Summary
여기, 우리는 실험 프로토콜 바인딩 선호도 동시에 측정 하 여 고정된 고체 지원 bilayers (SLB)와 A2 annexin 레이블 없는 인지질-바인딩 단백질의 상호 작용의 모드를 결정 하기 위해 사용할 수 있는 현재는 대량 통풍 관 및 단백질 annexin a 2의 점 탄성 속성.
Abstract
되는 낭비 적인 크리스털 중량 기술은 간단 하 고 레이블 없는 접근 방식을 동시에 통풍 관 및 점 탄성 물성 상호 작용의 측정을 허용 하는 센서 표면에 흡수/움직일 질량의 측정 단백질 지질 bilayers, 실시간에서 같은 단단한 지원 표면, 그리고 높은 감도. Annexins는 칼슘 이온의 조화를 통해 부정 청구 headgroups와 역 상호 작용 하는 인지질-바인딩 단백질의 높은 보존된 그룹. 여기, 우리가 양적 annexin a 2의 바인딩 분석을 고용 했다 프로토콜 설명 (AnxA2) 평면 지질 bilayers 석 영 센서의 표면에 준비를. 이 프로토콜 강력 하 고 재현할 수 데이터를 최적화 하 고 자세한 단계별 설명을 포함. 메서드는 다른 막 바인딩 단백질과 bilayer 작곡에 적용할 수 있습니다.
Introduction
세포 막에는 매우 역동적이 고 복잡 한 구조입니다. 막 지질, 함께 주변 및 integrally 관련된 막 단백질의 복합 혼합물 형태 microdomains를 조립 한다. 이러한 멤브레인 microdomains의 조정된 템포 공간 조직 주요 생리 적 프로세스1에 포함 된다. 막 microdomain 역학의 막 지질 작용 뿐만 아니라 인식 하 고 여기서는 microdomains에 농축 지질 주변 막 단백질의 능력에 의해 구동 됩니다. 특정 지질 단백질의 신규 모집은 종종 달성 을 통해 지질 인식 모듈, pleckstrin 상 동 (전화) 또는 C2 도메인2,3등. 생물 분석 방법 막 모델을 사용 하 여 분자 수준에서이 프로세스를 제어 하는 기본 원리를 이해 하는 열쇠는.
Annexins, 큰 multigene 가족, 캘리포니아2 +에서 부정 청구 막 지질, 주로 phosphatidylserine (PS), 바인딩할 그들의 능력에 대 한 잘 알려져 있습니다-제어 방식2. Annexin 가족의 두 번째 특징은 보존된 구조 세그먼트의 존재는 annexin 반복, 즉 현재 4 또는 8 시간 및 캘리포니아2 +-및 인지질 바인딩 사이트4항구. 캘리포니아2 +-종속 지질 상호 작용을 감지 하 고 전달 캘리포니아2 +완벽 한 위치에는 annexins를 배치-중재 대상 세포 막 신호. 일관 되 게, annexins microdomains 세포 및 인공 막 시스템5둘 다 콜레스테롤, phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (PI (4, 5) P2), 및 PS, 농축의 형성을 유발 할 수 있습니다. 이 프로토콜에는 크리스털 중량 분산 (QCM-D)6,,78을 사용 하 여 annexin 막 상호 작용을 분석 하는 방법을 설명 합니다.
이 중량에 구성 하는 기본 요소는 진동 크리스탈 센서 표면 역할 이다. 흡착 및 바인딩 센서 표면에 분자의 질량에 있는 증가에 비례하여 공명 주파수 (f) 감소 합니다. 표면 균일 하 게 필름으로 코팅 되어, 추가 물질의 바인딩이이 계층의 구조적 무결성을 방해할 수 있습니다 그리고 점 탄성 (에너지 손실 계수 D)에서 이러한 변화는 또한 감시 될 수 있다. 이것은 지질 bilayers와 단백질의 상호 작용을 공부 하는 광범위 한 기술 이다. 이 방법에서는, 지질 소포는 적절 하 게 코팅된 센서 표면에 흡수 된다. 지질 bilayer 형성은 실리 카 기반 자료9,10, 유리한 소포 자주 하지 다른 친수성 표면에 파열 할 금11 UV 오존 노출, 티 오212또는 알 후 산화와 같은 2O313. 병합 vesicles의 파열 질량 및 분산 특성 변화를 선도 하는 수성 단계를 해제 합니다. 고체 지원 (SLB) bilayers 소포 융해에 의하여의 생성은 간단 하 고 강력한 고 모방 세포 막 복잡 한 모델을 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.
되는 낭비 적인 크리스털 중량 레이블 및 중요 한 기술입니다. 주요 이점은 따라서 광범위 한 다양 한 연구 분야에 응용 프로그램을 제공 하는 표면에 충분히 박막을 생성 하는 어떤 물자 든 지 코트 가능성 이다. 단백질 막 상호 작용에서 관찰은 실시간, 그리고 결과 직접 분석할 수 있습니다. 동일한 센서 표면 (수행한 후 최소한의 청소이 프로토콜에서 설명), 후속 측정에 사용할 수 있습니다 따라서 정확한 내부 통제 및 analytes 사이 comparability에 대 한 허용.
Protocol
참고: 0.22 μ m 필터를 사용 하 고 1 시간에 대 한 진공에 의해 degassed 버퍼 필터링 할 합니다.
1. 지질 기 준비
- 2 mL 유리 튜브를 사용 합니다. 각 지질 분해 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (아빠), 그리고 클로 프롬의 혼합물에 (철), 콜레스테롤 / 메탄올 (50: 50 v/v) 분명 5mm 지질 솔루션을 준비 하. 클로 프롬/메탄올/물 (20:9:1 v/v)의 혼합물에 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-myo-inositol-4',5'-bisphosphate) (PI (4, 5) P2)을 용 해.
- POPC/팝 (80/20), POPC/PI (4, 5) P2 의 원하는 어 금 니 비율에서 녹은 지질 결합 (95/5), POPC/팝/철 (60/20/20), POPC/팝/PI (4, 5) P2/Chol (60/17/3/20), 및 POPC/DOPC/팝/PI (4, 5) P2/Chol (37/20/20/3/20) ( 표 1) 10 mL 유리 튜브.
참고: 총 지질의 최종 금액은 500 µ g. - 질소의 건조 스트림을 사용 하 여 유기 용 매를 증발. 3 h 용의 모든 잔여 자취를 제거를 위한 높은 진공 (동결은) 시스템에 지질 혼합물을 남겨 주세요.
참고:이 결과 건조 분명 영화. - 구 연산 염 버퍼 (10mm trisodium-시트르산, 150 m m NaCl, pH 4.6)의 1 mL에서 지질 필름을 resuspend. 물 목욕, 소용돌이에 30 분 동안 60 ° C (이 온도 약 10 ° C의 혼합물에서 높은 녹는 지질 위상 전환 온도 이상)에서 지질 정지를 품 어 그것은 적극적으로 모든 5 분.
참고:이 대형, multilamellar 소포 (MLVs)의 형성 결과입니다. 전환 온도 이상 정지를 유지. - 예 열 (이 경우에 60 ° C)에서 압출 기 30 분에 대 한 전환 온도 (이 여기는 40-50 ° C) 위에 50 nm 직경 구멍 크기 폴 리카 보 네이트 막 장착.
- MLV 정지 preheated 압출 기에 로드 하 고 부드럽게 작은 unilamellar 소포 (Suv)14를 폴 리 카보 네이트 막 통해 혼합물 31 x를 통과. 전이 온도 이상의 온도 유지.
- 2 mL 플라스틱 반응 배 SUV 정지 전송 및 구 연산 염 버퍼 추가 (단계 1.4 참조) 2 mL를 최종 볼륨을가지고.
참고:이 250 µ g/mL의 최종 지질 농도 얻을 것입니다.
2. 처리 석 영 센서
참고: 항상 석 영 센서는 족집게를 처리 합니다.
- 4 품 어 센서 삽입에 ≥ 30 분 세척에 대 한 2 %SDS 솔루션에 소계 홀더 그들 광범위 하 게 완전히 제거 하는 SDS 고 그들이 말리 면 건조 아르곤 또는 질소의 스트림을 사용 하 여 매우 순수한 물으로.
- 플라즈마 클리닝 시스템을 사용 하 여 어떤 오염 물질을 완전히 제거. 플라즈마 청소 챔버에 건조 센서를 삽입 하 고, 챔버, 철수 하 고 그것을 플러시 산소와 3 배. 플라스마 설정에 청소기. 다음 프로세스 매개 변수를 사용 하 여: 1 x 10-4 Torr 압력, 높은 무선 주파수 (RF) 전력 및 프로세스 시간 10 분. 컴퓨터를 끄고 꺼내 센서.
3. 중량 작업
참고: 중량 시스템 병렬 구성, 연동 펌프에 연결 하 고 80 µ L/분의 유량으로 설정에 4 개의 온도 제어 흐름 챔버와 함께 사용 되었다. 오픈 흐름 모드에서 버퍼 받는 탱크로 급지대 저수지에서 펌핑 했다. 루프 모드에서 받는 탱크 폐쇄 루프를 생성 하는 피더 저수지와 연결 되었다. 온도 20 ° c.로 설정
- 신중 하 게 도킹 플라즈마 청소 센서 4 흐름 챔버에 핀셋을 사용 하 여. 어떤에 압력 또는 약 실 및 누수가 발생할 수 있는 튜브의 비틀림을 피하십시오.
- 시트르산 버퍼 (10mm trisodium-시트르산, 150 m NaCl, pH 4.6 m) 10 분 오픈 흐름 모드에서 시스템을 플러시.
참고:이 버퍼의 정확 하 게 3.2 mL를 필요 하지만 그것은 버퍼 (10 mL) 초과 사용 하는 것이 좋습니다. - 프로그램을 시작 합니다. 주파수와 첫 번째 기본 톤의 변경한 녹음을 시작 (n = 1) 및 상 음 (n = 3-13) 주파수와 소비 기준을 안정 될 때까지 소프트웨어를 사용 하 여 (이 약 40-60 분을 걸릴 것 이다).
참고: 주파수 잡음 레벨 (피크-피크)는 0.1·10 보다 낮은 소비에 대 한, 그리고 0.5 Hz 보다 낮은 되어야 합니다.-6, 1/h 주파수 0.3·10의 (수 용액)에서 최대한 드리프트로 분산/h-6. - 베이스 라인은 안정, 시트르산 버퍼 (2 mL 작은 관)에 SUV 정지 적용. 반응 배를 사용 하 여, 죽은 양의 1.5 mL를 제거 합니다. 다음 루프 흐름 모드에서 시스템을 닫습니다. 또 다른 10 분 동안 주파수/소비 변화를 기록 합니다.
참고:이 기간 동안에 소포 SiO2 표면에 확산 되며 연속 bilayer15,16 ( 그림 1, 그림 2및 그림 3에서 단계 2)를 융합. 센서의 표면에 Suv 흡착 2 phasic 이며 전형적인 주파수 최소 및 최대는 분산에 있다. 26-29 Hz에서 (지질 구성)에 따라 특성 주파수 변화는 안정적인 새로운 주파수/분산 베이스 표면에 연속 bilayer를 나타냅니다 ( 표 1참조). - SLB는 안정 (단계 3.4 참조) 시스템에 필요한 캘리포니아2 + 농도 (까지 50 µ M에서 최대 1 mM CaCl2, 실험에 따라)에 대 한 오픈 흐름 모드에서 실행 중인 버퍼 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4)을 equilibrate 40 분입니다.
- 단백질을 추가 (여기, AnxA2)는 실행 버퍼 포함 캘리포니아2 + (단계 3.5 참조). 평형 안정 상태 ( 그림 1, 그림 2및 그림 3의 3 단계)에 도달할 때까지 루프 흐름 모드에서 단백질의 응용 프로그램을 수행 합니다.
참고: 단백질 농도 범위는 수 있습니다 1에서 400 nM. 단백질 흡착 반영 질량 (단백질) 흡착 농도 의존 주파수 변화에서 발생 합니다. - 5 m m EGTA 오픈 흐름 모드 ( 그림 1 과 그림 2에서 단계 4)에서 실행 중인 버퍼에 캘리포니아2 + 이온을 킬레이트 화 하 여 바인딩된 단백질을 분리.
참고: 주파수의 분산 SLB 기준선을 복구 단백질 바인딩의 총 가역을 나타냅니다. 다른 농도 또는 단백질 비교 하 협회 분리 사이클을 반복할 수 있습니다.
4입니다. 중량 청소
참고: 각 측정 후 최소한의 청소 절차를 수행 합니다.
- 재생성 ddH2O 연속 오픈 흐름 모드에서의 50 mL와 중량 시스템, 물 컨테이너에서 튜브를 제거 하 고 건조를 실행 하는 시스템.
- 조심 스럽게 크리스탈 센서를 제거 하 고 2 %SDS 솔루션 소계 홀더를 사용 하 여 청소 (단계 2.1 참조).
- 센서 배치 했다 흐름 모듈 인테리어의 보이는 부분을 건조.
참고: 일련의 10 측정 절차를 청소 집중적인을 수행 합니다. - 세제와 확장 된 접촉에 대 한 20 µ L/분의 유량을 사용 하 여 연속 오픈 흐름 (튜브) 모드에서 40 ° C (소프트웨어에서 설치)에서 2 %SDS 솔루션 (50 mL) 시스템을 청소.
- DdH2O 160 µ L/min 흐름 속도로 연속 오픈 흐름 모드의 250 mL를 청소 합니다.
참고: 4 개월 후, 제조업체의 설명서에 따라 광범위 한 청소 절차를 수행 합니다.
Representative Results
공 진 주파수 (δ)에서 감소 Sauerbrey 방정식에 의해 정의 된 흡착된 질량 (Δm)와 선형 방식에 연관 시킵니다. 17
여기, f 공명 주파수, Cf 는 주어진된 석 영과 공 진 주파수의 형상 및 물리적 특성에 의존 하는 상수 이며 A 센서 표면 영역입니다.
대부분의 응용 프로그램에서 흡착된 층 점 탄성 하지만 완전히 딱딱한 아니다. 석 영 센서 진동의 결과 감쇄 라고 하 분산 (D). 모니터링된 소비 변화 (ΔD) 바인딩된 대량18 점 탄성 속성을 연관 되며8을정의 다음과 같습니다.
여기, 전자방출 한 발진 기간 동안 손실 에너지 이며 자유롭게 진동 센서의 총 에너지는 전자저장 .
분석 하 고 바인딩 매개 변수를 계량, 주파수 등온선 평형 주파수 변화 (ΔΔfe) 단백질 농도 대 한 플롯에 의해 파생 됩니다. ΔΔfe 로 정의 됩니다.
여기, δt 1 는 단백질 흡착과 δt 2 평형 상태의 시작을 나타냅니다. 비선형 커브 피팅6,8다음과 같이 Langmuir 방정식의 언덕 확장을 사용 하 여 수행할 수 있습니다.
여기, ΔΔf최대 최대 (포화) 바인딩 결과로 단백질 농도의 ΔΔfe , Kd 는 복잡 한, 단백질/멤브레인에 대 한 명백한 분리 상수 이며 n은 언덕 계수.
힐 계수 (n) 바인딩의 cooperativity에 설명합니다. N = 1, 힐 흡착 모델은 간단한 Langmuir 등온선 (동등한 바인딩 사이트 및 모든 분자 바인딩할 서로 독립적으로 지질 bilayer). N ≠ 1, 바운드 ligand 바인딩 다른 ligands에 대 한 선호도 막 변경, 하나 (n > 1, 긍정적인 cooperativity)를 증가 또는 감소 (n < 1, 네거티브 cooperativity) 선호도.
그림 1 실험 워크플로 동안 캘리포니아2 +공명 주파수에 교대를 측정 하는 우리의 실험실에 있는 사용의 회로도 보여준다-종속 바인딩 및 액체 단계에 있는 지질 bilayer에 AnxA2의 릴리스. 모범적인 녹음은 그림 2에 표시 됩니다. 그림 2 A 주파수 곡선의 녹음 고 그림 2B 분산 교대. 리 (그림 2A [1 단계])의 추가 따라 주파수에 눈에 띄는 드롭 그들의 흡착을 나타냅니다. 때문에 버퍼 가득 vesicles은 딱딱한, 하지만 점 탄성, 고 소비 증가 (그림 2B [단계 1]). 그 후, 병합 소포 파열. 안정적인 고원 (그림 2A [2 단계])에 도달할 때까지 수 반하는 릴리스는 소포 내부 버퍼의 흡착된 질량을 감소 합니다. 메모의 소포 추가 결과 높은 소비 변화는 bilayer에 대 한 응답에 변화는 SLB (그림 2B [2 단계])의 경직 된 동질적인 특성으로 인해 훨씬 작은. 단계 그림 2A 및 2B 기록 3 AnxA2의 바인딩 명확한 주파수 변화에 의해 보이는 것과 같이 질량을 추가 하지만 bilayer 구조와 방해 하지 않는, 지질, 소비에만 작은 변화에 의해 표시 된 대로. 캘리포니아2 + chelating 에이전트 EGTA (그림 1 및 그림 2 [단계 4])에 의해 제거, AnxA2 지질 영화에서 dissociates. 소산 녹음 뿐만 아니라 주파수, AnxA2 바인딩 Ca에 완전히 의존을 나타내는 bilayer (비교 2 단계와 4 단계 그림 2A와 2B)와 본 수준에 이동2 + 와 그 지질 영화 그대로 남아 있습니다.
AnxA2, 가장 할 추 등 부정 청구 지질에 따라 annexins의 이것은 명확 하 게 볼 때 아빠는 결 석 지질 bilayer (그림 3)에서. 그림 3 A 주파수 곡선의 녹음 고 그림 3B 분산 교대. 참고-25 Hz에서 안정 된 기준 주파수 이동 아직 소실 되지 않습니다 적절 한 bilayer 형성 (그림 3B [단계 2]), 표시 변경. 그러나, 주파수 (그림 3A) 또는 분산 (그림 3B) 변경 후의 캘리포니아2 + (그림 3A 와 3B [3 단계]) AnxA2의 추가 또는 EGTA (그림 관찰 된다 3A 및 3B [단계 4]), AnxA2 지질 영화 상호 작용할 수 없습니다.
그림 1 : 실험 워크플로의 그래픽 모델. 이 워크플로 보여줍니다 친수성 센서 표면 (1 단계), 소포 흡수 기 퓨전/파열 SLB 형성 (2 단계), 및 캘리포니아2 +-종속 흡착 (3 단계) 및 AnxA2의 탈 착 EGTA 종속 (4 단계). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 모범적인 녹음. 이러한 패널 표시 (A) 7 상 음 공명 주파수의 시간에 따른 모니터링 및 (B)는 분산 측정 중 석 영 센서의 교대. 리의 응용 프로그램 소비 기준 (1 단계) 증가 하는 반면 주파수 기준선의 급속 한 드롭을 하면 됩니다. 기준의 안정화 bilayer (2 단계)의 형성을 나타냅니다. AnxA2 (200 nM) 흡착 (존재 캘리포니아2 +) 포함 하는 POP 지질 bilayer에 분산, 지질 영화 불안정 하지 나타내는 (3 단계)를 크게 변경 하지 않고 대량 추가. 캘리포니아2 + chelation EGTA와 시 주파수 기준선의 복구 (단계 4) 단백질의 총 탈 착을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 는 AnxA2에 바인딩되지 않기 SLBs 아빠의 부재에서 보여주는 부정적인 제어 실험. 이러한 패널 리와 SLB 형성 (단계 1 및 2)의 추가 보여줍니다. AnxA2의 추가 후 변경 (A) 주파수 또는 (B) 소비는 명백한 (단계 존재 캘리포니아2 +3, 200 nM) 또는 EGTA (4 단계). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 구성 | ΔΔF/Hz SLBs의 형성 후 | ΔΔD * 10-6 SLB의 형성 후 |
| POPC/팝 (80: 20) |
26.3 ± 0.2 | 0.26 ± 0.03 |
| POPC/PI (4, 5) P2 (95: 5) |
26.5 ± 0.5 | 0.31 ± 0.02 |
| POPC/팝/철 (60: 20: 20) |
29.2 ± 0.2 | 0.45 ± 0.09 |
| POPC/팝/PI (4, 5) P2/Chol (60: 17: 3시 20분) |
29.6 ± 0.6 | 0.43 ± 0.10 |
| POPC/DOPC/팝/PI (4, 5) P2/Chol (37: 20: 20: 3시 20분) |
29.4 ± 0.4 | 0.39 ± 0.14 |
표 1: 지질 구성과 형성 데이터는 SLB의 7 .
Discussion
양적 및 질적으로 모두 세포 막의 구조-기능 관계에 관한 질문에 대답, 세포 생물학 생물 접근의 사용에서 대단히 잘 설립에 따라 이익과 널리 이용 되는 기법 원자를 포함 하 여 현미경 검사 법 (AFM), 표면 플라스몬 공명 (SPR), 고 QCM D 기술을 여기에 고용. 우리는 캘리포니아2 +에서 annexin 단백질 바인딩 이전 연구에서 보여주었다-높은 선호도와 고정된 막에 의존 방식으로. 우리가 사용 하는 주파수 및이 검출 감도 진동 안정성의 좋은 타협을 나타냅니다 때문에 소비 7 상 음 (Δf7)의 교대.
이 기술은 또한 막 단백질 상호 작용의 양적 설명을 허용합니다. 막에 AnxA2 바인딩 보존된 annexin 핵심 도메인에 의해 중재 되 고 콜레스테롤의 존재에 따라 긍정적인 cooperativity 특징 이다. AnxA2와 AnxA8에 보고 됩니다 위한 얻은 정량적 데이터 자세히 다른6,8.
이 프로토콜에는 많은 중요 한 단계가 있습니다. 에 리를 사용 하 여 즉시; 그렇지 않으면, 작은 소포 적은 표면 장력, 지질 bilayer 형성의 억제에 지도 함께 더 큰 소포에 융합 될 수 있습니다. 측정 하는 동안 일정 한 온도 유지 합니다. 온도 있는 작은 탈 각 하지 무시할 주파수와 소비 변화에 발생합니다. 공기 방울; 방지 그렇지 않으면, 시스템은 불안정 하 고 초기 계획을 설정 하지 않습니다.
Sauerbrey 방정식에는 관찰 된 주파수의 직접 변환 질량에서 변화에 변경 하 고, 따라서, 널리 사용 되는 수 있습니다. 그러나, 공 진 주파수에 변화 그리고 추가 질량 사이의 선형 상관 관계의 가정에만 센서 표면에 견고 하 고 균일 한 필름을 형성 하는 구성 요소에 대 한 진정한 보유. Sauerbrey 방정식 점 탄성 adsorbents 물 풍부한 단백질 영화, 통합 물, 지질 층 등에 사용할 수 없습니다 또는 심지어 세포를 흡착. 여기, 더 복잡 한 수학적 모델은 필요. 따라서, 동시에 주파수와 소비 변화를 모니터링 하는 매우 중요 하다. 측정 도중 구조적인 변화를 감지, δ 비율 대 ΔD 그릴 수 있습니다, 구조적 변경 나타내는 직선으로.
이 기술의 주요 장점은 기판으로 매우 광범위 한 재료를 사용 하는 가능성입니다. 또한, 그것은 안정적이 고 직접적인 방법은 더 단백질 지질 상호 작용 뿐만 아니라 표면 코팅 필름 (SLB), 등의 적절 한 형성으로 다양 한 고분자 상호 작용을 공부 하는 온라인으로 모니터링할 수 있습니다.
이 프로토콜 수에 적용 다른 상호 작용 하는 막 단백질, 예를 들어 도메인 단백질19, 바 막-골격 연계20,21에서에서 중요 한 역할은 ERM (ezrin, radixin, 및 moesin) 단백질 가족 ,22또는 C2 또는 PH 도메인을 포함 하는 단백질. 또한, 다양 한 생물 학적 자료를 공부이 기술의 응용 프로그램 성공적으로 게시 된, 따라서 QCM 더 복잡 한 고분자 어셈블리 또는 상호 작용을 공부 하기 적합된 실험 플랫폼으로 구축 23,24셀이 됩니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 보조금 SFB 858/B04, EXC 1003, SFB 1348/A04, 및 SFB 1348/A11 도이치 가운데에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Calciumchloride | Merck | 017-013-00-2 | 99% |
| Chloroform | Roth | 4432.1 | 99% |
| DOPC | Avanti | 850375P | |
| EGTA | PanReac AppliChem | A0878 | 99% |
| HEPES | PanReac AppliChem | A1069 | |
| Methanol | PanReac AppliChem | A3493 | |
| PiP2 | Avanti | 850155P | |
| POPC | Avanti | 850457P | |
| POPS | Avanti | 840034P | |
| Sodiumchloride | PanReac AppliChem | A1149 | |
| SDS | Roth | 183 | |
| Trisodium citrate | PanReac AppliChem | A3901 | |
| Equipment | |||
| Extruder Liposofast | Avestin | ||
| Qsense E4 Analyzer | Qsense | ||
| QSense Dfind | Qsense | ||
| Pump IPC 4 | Ismatec | ISM 930 | |
| QSX 303 SiO2 Silicon dioxide 50nm | Qsense | QSX 303 | |
| PC Membranes 0.05μm | Avanti polar lipids | 610003 | |
| OriginPro | OriginLab Corporation | Version 8 and 9 |
References
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