En netto mögel-baserade metod byggnadsställning-fri tredimensionella hjärtvävnad skapelsens
Summary
Det här protokollet beskriver en netto mögel-baserad metod för att skapa tredimensionella byggnadsställning-fri hjärt vävnader med tillfredsställande strukturell integritet och synkron stryk beteende.
Abstract
Det här protokollet beskriver en ny och enkel netto mögel-baserad metod för att skapa tredimensionella (3D) hjärtats vävnader utan ytterligare byggnadsställning material. Människans pluripotenta stamceller-cell-derived hjärtmuskelcellerna (iPSC-CMs), mänskliga hjärt fibroblaster (HCF) och mänskliga navel ven endotelceller (HUVECs) har isolerats och används för att generera en cellsuspension med 70% iPSC-CMs, 15% HCF och 15% HUVECs. De är tillsammans odlade i en extremt låg ”hängande droppe” fästsystem, som innehåller mikroporer för kondenserande hundratals spheroids i taget. Cellerna aggregerade och bilda spontant stryk spheroids efter 3 dagar av samtidig kultur. Spheroids skördas, seedade i en roman mögel hålighet och odlade på en shaker i inkubatorn. Spheroids blivit en mogen funktionell vävnad cirka 7 dagar efter sådd. De resulterande multilayered vävnaderna består av smält spheroids med tillfredsställande strukturell integritet och synkron stryk beteende. Denna nya metod har lovande potential som en reproducerbar och kostnadseffektiv metod för att skapa bakåtkompilerade vävnader för behandling av hjärtsvikt i framtiden.
Introduction
Syftet med aktuell hjärt vävnadsteknik är att utveckla en terapi för att ersätta eller reparera struktur och funktion av skadade hjärtinfarkt vävnad1. Metoder för att skapa 3D-hjärtvävnad modeller uppvisar infödda hjärtvävnad viktigt kontraktila och elektrofysiologiska egenskaper har expanderat snabbt2,3. Olika strategier har utforskats och används i studier4,5. Dessa sträcker sig från användningen av särskilda syntetiska och naturliga bioaktiva hydrogels, såsom gelatin, kollagen, fibrin och peptider6, till bio-bläck nedfall teknik2 och bioprinting teknik7.
Det har visats att byggnadsställning-fria metoder kan producera jämförbara vävnader som biomaterial-baserade metoder, utan nackdelarna med införliva utländska byggnadsställningar materiella8. Oren Caspi et al. visade att införlivandet av olika typer av celler möjliggör generering av högt vaskulariserad mänskliga bakåtkompilerade hjärtvävnad9. Hakan et al. utvecklat en 3D-utskrift metod för hjärt patch skapelse från spheroids. Resulterande fläckar består av hjärtmuskelceller, fibroblaster och endotelceller i ett 70:15:15 baserat på10. Spheroids har visat sig vara effektiva ”byggstenar” av byggnadsställning-fri hjärtvävnad skapelse, eftersom de är resistenta mot hypoxi och besitter tillräcklig mekanisk integritet för implantation11,12. Tidigare studier har visat flera framställningsmetoder för sfäroid skapande, inklusive användning av hängande släpp metoden, spinner kolvar13, ultrakalla system14och icke-anhängare kultur ytor olackerad eller lackerad med agaros mikro-formar15. I detta protokoll, vi använder hängande droppe enhet, som innehåller mikroporer för kondenserande hundratals spheroids i taget.
Denna studie presenterar en ny och effektiv byggnadsställning-fri metod för hjärtvävnad skapelse, som inkluderar manuellt sådd spheroids i en fyrkantig mögel hålighet och ruvning vävnaden på en shaker för mognad. Under vanliga statiska odlingsbetingelser är syre diffusion begränsad till de yttersta aspekterna av den vävnad bygga, vilket resulterar i central nekros. Dock med netto mögel, är alla de spheroids seedade i formen nedsänkta i media med en ständig fluidic rörelse, vilket möjliggör ökad diffusion av näringsämnen och syre. Dessutom detta mögel-baserad metod möjliggör samtidiga skapandet av olika storlek vävnad fläckar med minimal manuellt arbete och den resulterande vävnaden kan enkelt tas ur formen. Denna nya metod möjliggör effektiv och reproducerbara skapandet av byggnadsställning-fri, multilayered hjärt patchar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Betydelsen av denna metod ligger i dess reproducerbarhet och effektiviteten av den resulterande multilayered hjärtvävnad. I fältet för hjärt vävnadsteknik är en av de nuvarande mål att identifiera en metod för att konstruera klappande, mångbottnad och funktionell 3D-hjärt patchar. Vi rapporterar en effektiv och reproducerbar metod att skapa multilayered hjärt vävnader genom manuell direktsådd av spheroids består av hjärtmuskelceller, endotelceller och fibroblaster i en roman netto mögel. Den netto mögel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner följande finansiering källa: Magic att frågor fonden för kardiovaskulär forskning.
Materials
| Human Cardiac fibroblasts (HCF) | Sciencell | 6310 | |
| FM-2 Consists of Basal Medium | Sciencell | 2331 | HCF culture medium |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | Lonza | CC-2935 | |
| EGM+Bullet Kit | Lonza | CC5035 | HUVEC culture medium |
| E8 media | Invitrogen | A1517001 | HiPSC culture medium |
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher | 12604013 | Trypsin and Cell dissociation reagent |
| RPMI media | Invitrogen | 11875093 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| B-27 supplement (50x) | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Novel net mold | TissueByNet Co.,Ltd | NM25-1 | |
| Hanging drop plate | Kuraray Co.,Ltd | MPc350 | |
| 6 well plates | Sigma-Aldrich | CLS-3516 |
References
- Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circulation Research. 120 (8), 1318-1325 (2017).
- Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues. Circulation Research. 120 (1), 150-165 (2017).
- Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4 (2), 155-173 (2009).
- Duran, A. G., et al. Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66 (1), 53-62 (2018).
- Lux, M., et al. In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).
- Eschenhagen, T., et al. Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system. The FASEB Journal. 11 (8), 683-694 (1997).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (3), 237-244 (2017).
- Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model. Journal of Cardiothoracic Surgery. 11 (1), 163 (2016).
- Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circulation Research. 100 (2), 263-272 (2007).
- Ong, C. S., et al. Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes. Scientific Reports. 7 (1), 4566 (2017).
- Kelm, J. M., et al. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. Journal of Biotechnology. 148 (1), 46-55 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).
- Zuppinger, C. 3D culture for cardiac cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (7 Pt B), 1873-1881 (2016).
- Langenbach, F., et al. Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering. Nature Protocols. 6 (11), 1726-1735 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1. Cell Tissue Research. 288 (1), 87-93 (1997).
- Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nature Protocols. 2 (3), 481-485 (2007).
- Pimentel, C. R., et al. Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network. Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).
- Shimizu, T., et al. Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues. The FASEB Journal. 20 (6), 708-710 (2006).
- Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
- Ong, C. S., et al. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. Journal of Visualized Experiments. 125 (e55438), (2017).
- Tan, Y., et al. Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids. Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).
- Karra, R., Poss, K. D. Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration. Journal of Clinical Investigation. 127 (2), 427-436 (2017).
- Bartholoma, P., et al. Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents. Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 814-822 (2005).
