion, wie unter Punkt 3.3.2 beschrieben.
Hinweis: Siehe Abbildung 2B für ein repräsentatives Ergebnis von 5' Kreuzung PCR. - Auf der Grundlage der PCR-Ergebnisse wählen Sie drei bis fünf positive Klone von rekombinanten HVT für weitere Passagen und Verifizierung.
- Wählen Sie 5-10 einzelne Nonfluorescence Plaques 5D postsorting, trypsinize sie mit 50 µL Trypsin-EDTA bei 38,5 ° C für 3 min und 50 µL Kulturmedium zu Aufschwemmen der Zellen hinzufügen.
6. Überprüfung der rekombinanten HVT
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Indirekte Immunfluoreszenz-assay
- CEFs mit der zweiten Generation des rekombinanten erhalten HVT aus Schritt 5.2 in der 24-Well-Platte mit 2,5 x 105 CEFs am Vortag Infektion ausgesät zu infizieren. Entfernen Sie der Zelle Kulturmedium 48 h Postinfection und 500 µL 4 % Paraformaldehyd in PBS, die Zellen zu beheben. Die Platte bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren, dann entfernen Sie das Fixiermittel und Waschen der Zellschicht 3 X mit PBS.
Hinweis: Die Zellen können für mehrere Wochen bei 4 ° C bei diesem Schritt gespeichert werden. - Entfernen der PBS und 500 µL von 0,1 % Triton x-100, die Zellen 15 min Waschen der Zelle permeabilize layer 3 X mit PBS.
- Block unspezifische Bindung durch Zugabe von blockierenden Puffer (5 % Rinderserum mit PBS-Puffer) für 1 h.
- Verdünnen Sie der primäre Antikörper Anti-VP2 monoklonale Antikörper infiziert HH7 oder HVT Huhn Serum bei 1: 200 in blocking-Puffer, fügen Sie 200 µL pro Bohrloch und bei Raumtemperatur inkubieren Sie für 1 Stunde waschen der Zelle Schicht 3 X mit PBS.
- Der Sekundärantikörper Ziege Anti-Maus IgG Alexa 568 oder Ziege Anti-Huhn IgG Alexa 488 am 1: 200 in blocking-Puffer verdünnen, fügen Sie 200 µL pro Bohrloch Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h und waschen die Zellen 3 X mit PBS. Überprüfen Sie die Proteinexpression unter dem Fluoreszenzmikroskop.
Hinweis: Siehe Abbildung 4 für einen Vertreter VP2 Färbung Ergebnis.
- CEFs mit der zweiten Generation des rekombinanten erhalten HVT aus Schritt 5.2 in der 24-Well-Platte mit 2,5 x 105 CEFs am Vortag Infektion ausgesät zu infizieren. Entfernen Sie der Zelle Kulturmedium 48 h Postinfection und 500 µL 4 % Paraformaldehyd in PBS, die Zellen zu beheben. Die Platte bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren, dann entfernen Sie das Fixiermittel und Waschen der Zellschicht 3 X mit PBS.
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Sequenzierung des Gens VP2
- Verstärken Sie die DNA-Sequenz über die UL45 und UL46 intergenetischer Region mit High-Fidelity-DNA-Polymerase und Primer UL45 F1 und UL46-R1 (Tabelle 1) zu erkennen, das ganze einfügen.
- Die folgenden 50 µL Reaktion Mischung vorbereiten: 5 µL 10 X Pfx Reaktion Mix, 1,5 µL 10 µM stromaufwärts und stromabwärts Grundierung Mischung 1 µL 10 mM dNTP-Mix, 1 µL 50 mM MgSO4, 1 µL DNA Schablone und 0,5 µL Pfx DNA-Polymerase , und 50 µL Nuklease-freies Wasser hinzufügen. Die Verstärkung-Programm ist: 95 ° C für 2 min; 95 ° C für 15 s, 55 ° C für 30 s und 68 ° C für 3 min für 35 Zyklen. Laden Sie alle das PCR-Produkt um 1 % Agarosegel für die Gelelektrophorese.
- Reinigen Sie das PCR-Produkt entsprechend den Anweisungen eines DNA-Gel Reinigung Kit. Eine Sequenzierung Unternehmen bestätigen die Knock-in des Gens VP2 schicken Sie 10 µL des PCR-Produktes (30 ng/µL).
7. Stabilität des rekombinanten Virus
- 2.6 x 106 CEF Samenzellen in jedem T25 Kolben am Vortag die Virus-Erweiterung.
- Tauen Sie mindestens drei positive Klone aus Schritt 5.2; Fügen Sie ein Fläschchen von Zellen/Viren in jedem T25-Kolben. Inkubieren Sie bei 38,5 ° C mit 5 % CO2 , bis ein 50 % zytopathischen Effekt beobachtet.
- Die Zellen in 2 mL Kulturmedium zu ernten; 50 µL in eine neue T25 Kolben voreingestellt mit CEF Zellen für die nächste Generation zu infizieren. Halten Sie die rekombinante Virus Passagierung mindestens 15 Generationen. Analysieren Sie jede Generation von Viren mittels PCR für das Vorhandensein der VP2 Reihenfolge und durch indirekte Immunfluoreszenz-Assay (IFA) für VP2 Ausdruck, um die Stabilität der rekombinanten Viren untersuchen.
Representative Results
Die Strategie für die Generation des rekombinanten Impfstoffes HVT ist in Abbildung 1dargelegt, die beinhaltet, wie der Spender-Plasmid konstruiert (Abb. 1A) und Verfahren der rekombinanten HVT (Abbildung 1B zu generieren ist ). Fünf bis dreißig GFP-positiven Plaketten umgeben von Wildtyp Plaketten können in gen klopfen in Brunnen unter dem Fluoreszenz-Mikroskop-3-d-Posttransfection und -Infektion beobachtet werden. Die gereinigten Virus geholt, nachdem einzellige sortieren (Abb. 2A) von 3' Kreuzung PCR analysiert wurde das PCR-Produkt der erwarteten Größe (Abbildung 2A, Bodenplatte) zeigt. Nach Exzision der GFP-Reporter von Cre-Rekombinase verloren mehr als 50 % der Plaques ihrer GFP Expression. Die gereinigte Plaque nach GLP Exzision (Abbildung 2B) durch einzellige sortieren bestätigte weiter 5' Kreuzung PCR, die richtige Größe PCR-Produkt (Abbildung 2B, Bodenplatte) zeigt. Abbildung 3 zeigt die Sequenzierung Ergebnisse der beiden Kreuzung PCR-Produkte mit unterschiedlichen farbigen Elementen. In Abbildung 4bestätigte die Proteinexpression IFA mit VP2-spezifischen monoklonalen Antikörper und Anti-HVT Huhn Serum. Wie erwartet, können mit der elterlichen HVT infizierte Zellen nur durch Anti-HVT Serum (grün), befleckt werden während rekombinante HVT-infizierten Zellen die Expression des Gens VP2 (rot) deutlich.
Abbildung 1: Strategie für die Erzeugung von einem rekombinanten HVT vektorielle Impfstoff. (A) dieses Panel zeigt eine schematische Darstellung der Klon-Strategie für Spender Plasmid Konstruktion. Die Kernpunkte sind zwei Cas9-Ziel-Sites (SgA) für die Freigabe von Insert, ein Reporter GFP Kassette flankiert von LoxP-Sequenzen für die Exzision der GLP und der VP2 Expressionskassette. (B) dieses Panel zeigt eine Übersicht über eine zweistufige gen Knock-in Strategie. Das Insert Fragment der GFP und der VP2 Expressionskassetten freigegeben durch Cas9/SgA Spaltung und eingefügt in das Genom der HVT an UL45/46 Loci über NHEJ-CRISPR/Cas9. Das GFP-positiven rekombinante Virus ist dann sortiert und gereinigt durch einzellige Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS). Anschließend das GFP-Reportergen ist durch die Cre-Rekombinase ausgeschnitten und der rekombinante Virus ist gereinigt und gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Überprüfung der rekombinanten HVT. (A) dieses Panel zeigt eine GFP-positiven Plaque (HVT-GFP-VP2) visualisiert unter dem Fluoreszenzmikroskop (Oberseite) und der PCR-Überprüfung der HVT-GFP-VP2 mit Primer VP2-F & UL46-R1 für die 3' Kreuzung. (B) dieses Panel zeigt eine Tafel (HVT-VP2) nach der GFP Exzision der HVT-GFP-VP2, visualisiert mit Cre-Rekombinase und PCR-Nachweis der HVT-VP2 mit Primer UL45 F1 und VP2-R1 für die 5' Kreuzung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Analyse des rekombinanten Virus HVT sequenzieren. (A) die Sequenzen der Schlüsselelemente in verschiedenen Farben in diesem Bereich sind die HVT intergenetischer Region zwischen UL45/46 mit der gRNA Zielsequenz unterstrichen und ein Pfeil zeigt die Cas9-Spaltstelle, die VP2 Expressionskassette mit dem Ende-Sequenzen Kursive Kleinbuchstaben, die sg-A Zielsequenz in rot mit dem Pfeil zeigt die Cas9-Spaltstelle, die LoxP-Website-Sequenz in grün und zwei SfiI Websites Sequenzen in blau. (B) dieses Panel zeigt die Sequenzierung Ergebnisse der 5' und 3' Kreuzungen und eine schematische Darstellung des HVT-VP2 mit zentralen Elementen mit entsprechenden Farben in Sequenzen präsentiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Charakterisierung von rekombinanten HVT-VP2. Dieses Fenster zeigt die Bestätigung der erfolgreichen Ausdruck VP2 in infizierten CEFs durch indirekte Immunfluoreszenz-Assay (IFA) mit Anti-VP2 monoklonalen Antikörper HH7 (rot). HVT-Infektion bestätigt IFA mit HVT-infizierten Huhn Serum (grün). Die Maßstabsleiste = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Das CRISPR/Cas9 System ist ein wertvolles Werkzeug in gen Bearbeitung geworden. Die traditionellen Technologien für rekombinante HVT Vektor Entwicklung, wie die homologe Rekombination13 und BAC Mutagenese Technologie25, beinhalten in der Regel mehrere Runden der Vektor klonen und Auswahl sowie der groß angelegten Screenings, Das kann mehrere Monate dauern. Das Protokoll beschrieben hier mit einer NHEJ-CRISPR/Cas9-basierte Strategie kombiniert mit der Cre Lox System und einzellige Sortierung ist mehr ein bequemer, effizienter und schneller Ansatz in rekombinanter Impfstoff Generation. Diese Pipeline, die rekombinante Virus erhalten Sie innerhalb von nur 1-2 Wochen24und Plaque Reinigungsschritte können auch auf eine einzelne Runde Abscheidung mittels Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren17reduziert werden. Der gesamte Prozess vom gRNA Design und Spender für die Erlangung der gereinigten rekombinanten HVT-Virus kann innerhalb eines Monats erreicht werden. Die entscheidenden Schritte für erfolgreiche rekombinante HVT-Generation gehören die hocheffiziente gRNA Auswahl für targeting das virale Genom dafür effiziente Spaltung für das Fremdgen einführen, die hohe Transfektion Effizienz zu maximieren Sie die Chance für Cas9 / gRNAs und das Virus zu treffen sich in der gleichen Zelle für die Bearbeitung und das 12-Stunden-Intervall zwischen der Transfektion von Spender und gRNA Plasmide und die virale Infektion, dass Cas9 und gRNA auf einem vernünftigen Niveau ausgedrückt werden, bevor das Virus in die Zellen gelangt.
Die Einschränkung für die rekombinante HVT-Generation ist, dass die Komplexität der Identifizierung der GFP-positiven durch Kreuzung PCR-Klone. Die GFP-VP2-Kassetten konnte in beiden Orientierung eingefügt werden. Die Ausfahrt, die PCR hier beschrieben ist nur für die Identifizierung des Einsatzes in der Sinn-Orientierung. Im Falle eines Einsatzes in antisense-Orientierung PCR unter Verwendung der Primer-Paaren beschrieben würde nicht funktionieren, und die internen Primer könnten zu diesem Zweck getauscht werden. Ein weiteres Problem ist, dass die Spender-Konstrukt nur ein Gen eingefügt in das gleiche Virus aufgrund der Existenz der verbleibenden LoxP-Sequenz nach der GFP-Entfernung von Cre-Behandlung verwendet werden kann. Eine neue Spender-Konstruktion mit einer Variante LoxP-Sequenz könnte stattdessen mehrere Aufnahme Zwecken verwendet werden.
NHEJ und HDR (unter der Regie von Homologie Reparatur) sind die zwei Wege, die Doppelstrang-Pausen (DSB) erstellt von Cas9,26,27zu reparieren. NHEJ ist effizienter, da es während der Zellzyklus28, erfolgt, wobei HDR weniger effizient ist und nur bei S und G2 Phasen6,29,30 tritt. Wir ausgenutzt effizienteren NHEJ Reparatur Weg hier die fremden Gene in die Zielregionen zu bringen. Obwohl die NHEJ reparieren darf Indels vorstellen, durch den Beitritt noncompatible oder beschädigter DNA-Ends durch eine Homologie-unabhängige mechanistisch flexibles Verfahren31,32 zwischen gespalten Spender Sequenz und genomischer DNA, der indels kann nur an den Standorten der Spaltung der SgA auftreten, und die ausländischen Genexpression-Kassette ist nicht betroffen. Ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes ist, dass NHEJ frei von der Einschränkung der Homologie Arm Bau, so dass das Klonen sehr unkompliziert Schritt. In diesem Zusammenhang ein großes Potential für die Anwendung des NHEJ Fremdgen eingefügt. Die Einführung einer universellen gRNA Zielwebsite an beiden Enden der Fremdgen Kassette macht den Prozess schneller als die Spender-Vorlage sofort ohne die Notwendigkeit für die Auswahl der spezifischen gRNA gebaut werden kann. Das Rückgrat des Spenders Plasmids mit SgA Zielseiten, LoxP-Websites und PacI und SfiI Websites kann auch verbreitet zwischen verschiedenen Reporter-Gene, ausländische Genexpression Kassetten und verschiedenen Virus-Vektoren, Vorteilsbeschaffung für diesen neuen Ansatz der Anpassung.
Die HVT beherbergen VP2-Einlage wurde verwendet, um das Protokoll in dieser Handschrift zu beschreiben; jedoch kann der gleiche Ansatz mehr virale Gene genomische Standorten des HVT Genoms mit der Ausrichtung auf die gewünschte entsprechende Sequenz für die Entwicklung von multivalente rekombinanten Impfstoffen der HVT adaptierter gRNA einfügen verwendet werden. Andere MDV Impfstämme, z. B. SB-1 und CVI988, andere Vogelgrippe Herpesviren, einschließlich Virus der infektiösen Laryngotracheitis und Ente Enteritis Virus und auch andere Vogelgrippe DNA-Viren, wie Pocken Viren und Adenoviren, können auch entwickelt werden, mit den gleichen Ansatz zur Entwicklung von multivalente rekombinanten Impfstoffen. Die Entwicklung neuer mehrwertige vektoriellen Impfstoffe mit dem CRISPR/Cas9-System-Plattform beschrieben hier werden sehr vorteilhaft für die Geflügelindustrie gegen mehrere Geflügelkrankheiten zu schützen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken für die Hilfe mit der konfokalen Bildgebung Pippa Hawes. Dieses Projekt wurde unterstützt von der Biotechnologie und biologische Wissenschaften Research Council (BBSRC) gewährt, BBS/E/ich/00007034 und BB/L014262/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M199 medium, Earle's Salts | Life technology | 11150059 | cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | cell culture medium |
| Penicillin and Streptomycin | Life technology | 15140148 | antibiotics |
| Fungizone | Sigma | 1397-89-3 | antifunigal |
| Tryptose Phosphate Broth | Sigma | T8782 | cell culture medium |
| HVT Fc126 strain | Avian Disease and Oncology Laboratory | wildtype HVT virus | |
| pX459-v2 | Addgene | Plasmid #62988 | Cas9 and gRNA expression vector |
| pGEM-T Easy Vector Systems | promega | A1360 | donor vector cloning |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | transformation |
| PacI | NEB | rR0547S | donor vector cloning |
| SfiI | NEB | R0123S | donor vector cloning |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | cloning |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | plasmid extraction |
| TransIT-X2 | Mirus | MIR 6004 | transfection |
| Cell Culture 6-well Plate | Thermofisher | 140675 | cell culture |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7123 | junction PCR amplification |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Thermofisher | 11708021 | PCR amplification of full insert |
| Goat anti-Chicken IgY (H+L) Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | immunoflourescence staining |
| Goat anti-Mouse IgG Antibody, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | immunoflourescence staining |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP5 LASAF | immunoflourescence |
| FACS cell sorter | BD biosciences | BD FACSAria | single cell sorting |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Santa cruz biotechnology | SC-281692 | cell fixation |
| Triton X-100 | GeneTex | GTX30960 | permeabilization |
References
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