Un método basado en el molde neto creación libre de andamio tridimensional de tejido cardiaco
Summary
Este protocolo describe un método neto basado en el molde para crear los tejidos cardiacos libre de andamio tridimensionales satisfactoria integridad estructural y comportamiento síncrono de la paliza.
Abstract
Este protocolo describe un novedoso y fácil método neto basado en el molde para crear tejidos cardiacos de tridimensional (3D) sin material de andamio adicional. Cardiomiocitos de derivados de células madre humanas pluripotentes (iPSC-CMs), fibroblastos cardiacos humanos (HCF) y las células endoteliales de vena umbilical humano (HUVECs) son aisladas y utilizadas para generar una suspensión con 70% iPSC-CMs, HCF de 15% y 15% HUVECs. Son cultivadas conjuntamente en un sistema de fijación ultra baja “gota colgante”, que contiene microporos para cientos de esferoides de condensación a la vez. Las células agregan y espontáneamente forman esferoides paliza después de 3 días de cocultivo. Los esferoides son cosechadas, sembrados en una cavidad de molde novela y cultivadas en un agitador en la incubadora. Los esferoides se convierten en un tejido funcional maduro aproximadamente 7 días después de la siembra. Los tejidos resultantes de varias capas consisten en esferoides fusionadas con satisfactoria integridad estructural y comportamiento síncrono de la paliza. Este nuevo método tiene potencial prometedor como un método reproducible y rentable para crear tejidos diseñados para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca en el futuro.
Introduction
El objetivo de la actual ingeniería de tejido cardiaco es desarrollar una terapia para reemplazar o reparar la estructura y función del tejido miocárdico lesionado1. Métodos para crear modelos 3D tejido cardiaco exhibe las propiedades importantes de contráctiles y electrofisiológicas del tejido cardiaco nativa han estado ampliando rápidamente2,3. Una variedad de estrategias han sido exploradas y utilizadas en los estudios4,5. Estos métodos entre el uso de específicos hidrogeles bioactivos naturales y sintéticos, tales como gelatina, colágeno, fibrina y péptidos6, y deposición del bio-tinta tecnologías tecnologías2 y bioprinting7.
Se ha demostrado que métodos libres de andamio pueden producir tejidos comparables como métodos basados en el biomaterial, sin los inconvenientes de la incorporación de material de andamio exterior8. Oren Caspi et al demostraron que la incorporación de varios tipos de células permite la generación de tejido cardiaco ingeniería humana altamente vascularizado9. Chin et al. desarrolló un método de impresión 3-d para la creación del parche cardiaco de esferoides. Parches que se componen de cardiomiocitos, fibroblastos y células endoteliales en un cociente de 70:15:1510. Esferoides han demostrado ser eficaces “building blocks” de la creación de tejido cardíaco libre de andamios, ya que son resistentes contra la hipoxia y poseen suficiente integridad mecánica para la implantación de11,12. Estudios anteriores han demostrado varios métodos de fabricación para la creación de esferoide, incluyendo el uso de las que cuelgan de la gota método, spinner frascos13, sistemas de microfluidos14y cultura no adherente superficies sin revestir o revestidos con micro-moldes de agarosa15. En este protocolo, se utiliza el colgante gota dispositivo, que contiene microporos para cientos de esferoides de condensación a la vez.
Este estudio presenta un novedoso y eficaz método de andamio-libre para la creación de tejido cardíaco, que incluye siembra manualmente los esferoides en la cavidad de un molde cuadrado y el tejido en un agitador de incubación para la maduración. Bajo condiciones de cultivo estático habitual, difusión de oxígeno está limitada a los aspectos exteriores de la construcción de tejido, resultando en necrosis central. Sin embargo, con el molde de red, todos los esferoides sembradas en el molde están inmersos en los medios de comunicación con un constante movimiento fluídico, permitiendo para la mayor difusión de nutrientes y oxígeno. Además, este método basado en el molde permite la creación simultánea de parches de tejido de diferentes tamaños con el mínimo esfuerzo manual y el tejido resultante se puede quitar fácilmente del molde. Este novedoso método permite la creación eficiente y reproducible de parches cardíacos libre de andamio, de varias capas.
Protocol
Representative Results
Discussion
La importancia de este método radica en su reproducibilidad y la eficacia del tejido cardiaco resultante de varias capas. En el campo de la ingeniería de tejido cardiaco, uno de los objetivos actuales es identificar un método para crear parches cardíacos 3D golpes, varias capas y funcionales. Divulgamos un método eficiente y reproducible de la creación de varias capas de tejidos cardiacos por siembra manual directa de esferoides compuestos de cardiomiocitos, células endoteliales y fibroblastos en un nuevo molde ne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen la siguiente fuente de financiamiento: la magia que cuestiones de fondo para la Investigación Cardiovascular.
Materials
| Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
| FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
| EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
| E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
| RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
| Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
| 6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |
References
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