Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

En netto skimmel-baseret metode til stillads-gratis tre-dimensionelle hjerte væv skabelse

doi: 10.3791/58252 Published: August 5, 2018

Summary

Denne protokol beskriver en netto skimmel-baseret metode for at oprette tre-dimensionelle stillads-fri hjerte væv med tilfredsstillende strukturelle integritet og synkron slå adfærd.

Abstract

Denne protokol beskriver en roman og let netto skimmel-baseret metode til at oprette tre-dimensionelle (3-D) hjerte væv uden yderligere stillads materiale. Human-induceret pluripotente stamceller-celle-afledte cardiomyocytes (iPSC-CMs), menneskelige hjerte fibroblaster (HCFs) og menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVECs) er isoleret og bruges til at generere en cellesuspension med 70% iPSC-CMs, 15% HCFs og 15% HUVECs. De er co kulturperler i et ultra-lavt vedhæftet fil "hængende drop" system, som indeholder micropores til kondenserende hundredvis af spheroids ad gangen. Cellerne samlede og danner spontant slå spheroids efter 3 dage med fælles kultur. Spheroids er høstet, seedet i en roman støbeform hulrum og kulturperler på en shaker i rugemaskinen. Spheroids blevet en moden funktionelle væv ca. 7 dage efter såning. De deraf følgende lag væv består af sammenvoksede spheroids med tilfredsstillende strukturelle integritet og synkron slå adfærd. Denne nye metode har et lovende potentiale som en reproducerbar og omkostningseffektiv metode til at oprette manipuleret væv til behandling af hjertesvigt i fremtiden.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Målet med aktuelle hjerte vævsmanipulering er at udvikle en behandling for at udskifte eller reparere struktur og funktion af tilskadekomne Myokardie væv1. Metoder til at skabe 3D-hjerte væv modeller udstiller de vigtige kontraktile og elektrofysiologiske egenskaber af indfødte hjerte væv har hastigt ekspanderende2,3. En række forskellige strategier er blevet undersøgt og anvendes i undersøgelser4,5. Disse metoder spænder fra brugen af specifikke syntetiske og naturlige bioaktive hydrogels, såsom gelatine, kollagen, fibrin og peptider6, at bio-blæk deposition teknologier2 og bioprinting teknologier7.

Det har vist sig at stillads-gratis metoder kan producere sammenlignelige væv som biomateriale-baserede metoder, uden ulemperne at integrere udenlandske stilladser materiale8. Oren Caspi et al. demonstreret, at indarbejdelsen af forskellige typer af celler giver mulighed for generation af stærkt vaskulariserede human engineering hjerte væv9. Hagen et al. udviklet en 3-D udskrivningsmetoden for kardiale patch skabelse fra spheroids. Resulterende patches er sammensat af cardiomyocytes, fibroblaster og endotelceller i en 70:15:15 forholdet10. Spheroids har vist sig at være effektiv "byggesten" af stillads-fri hjerte væv skabelse, som de er resistente mod hypoxi og besidder tilstrækkelig mekanisk integritet for implantation11,12. Tidligere undersøgelser har påvist flere fabrikation metoder til oprettelse af sfæroide, herunder brug af hængende drop metode, spinner kolber13, mikrofluid systemer14og ikke-tilhænger kultur overflader ubestrøget eller bestrøget med Agarosen mikro-forme15. I denne protokol, vi bruger hængende drop enhed, som indeholder micropores til kondenserende hundredvis af spheroids ad gangen.

Denne undersøgelse præsenterer en roman og effektiv stillads-fri metode til oprettelse af hjertets væv, som omfatter manuelt såning af spheroids i en firkantet støbeform hulrum og inkubere væv på en shaker til modning. Under sædvanlige statisk kultur er ilt diffusion begrænset til de ydre aspekter af væv konstruktion, hvilket resulterer i central nekrose. Dog med den netto mug, er alle spheroids seedede i formen nedsænket i medierne med en konstant fluidic bevægelse, giver mulighed for øget udbredelse af næringsstoffer og ilt. Derudover denne skimmel-baseret metode giver mulighed for samtidig oprettelse af forskellige størrelser væv pletter med minimal manuelle indsats og den deraf følgende væv let kan fjernes fra formen. Denne nye metode giver mulighed for effektiv og reproducerbare oprettelsen af stillads-fri, flerlaget hjerte pletter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. forberedelse af Cardiomyocytes

  1. Pels 6-godt plader med basalmembranen matrix og kultur menneskelige-induceret pluripotente stamceller (hiPSCs) som tidligere beskrevet17.
  2. Differentiere hiPSCs i hiPSC-CMs ved hjælp af tidligere beskrevne metoder18.
  3. På 16-18 d efter differentiering, suspendere cardiomyocytes ved at skylle hver brønd med 2 mL 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) uden calcium eller magnesium, efterfulgt af inkubation med 1 mL/godt af trypsin eller celle dissociation reagens (Se tabel af Materialer) i 5 min ved stuetemperatur.
  4. Neutralisere trypsin eller celle dissociation reagens (Se Tabel af materialer) ved hjælp af et lige saa stort volumen af Roswell Park Memorial Institute (RPMI) celle media suppleret med B-27 (RPMI/B-27 celle media). Pipetteres op og ned for at løsne eventuelle overholdt celler.
  5. Indsamle de suspenderede cardiomyocytes med en 10-mL serologisk pipette og overføre dem til en 50 mL konisk slange.
  6. Der centrifugeres cellesuspension ved 250 x g i 5 min. ved stuetemperatur til at fremskaffe en celle pellet.
  7. Resuspenderes i 10 mL af RPMI/B-27 celle medier.
  8. Kombiner 20 µL af cellesuspension med en lige mængde 0,4% Trypan blå løsning og bland forsigtigt.
  9. Brug en manuel hemocytometer til at tælle og opnå cellesuspension koncentration og celle levedygtighed.

2. forberedelse af fibroblaster

  1. Indlede en kultur af en menneskelige hjerte fibroblast (HCF) (voksen ventrikulær type) cellelinje som tidligere beskrevet16.
  2. Suspendere HCFs af inkubere dem med en passende mængde af trypsin eller celle dissociation reagens (Se Tabel af materialer) til 5 min. ved stuetemperatur16. For en T175 kolbe brugt 10 mL trypsin eller celle dissociation reagens.
  3. Neutralisere trypsin eller celle dissociation reagens (Se Tabel af materialer) med et lige saa stort volumen af medium, derefter overføre prøven til en 50 mL konisk slange og centrifugeres cellesuspension ved 250 x g i 5 min. ved stuetemperatur til at fremskaffe et pellet.
  4. Resuspenderes i 10 mL af fibroblast vækstmedium (Se Tabel af materialer).
  5. Kombiner 20 µL af HCF cellesuspension med en lige mængde 0,4% trypan blå løsning og bland forsigtigt.
  6. Bruge en automatiseret celle counter eller manuelle hemocytometer til at tælle og få den nye cellesuspension koncentration og celle levedygtighed.

3. forberedelse i Endothelial Cells

  1. Indlede en kultur af en menneskelig umbilical vene endothelial celler (HUVEC) linje som tidligere beskrevet17. Suspendere HUVECs af inkubere dem med en passende mængde af trypsin eller celle dissociation reagens (Se Tabel af materialer) til 3 min. ved stuetemperatur17. Neutralisere trypsin eller celle dissociation reagens (Se Tabel af materialer) med et lige saa stort volumen af medium, derefter overføre til en 50 mL konisk slange og centrifugeres cellesuspension ved 250 x g i 5 min. ved stuetemperatur til at fremskaffe en pellet.
    Bemærk: For en T175 kolbe, 10 mL trypsin eller celle dissociation reagens blev brugt.
  2. Resuspenderes i 10 mL i endothelial celle vækstmedium (Se Tabel af materialer).
  3. Kombinere 20 µL af HUVEC suspension og bejdse det med en lige mængde 0,4% Trypan blå løsning og bland forsigtigt.
  4. Bruge en automatiseret celle counter eller en manuel hemocytometer til at tælle og opnå cellesuspension koncentration og celle levedygtighed.

4. oprettelse af hængende Drop Spheroids

  1. Placer hængende drop enhed, som indeholder 850 micropores, (hver med en diameter på 350 µm) i sterilt 6-godt plader.
  2. Isolere de tre typer af celler, som beskrevet ovenfor: hiPSC-CMs, HCFs og HUVECs. Kombinere dem i et forhold på 70% iPSC-CMs, 15% HCFs og 15% HUVECs i en 50 mL konisk slange med RPMI/B-27 celle medier på en koncentration af 2,475,000 celler pr. mL.
  3. Dispensere 4 mL cellesuspension (2,475,000 celler pr. mL) til hvert hul i vedhæftet ultra-lavt hængende drop system (med en micropore diameter på 350 µm) siddende i en 6-godt plade.
  4. Spheroids vil spontant danner inden for 12 timer af udlevering af cellesuspension til hængende drop enhed. Fortsat kultur i alt 72 h (3 u) ved 37 ° C, 5% CO2og 95% luftfugtighed for modningen af spheroids.
  5. Efter 72 h af kultur, høste spheroids gennem porerne i bunden af hængende drop system ved at placere enheden i en skål med medium og hvirvlende det forsigtigt at frigive spheroids fra hængende drop enhed.

5. 3D-Patch skabelse ved hjælp af den nye netto skimmel

  1. Basen, kvadratiske bundplade, bunden net og 10 lagdelt side redskaber samles for at skabe nye formen ved hjælp af et par af steril pincet. Først, stable og justere base, kvadratiske bundplade og bund netto bruger de hjørne indlæg. Derefter stak og lag 10 side garnene i skiftende retninger for at oprette et net af fine rustfrit stål stikben.
  2. Skyl fyldet base med PBS eller medium at reducere overfladespænding og derefter overføre de forsamlede mug på påfyldning soklen.
  3. Våd netto støbeform hulrum med PBS eller medie i den samme metode. Langsomt fylde spheroids i den forudsatte hulrum af den ønskede størrelse (2 x 2 x 1 mm, 4 x 4 x 1 mm, eller 6 x 6 x 1 mm).
    Bemærk: Sørg for, at 120% af den forventede mængde af spheroids tilføres hulrummet, således at celle aggregater er i stram forbindelse og bo statisk.
  4. Saml top net og firkantede topplade på hjørnet stillinger og sikre propper og bedrift rør til at forhindre en udvaskning af spheroids.
  5. Fyldte netto skimmel overførselssystem til en 6-godt plade med 6 mL af 27-RPMI/B celle medier eller i en steril beholder med nok medium til at dække det hele forsamlede skimmel.
  6. Inkuber 6-godt plade med fyldt støber systemet på en svingende shaker i 7-10 dage på 3.000-4.000 x g.
    Bemærk: Inkubation varighed afgøres af størrelsen af de kardiale patches. Med større pletter skal at inkubationstiden forhøjes for kardiale patch modning.

6. fjernelse af plasteret fra den nye netto skimmel

  1. Fjerner mug system fra medierne og placere det på steriliserede håndtering måtten i en steril 10-cm parabol.
  2. Fjerne bedrift tube, propper, den øverste firkantede plade og den øverste net. Skub forsigtigt ud lagdelt side net én efter én med et par af steril pincet. Efter decannulation opnås en intakt hjerte patch på toppen af den nederste net.
  3. Afhente den nederste net med patch ved hjælp af steril pincet og overføre bunden net til en 35-mm skål med 5 mL af RPMI/B27 medier. Forsigtigt løsne patch fra bunden net af langsomt hvirvlende nettet i skålen, eller med en steril celle skraber. Efter udstationering fra bunden netto, kan de hjerte væv kulturperler med RPMI/B27 medier.
  4. Fortsat at udruge frit svævende 3-D hjerte patch i 35-mm parabol. Funktionelle synkron slå kan observeres så tidligt som i 24 timer efter fjernelse fra formen.
  5. Efter at fjerne programrettelsen fra den netto skimmel, observere at dens form er vedligeholdt med integritet og intensiteten af synkron slå stiger med tiden.
    Bemærk: 3D-net skimmel-baserede hjerte patches udstillet elektriske integration af komponent cardiospheres efter decannulation. Vi observerede en bankende frekvens spænder fra 60 til 80 slag i minuttet, som varede i mere end 60 dage.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I vores forsøg udnyttet vi en cellesuspension af 70% iPSC-CMs, 15% HCFs og 15% HUVECs i RPMI/B-27 celle medier på en koncentration af 2,475,000 celler pr. mL. Når du har oprettet cellesuspension, udleveret vi 4 mL cellesuspension til hver brønd af udlægget ultra-lavt hængende drop system, som beskrevet i trin 4.3 i protokollen. Brugen af hængende drop system resulterede i spontan dannelsen af hundredvis af slå spheroids efter 3 dages kultur ved 37 ° C, 5% CO2og 95% luftfugtighed. Spheroids var let observeret for at slå under lysmikroskopi på 4 X og 10 X forstørrelse med en gennemsnitlig diameter på 350 µm, efter 72 h af kulturen (figur 1).

I slutningen af skridt 6,5 i protokollen, efter høst spheroids, var formen let seedet med enkle pipettering metoder. Dyrkning af mug tilladt for en fusion af spheroids; efterfølgende fjernelse af mug resulterede i en intakt hjerte patch med mekaniske integritet. Efter fjernelse fra mug og 24 h af kultur, blev funktionelle og synkrone bankende hjerte væv observeret, bekræfter, at mekanisk integration af spheroids (figur 2, venstre). Vi bemærkede også, at de mange forskellige lag af spheroids slå spontant i en koordineret indsats på lysmikroskopi (figur 2, højre).

En immunhistokemisk analyse af nettet skimmel-baseret 3D-hjerte patch blev også udført med hjerte markør troponin T. Konfokal imaging viste, at de godt justeret cardiomyocytes alle udstillede troponin T udtryk (figur 3).

Figure 1
Figur 1 : Oprettelse af hængende drop spheroids. Human-induceret pluripotente stamceller-afledt cardiomyocytes (hiPSC-CMs), menneskelige hjerte fibroblaster (HCFs) og menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVECs) blev isoleret og bruges til at generere en cellesuspension med 70% iPSC-CMs, 15% HCFs og 15% HUVECs, på en koncentrationen af 2,475,000 celler pr. mL. Efter 72 h, blev de spontant dannede spheroids i hver micropore let observeret for at slå under lysmikroskopi. Skalalinjen i panelet til venstre = 1.000 µm; skalalinjen i højre panel = 400 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Oprettelse af et flerlaget hjerte væv vise integration af komponent spheroids. Efter udstationering fra formen net, 3D-hjerte patch fastholdt sin form og demonstreret synkron slå, der angiver den mekaniske integration af spheroids, som vist i panelet til venstre (hvor skalalinjen = 1.000 µm). De stablede flerlagsmaterialer af spheroids blev inspiceret med lysmikroskopi, som vist i højre panel (hvor skalalinjen = 400 µm), og konstaterede at slå spontant. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Immunofluorescens evaluering af hjertets væv. På immunofluorescens analyse fandtes den netto skimmel-baseret 3D-hjerte væv består af godt justeret cardiomyocytes med troponin T udtryk. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Betydningen af denne metode ligger i dens reproducerbarhed og effektiviteten af den resulterende flerlaget hjerte væv. I feltet i hjertets vævsmanipulering er en af de nuværende mål at identificere en metode til at konstruere slå, flerlaget og funktionelle 3D-hjerte patches. Vi rapporterer en effektiv og reproducerbar metode til oprettelse af flerlaget hjerte væv af direkte manuel såning af spheroids sammensat af cardiomyocytes, endotel celler og fibroblaster i en roman netto støber. Netto formen anvendes i denne metode har en bred vifte af forskellige størrelser til oprettelse af væv spænder fra 2 x 2 x 1 mm til 6 x 6 x 1 mm. De teknikker, vi har beskrevet kan også ændres forskellige mug figurer og systemer afhængigt af den ønskede væv geometri. Beskrevet celle koncentrationer og nøgletal blev optimeret tidligere for hiPSC-CMs, og ændringer til en anden celletype vil kræve yderligere evaluering.

In vitro- oprettelse af 3D-hjerte væv ved hjælp af bioprinter teknologi er blevet undersøgt med håb om at udvikle terapeutiske og diagnostiske modeller. Dog aktuelle bioprinting metoder er besværlig og kræver betydelige tid og brug af supplerende støttestrukturer som nåle eller stillads materialer. Tilstedeværelsen af disse supplerende støtte strukturer falder diffusion af næringsstoffer og ilt18. Central nekrose er derfor en stor bekymring i aktuelle 3D-hjerte konstruktioner, på grund af manglende kapillærer til at levere ilt og næringsstoffer19. Sakaguchi et al. anvendes metoden til sandwiching orienterede celle ark og bruge vaskulære bed bioreaktorer til at udvikle en endotel network20. I netto skimmel systemet præsenteres her, kan formen hulrum tilstrækkelig udbredelse af næringsstoffer og ilt uden krav om nogen støtte strukturer eller stilladser. Derudover metoden netto skimmel-baserede er effektiv og kræver ikke specielle færdigheder for både seeding af spheroids i formen og opretholdelsen af den senere patch. Som sådan, er det en hurtig og billig måde at erhverve synkront slå og funktionelle hjerte patches.

At optimere klumpformet diameter og antallet af spheroids anvendes i hvert enkelt hængende drop enhed, vi gennemførte fejlfinding og ændringer vedrørende de celletyper og mængder. For dette net skimmel-baserede metode var klumpformet diameter og antallet af spheroids anvendes af afgørende betydning at skabe en funktionel hjerte væv af passende størrelse. Vi prøvede forskellige celle koncentrationer for at optimere den bedste klumpformet størrelse for hjerte væv oprettelse. Tre typer af celler blev brugt til at oprette hjerte spheroids af hængende drop enhed, som omfattede 70% iPSC-CMs, 15% HCFs og 15% HUVECs. Under lysmikroskopi, var de spontant dannede spheroids i hver micropore let observeret for at slå efter 72 timer. Vi observerede, at spheroids' diameter steget med celle koncentrationen af hængende drop enhed. Vi prøvede forskellige koncentrationer af spheroids, fra 100 spheroids til 300 spheroids i hver enhed med 4 mL af RPMI/B27 medium. Med talrige forsøg fandt vi, at koncentrationen af 2,475,000 celler pr. mL givet en optimal diameter af de resulterende spheroids. Med optimeret diameteren af spheroids oplevede vi ubesværet samling og såning af spheroids i de stablede netto skimmel, som var vigtige skridt til den netto skimmel-baseret metode til oprettelse af flerlaget hjerte væv.

Det mest kritiske trin i protokollen er optimering af den sfæroide størrelse. Det er værd at nævne at spheroids brugt i denne metode er mindre end størrelsen på klumpformet organer brugt i andre bioprinting teknikker21. Større spheroids er blevet fundet for at have central nekrose på grund af utilstrækkelige udbredelse af ernæring og ilt22. Med spheroids med en mindre diameter, er tilstrækkelig udbredelse af næringsstoffer og ilt til midten af hver klumpformet lettere opnås, øge cellulære bæredygtighed i alle områder af den resulterende patch. I protokollen præsenteres her, en klumpformet diameter på 350 µm giver mulighed for forbedrede cellernes levedygtighed og mere kontakt areal mellem spheroids, som vi mener bidrager til den vellykket skabelse af hjertets væv ved hjælp af dette net skimmel. Derfor, det er et afgørende skridt i den beskrevne metode. For at tilpasse protokollen til andre celletyper, er yderligere klumpformet størrelse optimeringseksperimenter påkrævet.

Begrænsningerne i denne tilgang omfatter manglende evne til at netop kontrol stabling af spheroids. Dette resulterer i områder af ikke-ensartethed af de deraf følgende væv patches og heterogene tykkelse. Desuden, selv om den faktiske hands-on tid for såning af spheroids er minimal, oprettelse af store flerlaget patches kræver en udvidet kultur tid til at give mulighed for en sammensmeltning af spheroids.

Med hensyn til fremtidige programmer er denne roman netto skimmel-baseret metode en effektiv og reproducerbar metode til at skabe 3D-, stillads-gratis hjerte væv med minimal manuelle indsats. De resulterende lag væv består af sammenvoksede spheroids med tilfredsstillende strukturelle integritet og synkron slå adfærd. Dette net skimmel-baseret metode præsenterer en omkostningseffektiv og skalerbar alternativ til nuværende bio-fabrikation metoder af manipuleret væv og har potentiale til at skabe klinisk relevant hjerte væv til behandling af hjertesvigt med mål at udskiftning af iskæmisk eller dysfunktionelle cardiomyocytes23. Desuden, kan denne metode bruges til at oprette hjerte væv for patienten-specifikke screeninger af potentielle roman drug behandlingsformer24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender den følgende finansieringskilde: magi at sager fonden for hjerte-kar-forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Cardiac fibroblasts (HCF) Sciencell 6310
FM-2 Consists of Basal Medium Sciencell 2331 HCF culture medium
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2935
EGM+Bullet Kit  Lonza CC5035 HUVEC culture medium
E8 media  Invitrogen A1517001 HiPSC culture medium
Geltrex  Invitrogen A1413202
TrypLE Express Enzyme (1X) Thermo Fisher 12604013 Trypsin and Cell dissociation reagent
RPMI media Invitrogen 11875093 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
B-27 supplement (50x) Thermo Fisher 17504044 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Novel net mold  TissueByNet Co.,Ltd NM25-1
Hanging drop plate Kuraray Co.,Ltd MPc350
6 well plates  Sigma-Aldrich CLS-3516

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circulation Research. 120, (8), 1318-1325 (2017).
  2. Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues. Circulation Research. 120, (1), 150-165 (2017).
  3. Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, (2), 155-173 (2009).
  4. Duran, A. G., et al. Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66, (1), 53-62 (2018).
  5. Lux, M., et al. In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).
  6. Eschenhagen, T., et al. Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system. The FASEB Journal. 11, (8), 683-694 (1997).
  7. Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23, (3), 237-244 (2017).
  8. Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model. Journal of Cardiothoracic Surgery. 11, (1), 163 (2016).
  9. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circulation Research. 100, (2), 263-272 (2007).
  10. Ong, C. S., et al. Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes. Scientific Reports. 7, (1), 4566 (2017).
  11. Kelm, J. M., et al. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. Journal of Biotechnology. 148, (1), 46-55 (2010).
  12. Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35, (1), 137-145 (2016).
  13. Zuppinger, C. 3D culture for cardiac cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1863, (7 Pt B), 1873-1881 (2016).
  14. Langenbach, F., et al. Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering. Nature Protocols. 6, (11), 1726-1735 (2011).
  15. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31, (2), 108-115 (2013).
  16. Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1. Cell Tissue Research. 288, (1), 87-93 (1997).
  17. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nature Protocols. 2, (3), 481-485 (2007).
  18. Pimentel, C. R., et al. Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network. Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).
  19. Shimizu, T., et al. Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues. The FASEB Journal. 20, (6), 708-710 (2006).
  20. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  21. Ong, C. S., et al. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. Journal of Visualized Experiments. 125, (e55438), (2017).
  22. Tan, Y., et al. Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids. Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).
  23. Karra, R., Poss, K. D. Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration. Journal of Clinical Investigation. 127, (2), 427-436 (2017).
  24. Bartholoma, P., et al. Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents. Journal of Biomolecular Screening. 10, (8), 814-822 (2005).
En netto skimmel-baseret metode til stillads-gratis tre-dimensionelle hjerte væv skabelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Y., Yeung, E., Lui, C., Ong, C. S., Pitaktong, I., Huang, C., Inoue, T., Matsushita, H., Ma, C., Hibino, N. A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation. J. Vis. Exp. (138), e58252, doi:10.3791/58252 (2018).More

Bai, Y., Yeung, E., Lui, C., Ong, C. S., Pitaktong, I., Huang, C., Inoue, T., Matsushita, H., Ma, C., Hibino, N. A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation. J. Vis. Exp. (138), e58252, doi:10.3791/58252 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter