Denne protokollen beskriver en netto mold-basert metode for å lage tredimensjonale stillaset uten hjerte vev og tilfredsstillende konstruksjonssikkerhet og synkron juling virkemåte.
Denne protokollen beskriver en roman og lett netto mold-basert metode for å lage tredimensjonale (3D) hjerte vev uten ekstra stillaset materiale. Menneskeskapte pluripotent stilk-cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), menneskelig hjerte fibroblaster (HCFs) og menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVECs) er isolert og brukes til å generere en celle hjuloppheng med 70% iPSC-CMs, 15% HCFs, og 15% HUVECs. De er co kulturperler i en svært lav vedlegg “hengende drop” system, som inneholder micropores for kondenserende hundrevis av spheroids samtidig. Cellene samlet og danne spontant slo spheroids etter 3 dager for co kultur. Spheroids er høstet, seeded inn i en ny mugg hulrom og kultivert på en shaker i inkubator. Spheroids blitt en moden funksjonelle vev ca 7 dager etter seeding. Resulterende flerlags vev består av smeltet spheroids med tilfredsstillende strukturelle integritet og synkron slå atferd. Denne nye metoden har lovende potensial som reproduserbare og kostnadseffektiv metode for å opprette utviklet vev for behandling av hjertesvikt i fremtiden.
Målet med gjeldende hjerte vev engineering er å utvikle en terapi for å erstatte eller reparere struktur og funksjon av skadde hjerteinfarkt vevet1. Metoder for å lage 3D hjerte vev modeller viser viktige kontraktile og elektrofysiologiske egenskaper av innfødte hjerte vev har blitt raskt voksende2,3. En rekke strategier har vært utforsket og brukt i studier4,5. Disse metodene spenner fra bruk av bestemte syntetiske og naturlige bioaktive hydrogels, for eksempel gelatin, kollagen, fibrin og peptider6, til bio-blekk deponering teknologier2 og bioprinting technologies7.
Det har vist at stillaset-fri metoder kan produsere sammenlignbare vev som biomateriale-baserte metoder, uten ulempene med omfatter utenlandske stillas materiale8. Oren Caspi et al. vist at inkorporering av ulike typer celler kan generering av svært Stangeriaceae menneskelig utvikling hjerte vev9. Haken et al. utviklet en 3D utskriftsmetode for oppretting av cardiac oppdateringen fra spheroids. Resulterende flekker består av cardiomyocytes, fibroblaster og endotelceller i en 70:15:15 forholdet10. Spheroids har vist seg å være effektive “byggeklosser” stillaset uten hjerte vev skapelsen, som de er resistente mot hypoksi og ha tilstrekkelig mekanisk integritet for implantasjon11,12. Tidligere studier har vist flere fabrikasjon metoder for oppretting av spheroid, inkludert bruken av hengende slippe metoden, spinner kolber13, microfluidic systemer14og ikke-tilhenger kultur overflater ubestrøket eller belagt med agarose mikro-muggsopp15. I denne protokollen, bruker vi hengende slipp enhet, som inneholder micropores for kondenserende hundrevis av spheroids samtidig.
Denne studien presenterer en ny og effektiv stillaset-fri metode for oppretting av hjerte vev, som inkluderer manuelt såing til spheroids inn i en firkantet mold hulrom og rugende vevet i en shaker for modning. Under vanlige statisk kultur forhold er oksygen diffusjon begrenset til ytre aspekter av vev Konstruer, noe som resulterer i sentrale nekrose. Men med netto mold, er alle spheroids seeded i mold midt i media med en konstant fluidic bevegelse, slik at økt spredningen av næringsstoffer og oksygen. I tillegg gir denne mold-baserte metoden samtidige etableringen av ulike størrelser vev flekker med minimal håndbok anstrengelse og resulterende vevet kan enkelt fjernes fra mold. Denne romanen metoden gir effektiv og reproduserbar etableringen av stillaset-fri, flerlags cardiac patcher.
Betydningen av denne metoden ligger i sin reproduserbarhet og effektiviteten av resulterende flerlags hjerte vev. I feltet av cardiac tissue engineering er en av gjeldende mål å identifisere en metode å konstruere slagene, flerlags og funksjonelle 3D cardiac patcher. Vi rapporterer en effektiv og reproduserbar metode for å opprette flere lag hjerte vev ved direkte manuell såing av spheroids består av cardiomyocytes og endotelceller fibroblaster i romanen netto mold. Netto mold brukes i denne metoden har en rekke fo…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne bekrefter følgende finansieringskilde: Magic at saker fondet for hjerte forskning.
Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |