Этот протокол описывает метод нетто на основе формы для создания трехмерных бесплатно эшафот сердечной ткани с удовлетворительным структурной целостности и поведение синхронное биений.
Этот протокол описывает Роман и легко чистый метод на основе формы для создания трехмерной (3-D) сердечной ткани без дополнительных эшафот материала. Человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов (iPSC-CMs), сердечной фибробластов (HCFs), человека пупочную вену эндотелиальных клеток (HUVECs) изолированные и используется для создания суспензии клеток с 70% iPSC-CMs, 15% HCFs и 15% HUVECs. Они совместно культивируемых в системе ультра-низким насадку «висит капля», которая содержит микропоры для конденсации сотни сфероидов в одно время. Клетки агрегировать и спонтанно формируют избиение сфероидов после 3 дней совместного культуры. Сфероидов собирают, семенами в полости формы роман и культивировали в шейкер в инкубаторе. Сфероидов стать зрелой функциональные ткани примерно через 7 дней после посева. Результирующая многослойные ткани состоят из плавленого сфероидов с удовлетворительным структурной целостности и поведением синхронное биений. Этот новый метод имеет многообещающий потенциал воспроизводимость и экономически эффективным методом для создания инженерии тканей для лечения сердечной недостаточности в будущем.
Цель текущего инженерии сердечной ткани является разработка терапии замены или ремонта структуры и функции пораженных тканей миокарда1. Методы для создания моделей 3-D сердечной ткани, экспонирование важные сократительной и электрофизиологические свойства родной сердечной ткани быстро расширяет2,3. Разнообразные стратегии были изучены и использованы в исследованиях4,5. Эти методы варьируются от использования конкретных синтетических и натуральных биоактивных гидрогели, например6желатин, коллаген, фибрина и пептиды, био чернил осаждения технологий2 и подложке технологии7.
Было показано, что леска бесплатные методы могут производить сопоставимые тканей как методы на основе биоматериала, без недостатков включения иностранных леса материала8. Орен Caspi et al. показали, что включение различных видов клеток позволяет поколения высоко васкуляризированной человеческой инженерии сердечной ткани9. Chin et al. разработали метод 3-D печати для создания сердца патч от сфероидов. Результате патчей состоят из кардиомиоцитов, фибробластов и эндотелиальных клеток в 70:15:15 соотношение10. Сфероидов было показано, чтобы быть эффективным «строительные блоки» бесплатно эшафот сердечной ткани творения, как они устойчивы к гипоксии и обладают достаточной механической целостности для имплантации11,12. Предыдущие исследования показали несколько методов изготовления для создания сфероида, включая использование висит drop метод, спиннер колбы13, microfluidic систем14и non сторонник культуры поверхностей без покрытия или с покрытием агарозы микро формы15. В этом протоколе, мы используем висит падение устройство, которое содержит микропоры для конденсации сотни сфероидов в одно время.
Это исследование представляет собой Роман и эффективного эшафот, свободной метод для создания сердечной ткани, которая включает в себя вручную посева сфероидов в полости квадратные формы и инкубации ткани на шейкер для созревания. В условиях обычной статической культуры диффузия кислорода ограничивается внешние аспекты конструкции ткани, что приводит к центральной некроза. Однако с чистой формы, все сфероидов посеяны в плесень погружаются в СМИ с постоянной аэрогидродинамических движения, что позволяет для широкого распространения питательных веществ и кислорода. Кроме того этот метод на основе форм позволяет одновременное создание патчей тканей разного размера с минимальными усилиями ручной и результирующая ткань может быть легко удалена из формы. Этот новый метод позволяет для создания эффективной и воспроизводимые эшафот бесплатно, многослойные сердечной патчей.
Значение этого метода заключается в его воспроизводимости и эффективности результирующая многослойных сердечной ткани. В области инженерии сердечной ткани одна из целей текущей является определение метода для построения избиение, многослойных и функциональных 3-D сердца патчей. Мы п?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы признают следующие источник финансирования: Фонд магии что вопросы для сердечно-сосудистых исследований.
Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |