Summary
Her beskriver vi protokoller for genetiske og kjemiske valideringen av c-Fos og Dusp1 som narkotika mål i leukemi bruker i vitro og in vivo genetiske og humanized musen modeller. Denne metoden kan brukes på noen mål for genetisk validering og terapeutiske utvikling.
Abstract
Demonstrasjon av tyrosine kinase hemmere (TKIs) i behandling av Kronisk myelogen leukemi (bruk) har innledet en ny æra i cancer therapeutics. Men svarer en liten populasjon av celler ikke TKI behandling, noe som resulterer i minimal gjenværende sykdom (MRD); selv de mest potente TKIs ikke utrydde disse cellene. Disse MRD celler tjene som et reservoar å utvikle resistens til terapi. Hvorfor TKI behandling er ineffektive mot MRD celler er ikke kjent. Vekstfaktor signalnettverk er involvert i å støtte overlevelsen MRD celler under TKI behandling, men en mekanistisk forståelse mangler. Nyere studier har vist at et forhøyet c-Fos og Dusp1 uttrykk som følge av konvergent kreftfremkallende og vekstfaktor signalering i MRD celler megle TKI motstand. Genetiske og kjemiske hemming av c-Fos og Dusp1 gjengir bruk utsøkt sensitive til TKIs og herdes bruk i både genetiske og humanized musen modeller. Vi identifisert disse mål genene bruker flere microarrays fra TKI-sensitive og -resistente celler. Her gir vi metoder for målet validering bruker i vitro og in vivo musen modeller. Disse metodene kan lett brukes på noen mål for genetisk validering og terapeutiske utvikling.
Introduction
Konstituerende tyrosin kinase aktivitet av BCR-ABL1 fusion oncogene forårsaker bruk, som gir en begrunnelse for å målrette kinase aktiviteten av lite molekyl inhibitors. Suksessen til TKIs i behandling av bruk pasienter revolusjonerte begrepet målrettet terapi1,2. Deretter anti-kinase terapi som presisjon medisin ble utviklet for flere andre malignitet, inkludert solide svulster. Hittil er mer enn tretti kinase hemmere godkjent av United State FDA for å behandle ulike malignancies. Mens TKI behandling er svært effektiv i undertrykke sykdommen, er det ikke helbredende. Dessuten, en liten populasjon av kreftceller vedvarer under behandlingen: MRD3,4,5. Selv pasienter som viste fullstendig remisjon igjen med MRD, som til slutt resultater i tilbakefall hvis ikke kontinuerlig undertrykt. Derfor er utrydding av MRD celler nødvendig for å oppnå et holdbart eller helbredende svar. Bruk representerer en verdifull paradigmet for å definere begrepet presisjon medisin, mekanismer for oncogenesis, rasjonell mål-rettet therapeutics, sykdomsprogresjon og resistens. Men selv i dag, mekanismen kjøring TKI-indusert celledød i kreftceller er ikke fullt ut forstått, eller hvorfor MRD celler (består av leukemic stamceller [LSCs]) er egentlig motstandsdyktig mot TKIs4,6. Likevel er fenomenet "oncogene avhengighet" mutant kinase oncoprotein involvert i TKI effekt der akutt hemming av målrettede oncogene ved TKIs forårsaker en kreftfremkallende støt som fører til en massiv proapoptotic svaret eller gågaten i cellen kontekst-avhengige måte6,7,8,9. Imidlertid mangler den mekanistiske understøttelsen av oncogene avhengighet. Nyere studier har innblandet som vekstfaktor signalisering opphever oncogene avhengighet og følgelig gir motstand mot TKI terapi10,11,12. Derfor, for å få innsikt i mekanismen av oncogene avhengighet, vi spilte hele-genome expression profilering BCR-ABL1 avhengige og nonaddicted celler (vokst med vekstfaktorer), som viste at c-Fos og Dusp1 er kritiske meglere på oncogene avhengighet13. Genetisk sletting av c-Fos og Dusp1 er syntetiske dødelig for BCR-ABL1-uttrykke celler musene som brukes i eksperimentet utvikle ikke leukemi. Videre kurert hemming av c-Fos og DUSP1 av små molekyl hemmere BCR-ABL1-indusert bruk i mus. Resultatene viser at uttrykket nivåene av c-Fos og Dusp1 definerer apoptotisk terskelen i kreftceller, slik at lavere nivåer konferere narkotika følsomhet mens høyere nivåer føre til terapi13.
For å identifisere genene kjøring oncogene avhengighet, utført vi flere hele-genome expression profilering eksperimenter i nærvær av vekstfaktor og en TKI (imatinib) med både mus- og bruk pasient-avledet celler (K562). Disse dataene ble analysert parallelt med bruk pasienten datasett fra CD34+ blodkreft stamceller før og etter behandling med imatinib. Analysen avdekket tre gener (en transkripsjon faktor [c-Fos], dobbelt spesifisitet fosfatase 1 [Dusp1], og en RNA-bindende protein [Zfp36]) som er ofte upregulated i TKI-resistente celler. For å validere betydningen av disse genene i overdragelse resistens, gjennomført vi trinnvise i vitro og vivo analyse. Uttrykket nivåene av disse genene ble bekreftet av sanntids qPCR (RT-qPCR) og vestlige blotting i narkotika-resistente celler. Videre, cDNA overuttrykte og knockdown av shRNA hårnåler av c-Fos, Dusp1, og Zfp36 viste at opphøyet c-Fos og Dusp1 uttrykk er tilstrekkelig og nødvendig å tildele TKI motstand. Derfor utført vi en i vivo validering bruker musen modeller med c-Fos og Dusp1 bare. For genetisk valideringen av c-Fos og Dusp1, vi opprettet ROSACreERT-induserbart c-Fosfl/fl mus (betinget knockout)14 og krysset dem med Dusp1- / - (rett knockout)15 å ROSACreERT2-c-Fosfl/fl Dusp1- / - dobbel-transgene mus. Ben margtransplantasjon-avledet c-Kit+ celler (fra c-Fosfl/fl-, Dusp1- / -- og c-Fosfl/flDusp1- / -) uttrykker BCR-ABL1 var analysert i vitro colony-forming unit (CFU) analysen, og i vivo av benmarg transplantasjon i drepende bestrålt mus, teste kravet til c-Fos og Dusp1 alene eller sammen i leukemi utvikling. Likeledes, de kjemiske hemninger c-Fos av DFC (difluorinated curcumin)16 og Dusp1 av BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 ble testet i vitro og in vivo bruker BCR-ABL1-uttrykke, bein margtransplantasjon-avledet c-Kit+ celler fra vill-type (WT) musen. For å bekrefte kravet til c-Fos og Dusp1 i leukemic stamceller, utnyttet vi en bruk musemodell der BCR-ABL1 var spesielt indusert i stilk celler av doxycycline (Tet-transactivator uttrykker under murine stamcelleforskningen leukemi (SCL) gen 3 enhancer regulering)18,19. Vi brukte benmarg Lin-Sca+c-Kit+ (LSK) celler fra disse musene i i vivo transplantasjon analysen. Videre etablerte vi phopsho-p38 nivåer og uttrykket IL-6 som pharmaco-dynamisk biomarkers for Dusp1 og c-Fos hemming, henholdsvis i vivo. Til slutt for å forlenge studiet for menneskelig relevans, pasient-avledede CD34+ celler (tilsvarer c-Kit+ cellene fra mus) ble utsatt til langsiktig in vitro kultur-starte cellen analyser (LTCIC) og en i vivo humanized musemodell Bruk20,21. Immunodeficient mus ble transplantert med bruk CD34 + celler, etterfulgt av behandling og human leukemic celle survival analyse.
I dette prosjektet utvikle vi metoder for mål identifisering og valideringer bruker både genetiske og kjemiske verktøy, bruker forskjellige prekliniske modeller. Disse metodene kan brukes for å validere andre mål utvikler kjemiske modaliteter for terapeutisk utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til retningslinjene for institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC). Menneske prøver (Normal BM og at bruk (p210-BCR-ABL +) leukemi) var fra institusjonelle Review Board-godkjent protokoller (institusjonelle Review Board: Federalwide forsikring #00002988 Cincinnati Children's Hospital Medical Center) og donor informert samtykke fra CCHMC og University of Cincinnati.
1. sanntids qPCR analyse
- Isolere totale RNA fra BaF3 cellene vokse i RPMI supplert med 10% FBS og 10% WEHI brukt kultur medium som en kilde til interleukin-3 (IL-3).
- Høste celler i logaritmisk fase (99% Live) fra behandlet (IL-3 og imatinib) og ubehandlet prøver og sentrifuge dem 435 x g i 3 minutter. Helse og vekst stadier av cellene er avgjørende som deres genet uttrykket profiler kan endre seg dramatisk.
- Isolere RNA ved rensing totale RNA22. Kvantifisere den totale RNA; deretter utsett den for DNase behandling23. Konvertere lik mengde DNA-fri RNA (2 µg) til cDNA med revers transkriptase24.
- Utføre qPCRs med Gen-spesifikke primerne (tabell 1). Utføre PCRene i 20 µL reaksjoner i 0,2 mL, tynnvegget PCR rør med optisk caps, ved hjelp av en 1 x polymerase mix (se Tabell for materiale), 0,5 µM av hver primer, 1 µL av DNA, og vann. Plasser reaksjonen i thermocycler med følgende syklus: trinn 1 95 ° C i 10 min; Trinn 2, 95 ° C i 15 s; Trinn 3 ved 60 ° C i 1 min; Trinn 4, Gjenta trinn 2 – 3 40 ganger. Utfører alle PCRene i triplicates og normalisere sanntidsdata β-utgangen uttrykk før plotting.
2. vestlige Blotting
Merk: Hele celle ekstrakter ble utarbeidet ved å legge til 250 µL av 1 x lyseringsbuffer som beskrevet i Kesarwani et al.13 supplert med protease hemmer cocktail og fosfatase hemmer cocktail 2.
- Harvest fem millioner BaF3 celler i logaritmisk fase (99% Live) fra behandlet (IL-3 og imatinib), samt fra ubehandlet BaF3 celler med sentrifugering 435 x g i 3 minutter på 4 ° C. Lyse cellene i lyseringsbuffer (250 µL) av pipettering opp og ned 1 x, etterfulgt av en 5 min incubation på 80 ° C. Sonicate den lysate å bryte ned alle DNA med 5-6 pulser 5 s i et kaldt rom på 4 ° C.
- Overføring av lysate til en 1,5 mL tube og sentrifuge det 16.000 x g i 5 min fjerne uløselig materiale. Ekstrakt kan lagres ved-80 ° C før bruk. Varme prøver til 80 ° C i 5 minutter i en varme blokk før lasting. Laste inn 10 µL av prøven ved hjelp av en gel-lasting tips på 10% SDS side gel.
- Løse proteiner fra 150 V til referanse fargestoff når bunnen av gel. Overføre protein til nitrocellulose membraner av en electrophoretic overføring på 1 amp 1t. Etter overføringen, hindre membraner i 1 x Tris-bufret saline + 0,1% mellom 20 (TBST) med 5% ikke-fett melk for 1 h og sonde overnatting på 4 ° C med passende antistoffer på en 1:1,000 fortynning.
- Vask membraner 3 x 5 x med TBST i 10 min hver; deretter sonde med et HRP-konjugerte riktig sekundære antistoff (1:5, 000 fortynning) ved romtemperatur 1t. Mengden av TBST brukes, avhenger av beholder størrelsen. Pass på å senke membranen i TBST helt. Vask sekundære antistoffer 3 x i 5 min hver med TBST.
- Utvikle blot bruke chemiluminescent substrat reagens. Bland like volum av underlaget og bufferen fra to flasker, rett før bruk. Legge til underlaget i toppen av membranen å dekke hele membranen med en 1 mL pipette og ruge for 1 min. Blots skal avbildes innen 1 – 10 min å legge underlaget.
- Bruker sløv tang, forsiktig plassere membranen plattform tenkelig systemet (se Tabellen for materiale), unngå mye av væsken. Velg en live view og velg blots og chemiluminiscence fra menyen. Bruker manuell oppkjøpet, erverve flere eksponeringer på ulike tidspunkt. Disse filene kan visualiseres og kvantifisert ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare.
3. generasjon Knockout mus
- Krysse c-Fosfl/fl mus med ROSACreERT2 mus til å generere ROSACreERT2c-Fosfl/fl mus13. For å opprette dobbel-knockout (KO) musene, rase ROSACreERT2c-Fosfl/fl mus med Dusp1- / - mus til å generere ROSACreERT2c-Fosfl/fl Dusp1- / - mus13. Genotype mus ved halen klipp etterfulgt av PCR, som beskrevet nedenfor.
-
Genotyperingteknologi:
- For å forberede DNA, klippet en liten del av halen med saks og putte den i en 1,5 mL tube. Cauterize halen med oppvarmet saks. Legge til 200 µL 50 mm NaOH avkuttet halen i røret og ruge på 95 ° C i en varme blokk 1t.
- Vortex tube godt og deretter nøytralisere ved å legge til 50 µL av 1 M Tris HCl pH 6.8 og vortex igjen. Sentrifuge røret med maksimal hastighet for 1 min.
- Utføre PCRene i 20 µL reaksjoner i 0,2 mL, tynnvegget PCR rør bruker 1 x Taq polymerase master blanding som inneholder fargestoff, 0,5 µM av hver primer, 1 µL av DNA, og vann. Plassere rør i thermocycler og kjører riktig sykluser som vist i tabell 2.
- Kjøre PCR produktet på 2% agarose gel og bildet bruker gel dokumentasjon system.
4. isolering av c-Kit+ celler fra benmargen
- Ofre musene i henhold til institusjonelle retningslinjer.
Merk: Her musene ble utsatt for karbondioksid (CO2) på en ifølge AVMA anbefalt flyt til død ble bestemt av åndedrett og hjerteslag, etterfulgt av cervical forvridning. - Høste etappebein fra musa, to femurs, to tibias, to iliacs. Rengjør av alle vev av beina ved å skrape bort med skalpell. Sette etappe bein i kalde 1 x PBS på is-5 mL i en 15 mL tube. Hell innholdet i røret i en morter og knuse den med en pistil.
- Filtrere celle suspensjon gjennom en 70 µm celle sil i et 50 mL skrukork rør med en 10 mL pipette festet, ved hjelp av en pipette. Vask morter flere ganger med kaldt 1 x PBS, samle og legge til celle suspensjon 50 mL tube. Nedspinning benmarg 1200 x g ved 4 ° C i 5 min. Fjern den supernatant via et vakuum med en glass pipette knyttet. Avbryte celle pellet 5 mL 1 x PBS med en pipette.
- Med en pipette, sakte legge suspendert benmargen til toppen av 5 mL av romtemperatur (temperaturen er kritisk) polysucrose, tar stor forsiktighet for ikke å forstyrre grensesnittet. Spinn på 400 x g ved romtemperatur for 20 min med bremsen deaktivert.
- Samle skyet total mono-kjernefysiske-cellen (TMNC) grensesnittet med en pipette, og sette den inn i en ny 15 mL tube. Bringe volumet opp til 10 mL med 1 x PBS for vask, tar 20 µL for opptelling, og spinn på 1200 x g ved 4 ° C i 5 min. Forkast nedbryting og lagre pellet på is trinn 4.6.1.
-
Utføre c-Kit+ celle isolasjon.
- Følger en microbead kit protokollen for c-Kit+ celle isolasjon. Resuspend celle pellet i 80 µL av 1 x PBS + EDTA + BSA 107 celler. Legge til 20 µL av CD117 MicroBeads/107 totalt celler celle suspensjon. Bland godt vortexing og Inkuber i 10 min på 4 ° C. Bringe volumet opptil 10 mL ved å legge til 1 x PBS + EDTA + BSA og spinn på 1200 x g ved 4 ° C i 5 minutter.
- Fjern nedbryting via et vakuum og suspendere celle pellet i 500 µL/108 totalt celler i 1 x PBS, EDTA + BSA. Bruker magnet stå med magnetiske kolonnen knyttet, legge 3 mL 1 x PBS, EDTA + BSA og tillate den å strømme gjennom via gravitasjon til en 15 mL samling rør.
- Når den første buffer tillegget er ferdig passerer gjennom kolonnen, kan du legge til celle suspensjon i kolonnen slik at det flyter gjennom via tyngdekraften til 15 mL samling rør. Denne flowthrough er uønsket celle brøken.
- Vask kolonnen 3 ganger med 3 mL 1 x PBS, EDTA + BSA hver gang, slik at det flyter gjennom via tyngdekraften inn i samling røret. Fjern kolonnen fra magneten og plasser på toppen av en 15 mL tube.
- Legg til 5 mL 1 x PBS, EDTA + BSA og umiddelbart skylle den med stempelet med kolonnen. Fjerne stempelet gjenta flush med en ekstra 5 mL 1 x PBS, EDTA + BSA. Tell cellene i det totale volumet ved hjelp av standard metoder.
- Nedspinning cellene på 1200 x g ved 4 ° C i 5 min. Fjern nedbryting og resuspend pellet i komplett IMDM (IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] + mSCF [50 ng/mL] + FLT3 ligand [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) for kultur. Disse cellene overnatting i 2 x 106 celler/1 mL av celle IMDM komplett media ved å plassere dem i en inkubator på 37 ° C og 5% CO2-kultur.
5. signaltransduksjon
-
Retroviral plasmider transfection
- Fersk tine HEK293 celler ettermiddagen før i et vannbad satt til 37 ° C. Spinn cryotube som inneholder de HEK cellene 435 x g ved romtemperatur for 3 min. Fjern den supernatant via et vakuum og suspendere celle pellet i 1 mL av DMEM med 10% FBS, penicillin og streptomycin glutamin.
- Telle celler og legger riktige volumet en 10 cm behandlet rett (~ 4 x 106 HEK293T celler). Legg 14 mL DMEM 10 media til retten og bland det godt ved å skyve opp eller ned for en lik fordeling. Plass rett i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator over natten.
- På neste morgen, sjekk der celler under en invertert lys mikroskop (50% eller mer fungerer bra).
- Kombinere DNA (ønsket retroviral plasmider), PclEco (emballasje plasmider), 2 M CaCl2, og H20 i en 1,5 mL tube (= 500 µL) ved hjelp av brønnene i seg følgende beløp: 7,5 µg DNA (BCR-ABL1-YFP), 7,5 µg av pCLeco, 62 µL av 2 M CaCl2 , og til et endelig antall 500 µL. legge til 500 µL av 2 x HBS til en annen 1,5 mL tube.
- Legge til DNA bland dropwise til 1,5 mL røret som inneholder 500 µL av 2 x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES og 1,5 mM Na2HPO4) mens. Oppnå dette ved å angi en vortex laveste hastighet og hold HBS røret på det i konstant miksing mens transfection mix.
- Tillate transfection mix å ruge i 20-30 min ved romtemperatur. Under incubation, legge til 25 nM chloroquine HEK cellene og legg dem tilbake i inkubator. Etter inkubasjon, Legg transfection mix dropwise til HEK cellene og deretter forsiktig swirl media å blande transfection mix hele platen.
- Inkuber cellene med en miks for ~ 8 h i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Endre media på disse cellene ved veldig sakte legger til 14 mL av fersk DMEM 10 media. Pipettering sakte mot veggen av parabolen hjelper for å forhindre alle stripping av HEK celler. Inkuber cellene over natten i 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Samle viral nedbryting med en 10 mL sprøyte, tegne nedbryting i sprøyten og knytte 0,45 µm sprøyte filteret. Stupe viral nedbryting i en ny samling rør. Ta den første samlingen av viral supernatant ~ 16 h senere.
-
Fibronectin viral konsentrasjon og signaltransduksjon
- Legge til 2 mL et 0,1 mg rekombinant menneskelige fibronectin fragment i 1 x PBS ubehandlet 6-vel kultur plater. Forberede så mye fibronectin etter behov, som avhenger av antall celler og genotyper. En godt nok kan transduce 10 millioner c-Kit+ celler. Inkuber platen overnatting på 4 ° C.
- Neste dag, Fjern fibronectin fra brønnene med en pipette, pipette 2 mL steril 2% BSA på 1 x PBS blokkere platen, og ruge i 30 min ved romtemperatur. Fjern BSA via et vakuum og vask grundig av pipettering 2 mL 1 x PBS deretter fjerne den via et vakuum.
- Straks legge ferske samlet og filtrert (for 0,45 µm) viral supernatant opptil 5 mL. Sentrifuge 435 x g ved 32 ° C for 2 h. fjerne den supernatant via et vakuum og gjenta dette trinnet med ekstra ferske samlet viral nedbryting og spinn igjen. Fjerne det supernatant via et vakuum og vask brønnene ved å legge til 2 mL 1 x PBS; deretter fjerne den via et vakuum.
- Legge til c-Kit+ musen celler som var kulturperler overnatting (trinn 4.6.6) viral belagt fordelt ved blande celle suspensjoner godt og pipettering dem inn i nå viral konsentrert fibronectin plate. Spinn på 1200 x g ved 25 ° C i 90 min. cellene innlegge en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- 48 h posttransduction, pellets cellene med sentrifugering 1200 x g ved 4 ° C i 5 min og resuspend dem i FACS buffer #1 (1 x PBS + 0,5% BSA) 6 x 106/mL. Bestemme andelen BCR-ABL1 positive celler ved å måle andelen YFP positivt ved hjelp av flowcytometri.
- Erverve hendelser med standard prosedyre. Først gate live cellene basert på fremover og side scatter. Da gate YFP positive live cellene unntatt YFP-negativecells bestemmes av negativ kontroll (Figur 4).
6. colony-forming UnitAssays
- Tine methylcellulose med cytokiner musen ved romtemperatur for 1-2 h. Aliquot 3 mL av methylcellulose i et FACS rør med 5 mL sprøyter uten en nål. Sortere YFP-positive cellene i cellen sortering.
- Nedspinning cellene og avbryte pellet IMDM komplett medier. Telle celler for å være belagt og fortynne dem for å få 5000 YFP-positive celler i 100 µL IMDM komplett medier.
- Legge til 100 µL av cellen suspensjon som inneholder 5000 YFP-positive celler og de aktuelle hemmere til 3 mL av methylcellulose (se Tabell for materiale). Vortex høye å blande den for 10-30 s.
- De fleste av luften bobler har rømt, bruk en 1 mL sprøyte til plate 1 mL av medier i tre Repliker 3 cm plater av løser ut mediet på den ene siden og sakte vippe platen i en sirkelbevegelse å jevnt.
- Siste konsentrasjonen av hemmere bruke er imatinib på 3 µM, DFC på 0,2 µM og BCI på 0,5 µM, alene eller i kombinasjoner. Der det er aktuelt, kan du slette c-Fos ved plating cellene med 4-hydroxytamoxifen (1 µg/mL) lagt til i methylcellulose.
- Etter plating, satt plater i en stor Petriskål med en åpen rett som inneholder 2 mL sterilt vann i midten. Dekker store Petriskål og nøye ruge på 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Registrere kolonien tallene etter en uke med plating ved å telle antall koloniene under et mikroskop.
- Analysere noen kolonier fra aktuelle plater for c-Fos sletting av PCR. Samle koloniene ved å suge dem med P1000 tips. Løsne cellene i 500 µL av 1 x PBS ved å vaske spissen i PBS flere ganger. Spinn av cellen suspensjon 6000 x g for 1 min og ekstra DNA fra cellen pellet bruker en genomisk DNA isolering kit.
- Bruke genomisk DNA for PCR primere mFos-FP3 og mFos-RP5, som beskrevet i tabell 2. Analysere PCR produktene på 2% agarose gel og bildet bruker gel dokumentasjon system.
- En grafisk presentasjon av koloniene, beis koloniene, med Iodonitrotetrazolium chloride. Oppløse 10 mg av Iodonitrotetrazolium klorid i 10 mL vann for å få en 1 mg/mL løsning. Filteret sterilisere løsningen med en Luer-lock med 0,2 µm filtere knyttet til 10 mL sprøyte under sterile forhold i vev kultur hette.
- I vev kultur panseret, legge 100 µL av flekker løsning dropwise rundt CFU plate; Vær forsiktig med å skyve eller forstyrre kolonier. Inkuber platene overnatter i en 37 ° C, 5% CO2 celle kultur inkubator. Koloniene vil slå mørke rødlig brun. Bruke hvit bakgrunn i sterilt vev kultur panseret, ta bilder av farget CFU plate.
7. transplantasjon og dødelighet analysen
- Drepende irradiate mus med delt stråling med en 137 Cs-baserte Gamma-ray med en dose på 7,0 Gy etterfulgt av 4.75 Gy (0,5 Gy/min), 3 h fra hverandre før transplantasjon.
- Transplantasjon 4 x 104 usortert YFP-positive (beregnet basert på andelen YFP) celler med 3 x 105 normale bein margtransplantasjon celler som bærer i hvert musen gjennom halen vene injeksjon.
- Etter en uke av transplantasjon, bestemme engraftment ved å analysere YFP-positive cellene fra perifert blod bruker FACS.
-
Utføre en hale blodåre blø og FACS analyse.
- Varm buret av mus under en varmelampe forsiktig ikke skal overopphetes eller brenne dem.
- Holde en mus i en mus restrainer og nick hale venen med sterilt blad. Forsiktig melk halen fra fremre bakre, slik at en blod dråpe å akkumulere. Samle blod med et heparinized kapillær rør til det er fylt (samle rundt 75-100 µL). Stupe blodet fra fylte kapillær røret i en blod samling rør som inneholder EDTA og bland godt.
- Lyse RBCs ved å legge 30 – 40 µL av blod til 3 mL 1 x RBC lyseringsbuffer (150 mM salmiakk, 10 mM kalium bikarbonat og 0,13 mM EDTA). Bland godt, invertere røret flere ganger. Inkuber ved romtemperatur for 10-15 min. spinn på 1200 x g ved 4 ° C for 5 min. fjerne den supernatant via et vakuum og avbryte pellet 2 mL 1 x PBS for en vask.
- Spinn på 1200 x g ved 4 ° C i 5 min. Fjern nedbryting og avbryte det FACS buffer #1. Utføre FACS analyse som beskrevet ovenfor i trinn 5.2.5–5.2.66. Kortsiktig store gjenværende blodet i samlingen rør, som kan brukes til diverse andre formål, på 4 ° C.
- Transplantert mus som viste 10-40% YFP-positive celler i perifert blod ble brukt for eksperimentet. Musene som hadde mindre enn 2% av YFP-positive celler ble ekskludert fra studien.
- Forberede tamoxifen på 20 mg/mL i maisolje på 60 ° C med uregelmessige vortexing til helt oppløst, og lagre den på 4 ° C i mørket for varigheten av behandlingen. Etter en uke av transplantasjon, slette c-Fosfl/fl allelet ved å injisere tamoxifen (100 mg/kg i maisolje) intraperitoneally (IP) til mus, hver dag i tre dager. Det er viktig at mus er veid for å finne ut hvor mye tamoxifen å injisere. Behandlingen tamoxifen (eventuelt), gruppe mus for medikamentelle behandlinger (n = 5/gruppe).
- Overvåke mus for leukemi progresjon og overlevelse og bestemme den leukemic byrde (YFP-positive celler av FACS) ukentlige opptil åtte uker i overlevende mus.
- Analysere blod for c-Fos sletting der det passer, som beskrevet over i Seksjon 6. Registrere antall gjenlevende mus hver dag og plotte overlevelse kurven på slutten av eksperimentere med en grafisk programvare.
8. transgene mus modell av BCR-ABL1 leukemi
-
LSK isolasjon
- Opprettholde Scl-tTA transgene musene på doxycycline chow forhindre at et uttrykk av BCR-ABL1. Fire uker før transplantasjon, ta musene av doxycycline chow BCR-ABL1 uttrykk.
- Isolere TMNCs fra Scl-tTA transgene mus som beskrevet over i Seksjon 4. Avbryte TMNCs FACS buffer #2 (1 x PBS + 0,5% BSA + 2 mM EDTA) for å få 106 celler/mL.
- Tømmer TMNCs for linjen-positive celler ved å legge 10 µL av avstamning celle gjenkjenning cocktail biotin (biotin-konjugerte monoklonale antistoffer mot CD5 [rotte IgG2a], CD11b [rotte IgG2a], CD45R [B220] [rotte IgG2a], Anti-7-4 [rotte IgG2a], Anti-Gr-1 [Ly-6G/C, rotte IgG2a], og Anti-Ter-119 [rotte IgG2b]) per 1 x 106 celler. Inkuber cellene på 4 ° C for 10 min i mørket, etterfulgt av en vask med 5 mL FACS buffer #2, og spinne på 1200 x g ved 4 ° C i 5 min. leveringstanken nedbryting helt og suspendere cellene i 400 µL FACS bufferen #2.
- Legge til 5 µL av anti-biotin antistoff-FITC konjugert 1,2 µL av Ly-6A/E (Sca1) PECy7 og 2.4 µL av CD117 (c-Kit) APC antistoffer for opptil 108 millioner celler. Inkuber i mørket ved romtemperatur for 10 min. vask ved å bringe volumet opptil 5 mL med FACS buffer #2; deretter sentrifuge 1200 x g ved 4 ° C i 5 min. Fjern nedbryting og avbryte celle pellet 500 µL FACS bufferen #2.
- Filtrere celle suspensjon i en blå filter-cap FACS rør.
- Gate levende celler med fremover og side scatter. Velg lin- cellene som viste MFI (mener fluorescens intensiteten i mindre enn 102) å få LSK celler c-Kit+ og Sca1+ på en biexponential plot fra overordnet Lin- og sortere dem (figur 7 C).
- Samle sorterte cellene og sentrifuge dem på 1200 x g ved 4 ° C i 5 minutter.
-
Transplantasjon
- Drepende irradiate BoyJ mus med en delt stråling dosering av 7.0 Gy etterfulgt av 4.75 Gy etter 3 h, før transplantasjon.
- Injisere 3 x 103 til 5 x 103 BCR-ABL1-LSK celler med 0,3 x 106 hjelper bone margtransplantasjon celler fra WT BoyJ mus via hale vene (IV) i bestrålt BoyJ mus.
- Fire uker posttransplantation, analysere mottaker mus for CD45.1 og CD45.2. Hente TMNC perifert blod ved halen blodåre blødning som beskrevet i trinn 7.4. Resuspend cellene i 100 µL FACS bufferen. Inkuber cellene med 1 µL hver av CD45.1-FITC og CD45.2-PE antistoffer ved romtemperatur 1t.
- Vask cellene ved å bringe opp til 3 mL med FACS buffer og spinne på 1200 x g ved 4 ° C for 5 min. fjerne nedbryting og resuspend det i 200 µL av 1 x PBS.
- Analysere prosentandelen på CD45.1 og CD45.2 ved første gating live cellene basert på fremover og side scatter, etterfulgt av gating FITC - og PE-positiv cellene basert på unstained kvinne prøven.
- Gruppere musene i fire grupper (n = 6 per gruppe). Starte behandling med imatinib (75 mg/kg 2 x daglig) alene og i kombinasjon med DFC + BCI (begge stoffene ble gitt i en dose av 10 mg/kg 2 x daglig).
- Likeledes behandler andre grupper med kombinasjoner av imatinib (75 mg/kg) + curcumin (150 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) og imatinib (75 mg/kg) + NDGA (100 mg/kg) + BCI (10 mg/kg) i tre måneder, 2 x en dag ved injisert IP
- Analysere mus 1 x en måned i seks måneder for leukemic chimerism ved å bestemme andelen CD45.2 positive celler i perifert blod av hale vene blødning som beskrevet i trinn 7.4.
9. i Vivo evaluering av BCI og DFC aktivitet
-
Phospho-p38 analyse
- Ta tre leukemic mus (8-12 uker gamle) som ble transplantert BCR-ABL1-uttrykke c-Kit+ cellene, som beskrevet i § 7. Injisere mus med BCI (10 mg/kg) ved å injisere IP fire uker posttransplant.
- Måle nivåene av phospho-p38 perifert blod TMNC bruke fosforylering flyt cytometri kit i henhold til leverandørens instruksjoner. Samle blod fra hver musen før og 6 h etter sprøytebruk. Isolere i TMNCs ved RBC uttømming og fikse dem som følger.
- Legge til 4 mL RBC lysis løsning per 100 µL av perifert blod. Bland og ruge på is 5 min lyse RBCs. spinn ned cellene på 1200 x g i 5 min på 4 ° C og fjerne nedbryting. Gjenta lysis 1 x mer.
- Det andre trinnet lysis vaskes celle pellets med 1 mL av 2% BSA i PBS. Fastsette cellene ved å legge til 100 µL fiksering og permeabilization løsninger og ruge etter 20 min på 4 ° C i mørket. Pellets cellen med sentrifugering 1200 x g i 5 min på 4 ° C.
- Vask pellets med 1 mL 1 x permeabilization vask. Blokkere cellene av tilføyer 300 µL av 2% BSA inne permeabilization vaskebuffer ved romtemperatur for 20 min. dele cellene i tre like dele 100 µL (~ 1 x106).
- Til hver aliquot fast celler legge 1 µL totalt p-38 antistoff, 1 µL phospho-p38 antistoff eller 1 µL av isotype IgG kontroll, henholdsvis, og ruge over natten på 4 ° C.
- Vask cellene 1 x med 5 mL av 2% BSA i PBS og Inkuber med sekundær antistoff (1 µL av Alexa Fluor-488 konjugert) 1t ved romtemperatur. Vask cellene 1 x igjen og avbryte dem 200 µL av 1 x PBS.
- Hente data etter FACS og analysere dem ved flyt cytometri analyseprogramvare.
- Trekke MFI i kontrollen IgG fra MFI eksperimentelle prøvene. MFI verdiene for phospho-p38 deretter normalisert for totalt p-38 å bestemme phospho-p38 nivåer etter BCI injeksjon.
-
Kvantitativ gene expression analyse av c-Fos målet gener
- Ta tre leukemic mus (8-12 uker gamle), som ble transplantert BCR-ABL1-uttrykke c-Kit+ cellene som beskrevet i § 7. Samle perifert blod fra hver musen og deretter injisere mus med 10 mg/kg hver DFC + BCI.
- Samle perifert blod 6 h etter sprøytebruk. Isolere TMNCs ved RBC utarming, som beskrevet ovenfor. Pellets til TMNCs og avbryte dem en fenol-baserte lyseringsbuffer (se Tabell for materiale).
- Utføre RT-qPCR analyse (som beskrevet i Seksjon 1) for Bcl2l11, Lif og IL-6 bruke gen-spesifikke primere (vist i tabell 1).
10. langsiktige kultur-starte cellen analysen
Merk: LTCIC analysen ble utført som beskrevet tidligere25.
- Vokse en mus fibroblast celle linje MS-5 i MEMα til confluency i en T175 vev kultur kolbe. Trypsinize cellene som beskrevet ovenfor for HEK293T. Suspendere cellene i MEMα på 2 x 106 celler/mL. Ta 10 x 106 celler i et 50 mL konisk rør og irradiate på 80 Gy. Fortynne cellene til 0,5 x 106 celler/mL i MEMα med 10% FBS (M10) media. Plate 2 mL per brønn i en 12-vel plate og ruge det i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator over natten.
- På den neste dagen, forberede hydrocortisone natrium hemisuccinate ved å løse opp 2,5 mg i 5 mL av MEMα (1 M løsning). Filter-sterilisere hydrocortisone løsningen bruker et 0,2 µm sprøyte filter i biosikkerhet panseret. Fortynne hydrocortisone av føljetong fortynning i MEM å få en 100 µM løsning. Legge til 250 µL av denne 25 mL av menneskelig langsiktige kultur medium (HLTM) (se Tabell for materiale) rett før bruk, for å oppnå en siste konsentrasjon på 1 µM.
- Spinne ned bruk-CD34+ og UCP3 TMNCs og avbryte dem i HLTM av kort vortexing, og bestemme teller ved en hemocytometer.
- Vakuum av M10 media fra 12-vel platen seeded med stroma celler og erstatte den med den 1 mL av pasienten celle (bruk-CD34+ [10.000] og UCP3 TMNCs [1 x 106]) suspensjon i HLTM. Bruk tre brønner per narkotika kombinasjon per celle type.
- Fortynne narkotika aksjer til 2 x av nødvendige konsentrasjonen i HLTM. Legg 1 mL av media med narkotika til ovennevnte cellene å få en 1 x narkotika konsentrasjon. Erstatt halvparten av media med nylagede HLTM hver uke i fem uker.
- På slutten av seks ukers LTC IC analysen perioden, samle nonadherent celler i et rør fra kulturer. Trypsinize tilhenger celler og kombinere dem med tilsvarende nonadherent celler.
- Vask celler og analysen for CFUs i methylcellulose middels inneholder 30% fosterets kalv serum, erytropoietin (3 enheter/mL), SF (50 ng/mL), og IL-3(20 ng/mL), IL-6 (20 ng/mL), G-CSF (20 ng/mL), og granulocytt/macrophage koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) (20 ng / mL). finne teller ved en hemocytometer.
- Plate 5 x 104 celler i tre gjentak. Fryse ned de gjenværende cellene i 20% FBS og 10% DMSO. Ordne paneler i en stor Petriskål med en åpen rett som inneholder vann i midten. Dekker store Petriskål nøye og ruge det i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator i to uker.
- Score koloniene to uker senere. I noen tilfeller, er bare en del av innhøstingen assayed for CFUs). Beregne summen av LTCIC i den første celle suspensjonen av ekstrapolere basert på CFUs fra en del av cellen høsting. Den CFU produksjonen per LTC IC er 8.
Merk: For eksempel hvis utgangspunktet 1 x 106 celler var belagt i en godt, etter fem uker, 0.5 x 106 celler ble høstet, for CFU, 5 x 104 celler var belagt og 50 CFUs ble oppnådd. Dette tilsvarer 500 CFUs/1 million belagt celler. Del dette nummeret av 8 å få LTCIC, som er 62,5.
11. humanized musemodell med bruk CD34+ celler
- Sublethally irradiate 8 uke gamle NIKK scid gamma musene, uttrykke menneskelige IL3, GM-CSF og SCF (NSGS), med en enkelt dose 7.0 Gy (700 rads) med 50 rads/min.
- Injisere 3 x 106 CD34+ merkede celler fra BCR-ABL1-positive bruk kronisk fase pasienter i bestrålt musene av intravenøs injeksjon.
- Etter to uker med transplantasjon, Bestem leukemic engraftment i benmargen av FACS med mus - og menneske-spesifikke antistoffer mot CD45.
-
Utføre en FACS analyse.
- Ta benmarg leveringstanken fra femurs av transplantert mus. Lyse RBCs bruker RBC lyseringsbuffer som beskrevet ovenfor og samle TMNCs med sentrifugering. Vask pellet 1 x med kaldt 1 x PBS.
- Blokkere cellene med menneskelige FcR blokk og mus FcR blokk etterfulgt av flekker med anti-human CD45 FITC og anti-musen CD45 APCCy7 overnatting på 4 ° C. Utføre FACS analyse på LSRII og analysere dataene med flyt cytometri analyseprogramvare.
- Gruppere musene i fire forskjellige kohorter (n = 6/gruppe) for behandling med kjøretøy, imatinib (75 mg/kg), DFC + BCI (både ved 10 mg/kg), eller imatinib (75 mg/kg) + DFC + BCI (både ved 10 mg/kg). Fortynne lager narkotika i 1 x PBS (vehicle) og administrere dem ved å injisere dem IP 2 x daglig.
- Behandle musene i seks uker og bestemme leukemic byrden annenhver uke, til uke 8 etter transplantasjon som beskrevet ovenfor i 11.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oncogene avhengighet har vært innblandet i terapeutiske effekten av TKIs. Men er mekanismer kjøring oncogene avhengigheten ikke forstått. Vi utførte flere upartiske gene expression analyser for å identifisere det genetiske komponenten involvert i orkestrering avhengighet. Disse analysene viste oppregulering av tre gener, c-Fos, Dusp1 og Zfp36, i celler som er ikke avhengig av kreftfremkallende Signaliser for overlevelse, og dermed er ufølsomme til TKI behandling. Downregulation c-Fos og Dusp1 av shRNA-mediert knockdown er tilstrekkelig til å gjenopprette narkotika følsomhet i ellers TKI-resistente celler.
For å validere rollen c-Fos og Dusp1 som terapeutiske mål i leukemi, var deres overuttrykte først bekreftet benytter BaF3 celler uttrykke BCR-ABL1-oncogene. Vekstfaktor signalering i BaF3-BA cellene opphever oncogene avhengighet; som en konsekvens, svarer de ikke til TKI behandling. Kvantitativ uttrykk analyse av RT-qPCR og vestlige blotting bekreftet at både c-Fos og Dusp1 er indusert av BCR-ABL1 og deres uttrykk er ytterligere forsterket av vekstfaktor IL-3 (figur 1A - 1 C).
Å studere rollen til c-Fos og Dusp1 i vivo, mus mangler c-Fos (betinget mus modell c-Fosfl/fl med Rosa26-CreERT2) eller Dusp1 (rett KO Dusp1- / -) og mus mangler både c-Fos og Dusp1 (Rosa26-CreERt2-Fosfl/fl/Dusp1- / - ) ble utviklet. Disse musene var genotyped av PCR bruker genomisk DNA fra halen, og PCR preges lett av c-Fosfl/fl, Dusp1 KO fra WT mus (figur 2A). Indusert sletting av c-Fos av tamoxifen behandling ble bekreftet av PCR, av utseendet på et band sammenlignet med ingen band i mus ikke behandles med tamoxifen (figur 2B).
For å teste rollen c-Fos og Dusp1, Ben margtransplantasjon-avledet c-Kit+ celler fra WT, Dusp1- / -, ble c-Fosfl/fl, og Dusp1- / -/c-Fosfl/fl isolert og transduced med MSCV-BCR-ABL1-Ires-YFP retroviruses; en skjematisk av prosedyren er vist i Figur 3. YFP+ uttrykke (brukt som en surrogat markør for BCR-ABL1 uttrykk) ble sortert etter FACS (Figur 4) for ytterligere i vitro (CFU) og i vivo analyser. Resultatene viser at sletting av c-Fos og Dusp1 alene hemmet CFU tall (< 50%). Interessant, celler mangler både c-Fos og Dusp1 var betydelig svekket i colony-forming evne, og imatinib behandling utryddet alle CFUs, tyder på at tap av c-Fos og Dusp1 er syntetisk dødelig BCR-ABL1 uttrykk (figur 5 ).
In vitro CFU analyser aktiverer forskere raskt teste fenotypen av KO og aktiviteten i små molekyl-hemmere. Men videre bekrefter i vivo analyse gyldigheten av målene. For i vivo validering benyttet vi først en rask signaltransduksjon transplantasjon modell1 hvor BCR-ABL1 forårsaker dødelighet innen to til tre uker. Femti tusen YFP-positive celler, sammen med 300.000-500.000 Ben margtransplantasjon-avledet mononukleære celler fra normal musen, ble injisert i drepende bestrålt mus å indusere CML. Mus bærer c-Fosfl/fl cellene eller c-Fosfl/flDusp1- / - celler ble injisert med tamoxifen etter 10 dager av transplantasjon slette c-Fos. Mus som fikk WT eller Dusp1- / - celler utviklet leukemi og bukket under for død innen to til fire uker, mens sletting av c-Fos alene viste en betydelig forsinkelse i sykdom utvikling og TKI behandling lagret nesten 50% av mus fra døden. Interessant, musene transplantert med celler mangler både c-Fos og Dusp1 overlevde lengre, og TKI behandling kurert alle mus i bruk (figur 6A - 6 C). Musene som overlevde gradvis mistet YFP+ cellene, som vist i c-Fos og dobbel KO når behandlet med imatinib (figur 6D-6F), foreslå rydding av BCR-ABL1 positive celler.
Gitt at bruk er en stilk cellen sykdom, og gitt russernes retroviruses målrette primitive og quiescent blodkreft cellene, er det viktig ville å teste om c-Fos og Dusp1 være tilstrekkelig til å eliminere leukemic stamceller. Tetracycline-induserbart BCR-ABL1 transgene mus der tTA er uttrykt ved en Scl enhancer, spesielt uttrykt i blodkreft stamceller, har vært tidligere benyttet for å studere rollen til målet gener i LSCs. Tetracycline-induserbart BCR-ABL1 transgene mus (figur 7A-7B) ble benyttet for å undersøke rollen c-Fos og Dusp1 i LSCs. LSK cellene fra disse musene ble sortert bruker FACS og injisert i mottakerens mus (figur 7C). Etter en måned av transplantasjon, ble leukemic engraftment scoret, etterfulgt av behandling. Leukemic byrden og nivåer av LSK var bestemt hver måned i seks måneder. Mus behandlet med imatinib alene viste undertrykkelse av leukemi, men ble igjen med MRD. Derfor resulterte seponering, som observert i klinikken, i sykdommen tilbakefall. Derimot mus behandlet med en kombinasjon av narkotika imatinib + DFC (c-Fos hemmer) + BCI (Dusp1 hemmer) utryddet helt leukemic celler, og mus ble kurert for bruk (figur 7 d og 7E).
Å etablere pharmaco-dynamisk lese-out for c-Fos og Dusp1 hemmere og å studere på målet virkning, phospho-p38 nivåer (en surrogat markør for Dusp1 hemming) ble målt og uttrykk for c-Fos-regulert gener, som IL-6, bcl2l11 og Lif, ble kvantifisert. Vi og andre har etablert at hemming av Dusp1 fører til aktivering av p38 (målt ved økt fosforylering av p38)13. Phospo-p38 nivåer ble målt ved FACS i hele-blod celler isolert fra narkotika-behandlet mus. Som forventet, phospho-p38-nivå økte (Figur 8A) og uttrykket av c-Fos-regulert gener (IL-6, bcl2l11 og Lif) var downregulated i narkotika-behandlet mus (Figur 8B). Disse resultatene tyder på at hemmere hemme deres mål og overlevelse av mus skyldes hemming av c-Fos og Dusp1.
For menneskelige relevans, effekten av c-Fos og Dusp1 hemmere ble testet med pasientprøvene i vitro (LTC-IC) og i vivo analyser (mus xenografts). Behandling med DFC + BCI er ikke effektiv på leukemic stamceller. Men utryddet en kombinasjon av DFC + BCI + imatinib selektivt leukemic stamceller i begge analyser skåner normal stamceller (figur 9A - 9 C). Disse resultatene etablere at c-Fos og Dusp1 er avgjørende for leukemic transformasjon, og opphøyet uttrykk for disse genene opphever oncogene avhengighet sykdommen tilbakefall og resistens. Derfor blir en kombinasjon målretting av c-Fos og Dusp1 sammen med driveren oncogene mer effektive og, kanskje, en helbredende strategi for mange kreft. Vi forventer at metodene som er beskrevet her kan generelt brukes for ekstra mål identifisering og validering.
Figur 1 : c-Fos og Dusp1 er overexpressed svar på vekstfaktor IL-3. qPCR analyse av en overuttrykte (A) c-Fos og (B) Dusp1 i cytokin-behandlet BaF3-BA celler. Relativ uttrykket ble bestemt etter normalisering til β-utgangen. Feilfeltene representerer standardavviket fra tre Repliker prøver. (C) Western blot analyse av BaF3-BA cellene behandlet med IL-3 og analysert med c-Fos totalt eller P-c-Fos og Dusp1 antistoff. Anti-utgangen antistoff ble brukt som laster inn kontroll. Dette tallet ble tilpasset med tillatelse fra Kesarwani et al.13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Genotyperingteknologi c-Fosfl/flDusp1 og Rosa grobunn-ER mus. (A) PCR analyse av halen DNA. Forventet band er fra WT eller c-Fosfl/fl-bærer CreER transgene og Dusp1 KO mus. Bandet størrelser angis til venstre. (B) PCR analyse av et mindre band etter sletting av c-Fos tamoxifen behandling. M = 1 kb + DNA stigen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Skjematisk av signaltransduksjon og transplantasjon modellen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : FACS viser frekvensen av YFP+ celler fra et transplantert og WT mus (negativ kontroll) blod. Toppen panelene viser et spredningsdiagram cellene og den gating. Den nedre paneler viser histogrammer for YFP vs siden scatter. Celler med en MFI av > 103 ble vurdert YFP +. Lignende gating ble brukt for bein margtransplantasjon celler etter signaltransduksjon beregner prosenten signaltransduksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Representant plater fra CFU plating. Platene viser koloniene farget med iodonitrotetrazolium chloride. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : c-Fos og Dusp1 mangler kompromiss leukemi utvikling. (A-C) Overlevelse kurver mus transplantert med c-Kit+ BCR-ABL1 celler fra WT, Dusp1- / -c-Fos- / -, og c-Fos- / - Dusp1- / - mus. (D-E) Andelen YFP + celler som bestemmes av FACS i perifert blod av transplantert mus trukket hver uke posttransplant. Nivåene av YFP øker og mus falt død WT og Dusp1 KO. Mus som gradvis miste YFP+ cellene som vist i c-Fos og dobbel KO når behandlet med imatinib. Dette tallet ble tilpasset med tillatelse fra Kesarwani et al. 13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : c-Fos og Dusp1 er nødvendig for overlevelsen av LSCs. (A) skjematisk av transgene brukes i transgene mus uttrykke BCR-ABL1 i stamceller. (B) eksperimentell design for å studere effekten av Dusp1 og c-Fos hemming av DFC og BCI jegn vivo. (C) FACS tomter av swing gating strategien brukes til sortering LSK celler for transplantasjon. (D) prosent BCR-ABL1 (bestemmes av andelen CD45.2 fra donor mus) positive cellene i mus under og posttreatment med hemmere. (E) FACS scatter tomter viser CD45 chimerism i levende celler og LSK celle batterirommet. Merk mangel på CD45.2 totalt og i LSK rommet i behandlet mus. Dette tallet ble tilpasset med tillatelse fra Kesarwani et al.13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: In vivo aktivitet DFC og BCI. (A) linje graf viser nivåene av phospho-p38 etter BCI behandling. (B) RT-qPCR viser uttrykk for c-Fos målet genene i perifert blod av mus etter DFC behandling. Prikkene representerer tre gjentak fra hver mus (n = 3). Tallet ovenfor grafene representerer p-verdien beregnet av Student t-test. Dette tallet ble tilpasset med tillatelse fra Kesarwani et al.13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9 : Rolle c-Fos og DUSP1 hemming i en menneskelig pasienten prøve. (A) prosent av CFUs bestemmes av LTC IC analysen fra to bruk pasienter, og en frisk donor behandlet med kjøretøy eller de angitte rusmiddelkombinasjoner. (B) prosent av menneskelige leukemic celler (hCD45) i beinmargen NSGS mus uke 2 (venstre) og uke 4 (til høyre) av behandlingen. (C) dette panelet viser representant FACS tomter viser en dramatisk reduksjon av hCD45 celler i narkotika-behandlet mus skåner musen celler vises som mCD45. Dette tallet ble tilpasset med tillatelse fra Kesarwani et al.13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For hoveddelen av kreftceller, er terapeutiske svaret TKI formidlet av en blokade av tyrosin kinase oncoprotein signaler som svulsten er avhengige av. Men er relativt lite kjent om hvordan et mindretall av kreftceller bidrar til MRD unnslippe oncogene avhengighet og terapi4. Studier viste at vekstfaktor signalering formidler resistens både leukemi og solid orgel svulster. Dette tyder på at ulike molekylære mekanismer kan grunn indre motstand10,11,12. Å forstå mekanismen og identifisere genet mål for terapeutisk utvikling, utført vi omfattende hele-genome uttrykket profiler med musen (BaF3) og menneskeceller (K562). Primære prøvene fra leukemic mus eller bruk pasienter ble ikke brukt fordi vi mistenkte at som primære benmarg prøver er betydelig heterogene, vil de maske identiteten til relevante gener/mål. Selv cellene renset av antistoff-mediert sortering (stamfar stamceller) viser betydelig heterogenitet. En renset cellen linje er derfor trolig bedre egnet for target identifikasjon å unngå uønskede kompleksitet pålagt av genetisk heterogenitet. Hele-genome uttrykk analysen identifiserte at c-Fos, Dusp1 og Zfp36 er ofte upregulated i narkotika-resistente celler. Når målene er angitt, blir deres godkjenningen en kritisk del å kjenne sin rolle i gitt genetisk sammenheng. Bruke cDNA overuttrykte og genetisk knockdown studier i BaF3 celler avdekket at hemming av c-Fos og Dusp1 er tilstrekkelig og nødvendig for effektiv TKI følsomhet. Kanskje er en av de viktigste trinnene i målet validering å validere relevansen av identifiserte gener/mål i primære prøvene fra både mus og menneske. I denne protokollen, vi tilbyr trinnvis utnyttelse av flere genetiske modeller og gi bedre mekanistisk innsikt for ytterligere avgrensningen av stoffet/target evaluering.
En rask screening på cellenivå bruker CFUs eller LTCIC analysen hjelper forskere å teste flere rusmiddelkombinasjoner, samt konsentrasjoner raskt før du går til mer tidkrevende transplantasjon metoder. Gitt at bruk er en stilk cellen sykdom, og gitt russernes retroviruses målrette primitive og quiescent blodkreft cellene, er det viktig å teste med modeller som svarer til deres rolle i Lexmarks Løsningssenter overlevelse. For å løse dette, utnyttet vi tetracycline-induserbart BCR-ABL transgene musen der tTA er uttrykt ved en Scl enhancer. Likevel er genetisk modeller mangelfull i recapitulating menneskelige sykdommen. Derfor er det nødvendig å teste primære pasientprøvene i humanized musen modeller. For å kunne gjøre en langvarig studie for påvisning av MRD over tid, en stabil xenograft er imidlertid nødvendig som typer, kan variere avhengig av mus og celle. Etter fire måneder av transplantasjon, var menneskelige CD34 + cellene utarmet selv uten behandlingsapparatet, som er en begrensning i mest humanized musen modeller. Bedre humanized musen modeller er utviklet for å teste de menneskelige cellene i mus26. Vi anbefaler å bestemme på målet aktiviteten til hemmere som noen off-målet effekt kan føre giftighet til normale celler, begrense sitt videre program. Men hvis nedstrøms målet ikke er kjent, skal ulike tilnærminger benyttes. For eksempel kan identifisere narkotika-resistente mutantene bruker tilfeldige mutagenese av målet protein direkte adresse enten inhibitor er på målet27.
Protokollen presenteres her gir en omfattende metode for mål identifisering og validering bruker flere i vitro og vivo modellsystemer. Disse metodene kan lett tilpasses andre mål og typer kreft. Videre mekanistisk studier identifisert mål og raffinement i stoffet målretting kan bidra i utviklingen bedre terapeutiske modaliteter for effektiv og/eller helbredende behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlig til G. Q. Daley for å gi BaF3 og WEHI cellene T. Reya for den MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP konstruksjoner. Forfatterne er takknemlige til M. Carroll for å gi pasientprøvene fra bruk blast krisen. Denne studien ble støttet av tilskudd til M.A. fra NCI (1RO1CA155091), leukemi Research Foundation og V Foundation, og NHLBI (R21HL114074-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biological Materials | |||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| IMDM | Cellgro (corning) | 15-016-CVR | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | Takara | T100B | |
| MethoCult GF M3434 (Methylcellulose for Mouse CFU) | Stem Cell | 3434 | |
| MethoCult H4434 Classic (Methylcellulose for Human CFU) | Stem Cell | 4434 | |
| 4-Hydroxytamoxifen | Sigma | H6278 | |
| Recombinant Murine SCF | Prospec | CYT-275 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Prospec | CYT-340 | |
| Recombinant Murine IL-6 | Prospec | CYT-350 | |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| DFC | LKT Laboratories Inc. | D3420 | |
| BCI | Chemzon Scientific | NZ-06-195 | |
| Imatinib | LC Laboratory | I-5508 | |
| Curcumin | Sigma | 458-37-7 | |
| NDGA | Sigma | 500-38-9 | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1x | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1x PBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | 5 mg/mL stock in water |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma | S9390 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5 mg/mL stock in water |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45 μM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70 μm nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| FICOL (Histopaque 1083) (polysucrose) | Simga | 1083 | |
| PBS | Corning | 21040CV | |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | CO-RO | |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 2 | Sigma | P5762 | |
| Nitrocullulose Membrane | Bio-Rad | 1620115 | |
| SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate) | Thermo Scientific | 34075 | |
| CD5 | eBioscience | 13-0051-82 | |
| CD11b | eBioscience | 13-0112-75 | |
| CD45R (B220) | BD biosciences | 553092 | |
| CD45.1-FITC | eBioscience | 11-0453-85 | |
| CD45.2-PE | eBioscience | 12-0454-83 | |
| hCD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | |
| Anti-Biotin-FITC | Miltenyi | 130-090-857 | |
| Anti-7-4 | eBioscience | MA5-16539 | |
| Anti-Gr-1 (Ly-6G/c) | eBioscience | 13-5931-82 | |
| Anti-Ter-119 | eBioscience | 13-5921-75 | |
| Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7 | BD | 558612 | |
| CD117 APC | BD | 553356 | |
| BD Pharm Lyse | BD | 555899 | |
| BD Cytofix/Cytoperm (Fixing and permeabilization solution) | BD | 554714 | |
| BD Perm/Wash (permeabilization and wash solution for phospho flow) | BD | 554723 | |
| phospho p38 | Cell Signaling Technologies | 4511S | |
| total p38 | Cell Signaling Technologies | 9212 | |
| Mouse IgG control | BD | 554121 | |
| Alexa Flour 488 conjugated | Invitrogen | A-11034 | |
| Calcium Chloride | Invitrogen | K278001 | |
| 2x HBS | Invitrogen | K278002 | |
| EDTA | Ambion | AM9261 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Blood Capillary Tubes | Fisher | 22-260-950 | |
| Blood Collection Tube | Giene Bio-One | 450480 | |
| Newborn Calf Serum | Atlanta biological | S11295 | |
| Erythropoiein | Amgen | 5513-267-10 | |
| human SCF | Prospec | CYT-255 | |
| Human IL-3 | Prospec | CYT-210 | |
| G-SCF | Prospec | CYT-220 | |
| GM-CSF | Prospec | CYT-221 | |
| MyeloCult (media for LTCIC assay) | Stem Cell Technologies | 5100 | |
| Hydrocortisone Sodium Hemisuccinate | Stem Cell Technologies | 7904 | |
| MEM alpha | Gibco | 12561-056 | |
| 1/2 cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100 mg/mL stock in water |
| Bacto agar (agar) | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Doxycycline chow | TestDiet.com | 52662 | modified RMH1500, Autoclavable 5LK8 with 0.0625% Doxycycline |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Iodonitrotetrazolium chloride | Sigma | I10406 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| GoTaq Green (taq polymerase with Green loadign dye) | Promega | M1722 | |
| miRNeasy Mini Kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 217084 | |
| DNA Free Dnase Kit (DNAse treatment for RT PCR) | Ambion, Life Technologies | AM1906 | |
| Superscript III First Strand Synthesis (reverse transcriptase for cDNA synthesis) | Invitrogen | 18080051 | |
| SYBR Green (taq polymerase mix with green interchalating dye for qPCR) | Bio-Rad | 1725270 | |
| CD117 MicroBead Kit | Miltenyi | 130-091-224 | |
| Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay | Stemp Cell Technologies | ||
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor cetrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | ||
| C-1000 Thermal cycler | Bio-RAD | ||
| Mastercycler Real Plex 2 | Eppendorf | ||
| ChemiDoc Imaging System (imaging system for gels and western blots) | Bio-RAD | 17001401 | |
| Hemavet (boold counter) | Drew-Scientific | ||
| LSR II (FACS analyzer) | BD | ||
| Fortessa I (FACS analyzer) | BD | ||
| FACSAriaII (FACS Sorter) | BD | ||
| Magnet Stand | Miltenyi | ||
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA | Mark I Model 68A | source Cs 137 |
| Mice | |||
| ROSACreERT2 | Jackson Laboratory | ||
| Scl-tTA | Dr. Claudia Huettner’s lab | ||
| BoyJ | mouse core facility at CCHMC | ||
| C57Bl/6 | Jackson Laboratory | ||
| NSGS | mouse core facility at CCHMC | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/- | Made in house | ||
| ROSACreERT2/c-Fosfl/fl | Made in house | ||
| Cells | |||
| BaF3 | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| WEHI | Gift from George Daley, Harvard Medical School, Boston | ||
| CML-CD34+ and Normal CD34+ cells | University Hospital, University of Cincinnati |
References
- Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247, 824-830 (1990).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).
- Mahon, F. X., et al. Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial. Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).
- O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia. Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).
- Rousselot, P., et al. Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years. Blood. 109, 58-60 (2007).
- Krause, D. S., Van Etten, R. A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock". Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).
- Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).
- Weinstein, I. B. Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer. Science. 297, 63-64 (2002).
- Corbin, A. S., et al. Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).
- Straussman, R., et al. Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion. Nature. 487, 500-504 (2012).
- Wilson, T. R., et al. Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors. Nature. 487, 505-509 (2012).
- Kesarwani, M., et al. Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia. Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).
- Zhang, J., et al. c-fos regulates neuronal excitability and survival. Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).
- Dorfman, K. Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts. Oncogene. 13, 925-931 (1996).
- Padhye, S., et al. Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice. Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).
- Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).
- Zhang, B., et al. Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate. Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).
- Koschmieder, S., et al. Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis. Blood. 105, 324-334 (2005).
- Abraham, S. A., et al. Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells. Nature. 534, 341-346 (2016).
- Li, L., et al. Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib. Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).
- Qiagen-miRNAeasy kit. , Available from: https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources (2018).
- DNA-free DNA removal kit. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s (2018).
- SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051 (2018).
- Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html (2018).
- Abarrategi, A., et al. Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches. Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).
- Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
