Dit protocol beschrijft een netto schimmel gebaseerde methode om te maken van driedimensionale steiger-vrije cardiale weefsels met bevredigende structurele integriteit en synchrone kloppend gedrag.
Dit protocol beschrijft een roman en eenvoudige netto schimmel gebaseerde methode om het maken van driedimensionale (3-D) cardiale weefsels zonder extra Steiger materiaal. Mens-geïnduceerde pluripotente stamcellen-cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), menselijke cardiale fibroblasten (HCFs) en menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVECs) zijn geïsoleerd en gebruikt voor het genereren van een celsuspensie met 70% iPSC-CMs, HCFs van de 15% en 15% HUVECs. Ze zijn samen gekweekt in een ultra-lage “opknoping drop” verbindingssysteem, waarin micropores voor condenserende honderden spheroïden in één keer. De cellen samenvoegen en spontaan vormen kloppend spheroïden na 3 dagen van co cultuur. De spheroïden zijn geoogst, zaadjes in de holte van een nieuwe schimmel en gekweekt op een shaker in de incubator. De spheroïden uitgegroeid tot een volwassen functionele weefsel ongeveer 7 dagen na het zaaien. Het resulterende meerdere lagen weefsel bestaan uit gesmolten spheroïden met bevredigende structurele integriteit en synchrone kloppend gedrag. Deze nieuwe methode heeft veelbelovende potentieel als een reproduceerbare en kosteneffectieve methode maken van gemodificeerde weefsels voor de behandeling van hartfalen in de toekomst.
Het doel van huidige cardiale weefselengineering is het ontwikkelen van een therapie te vervangen of repareren van de structuur en functie van gewonde myocardiale weefsel1. Methoden voor het maken van 3D-cardiale weefsel modellen tentoonstellen van de belangrijke eigenschappen van de contractiele en elektrofysiologische van inheemse cardiale weefsel hebben al snel groeiende2,3. Een verscheidenheid van strategieën zijn onderzocht en gebruikt in studies4,5. Deze verificatiemethoden variëren van het gebruik van specifieke synthetische en natuurlijke bioactieve hydrogels, zoals collageen, gelatine, fibrine en peptiden6, tot bio-inkt afzetting technologieën2 en bioprinting technologieën7.
Het is aangetoond dat de steiger-vrije methoden vergelijkbare weefsels als biomaterial gebaseerde methoden, zonder de nadelen van de integratie van buitenlandse steigers materiële8kunnen produceren. Oren Caspi et al. aangetoond dat de opname van verschillende soorten cellen in staat de generatie van zeer gevacuoliseerd menselijke gemanipuleerde cardiale weefsel9 stelt. Kin et al. ontwikkelde een 3D-afdrukmethode voor cardiale patch creatie van spheroïden. Resulterende patches zijn samengesteld uit cardiomyocytes en fibroblasten, endotheliale cellen in een 70:15:15 ratio10. Spheroïden hebben aangetoond dat effectieve “bouwstenen” van de steiger-vrije cardiale weefsel schepping, als ze resistent zijn tegen hypoxie en bezitten voldoende mechanische integriteit voor implantatie11,12. Eerdere studies hebben aangetoond dat verschillende fabricage methoden voor sferoïde creatie, met inbegrip van het gebruik van de opknoping drop methode, spinner kolven13, microfluidic systemen14en niet-aanhanger cultuur oppervlakken ongecoat of bekleed met agarose micro-mallen15. In dit protocol, gebruiken we de opknoping drop apparaat, waarin micropores voor condenserende honderden spheroïden in één keer.
Deze studie geeft een roman en efficiënte steiger-vrije methode voor cardiale weefsel creëren, waarin de spheroïden handmatig te zaaien in een vierkante mal Holte en broeden van het weefsel op een shaker voor rijping. Onder gebruikelijke statische kweekomstandigheden is zuurstof diffusie beperkt tot de uiterlijke aspecten van de constructie van weefsel, wat resulteert in centrale necrose. Echter met de netto schimmel, worden alle spheroïden die zaadjes in de mal ondergedompeld in de media met een constante fluidic beweging, rekening houdend met de toegenomen verspreiding van voedingsstoffen en zuurstof. Bovendien, deze schimmel gebaseerde methode zorgt voor de gelijktijdige oprichting van verschillen in de grootte weefsel patches met minimale handmatige inspanning en het resulterende weefsel kan gemakkelijk worden verwijderd uit de mal. Deze nieuwe methode zorgt voor de efficiënte en reproduceerbare oprichting van steiger-vrije, meerdere lagen cardiale patches.
Het belang van deze methode ligt in de reproduceerbaarheid en de effectiviteit van het daaruit voortvloeiende meerdere lagen cardiale weefsel. Op het gebied van cardiale weefselengineering is één van de huidige doelstellingen het identificeren van een methode voor de bouw van slaand, meerdere lagen en functionele 3D-cardiale patches. Wij rapporteren een efficiënte en reproduceerbare methode van het creëren van meerdere lagen cardiale weefsels door directe handmatige zaaien van spheroïden samengesteld van cardiomyocy…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen de volgende financieringsbron: het Fonds van de Magic dat de zaken voor cardiovasculair onderzoek.
Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |