Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

שיטה המבוססת על עובש נטו הבריאה ברקמת הלב לגרדום ללא תלת מימדי

doi: 10.3791/58252 Published: August 5, 2018

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת-עובש נטו ליצירת רקמות לגרדום ללא לב תלת מימדי עם המבנית משביע רצון והתנהגות מכות סינכרוני.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר של הרומן נטו מבוסס-עובש שיטה קלה ליצירת תלת-ממדיים (3-D) רקמות הלב ללא חומר נוסף לגרדום. Pluripotent אנושית-induced גזע-תא-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), fibroblasts הלב האנושי (HCFs), יפתור תאי אנדותל (HUVECs) הם מבודדים, המשמש ליצירת השעיה התא עם 70% iPSC-CMs, 15% HCFs, ו- 15% HUVECs. . הם תרבותי משותף במערכת "התלויים טיפה" מצורף נמוך במיוחד, אשר מכיל את micropores עבור עיבוי מאות spheroids בבת אחת. התאים צבירה ויוצרים באופן ספונטני המכות spheroids אחרי 3 ימים של תרבות משותפת. Spheroids שנקטפו, נזרע לתוך החור עובש הרומן, תרבותי על מטרף בחממה. Spheroids להפוך רקמה תפקודית בוגרת כ 7 ימים לאחר זריעה. הרקמות מרובה שכבות הנובעת מורכב מאוחה spheroids עם המבנית משביע רצון והתנהגות מכות סינכרוני. שיטה חדשה זו יש פוטנציאל מבטיח כשיטה לשחזור וחסכונית ליצירת רקמות מהונדסים לטיפול באי ספיקת לב בעתיד.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המטרה של הנדסת רקמות הלב הנוכחית היא לפתח טיפול כדי להחליף או לתקן את המבנה והתפקוד של רקמת שריר הלב הפצוע1. שיטות ליצירת דגמים תלת-ממדיים ברקמת הלב מפגין המאפיינים כויץ ו אלקטרופיזיולוגיות חשוב של רקמת הלב יליד במהירות הרחבת2,3. מגוון רחב של אסטרטגיות חקר ומשמשת מחקרים4,5. אלה שיטות נע בין שימוש ספציפי טבעיים וסינתטיים ביו hydrogels, כגון ג'לטין, קולגן, פיברין, פפטידים6, ביו-דיו התצהיר טכנולוגיות2 ו- bioprinting טכנולוגיות7.

הוכח, כי שיטות לגרדום ללא יכול לייצר רקמות דומות כמו שיטות מבוססות biomaterial, ללא החסרונות של שילוב חומרים זרים פיגומים8. אורן כספי. et al. הוכיח כי שילוב של סוגים שונים של תאים מאפשרת את הדור של vascularized מאוד אנושי ברקמת הלב מהונדסים9. הסנטר. ואח פיתח שיטה הדפסה תלת-ממדי עבור יצירת תיקון הלב של spheroids. תיקונים וכתוצאה מכך הם מורכב cardiomyocytes fibroblasts, תאי אנדותל יחס 70:15:1510. Spheroids הוכחו להיות יעיל "אבני בניין" הבריאה ברקמת הלב ללא לגרדום, כפי שהם עמידים נגד היפוקסיה ושולט מספיק מכנית השרשה11,12. מחקרים קודמים הדגימו מספר שיטות ייצור ספרואיד הבריאה, כולל השימוש של התליה זרוק שיטה, טווה מבחנות13, microfluidic מערכות14, משטחים שאינם מחסידי תרבות מצופה עם או ללא ציפוי מיקרו-עובש agarose15. ב פרוטוקול זה, אנו משתמשים התליה טיפה התקן, אשר מכיל את micropores עבור עיבוי מאות spheroids בבת אחת.

מחקר זה מציג של הרומן ובאיזו שיטה לגרדום ללא יעיל הבריאה ברקמת הלב, אשר כולל זריעה ידנית את spheroids לתוך חור מרובע עובש המקננת הרקמה על מטרף עבור ההבשלה. בתנאים הרגילים תרבות סטטי, דיפוזיה חמצן מוגבלת להיבטים החיצוניים של הבונה רקמות, וכתוצאה מכך נמק במרכז. עם זאת, עם העובש נטו, כל spheroids נזרע לתבנית שקועים בתקשורת עם תנועה fluidic קבוע, המאפשר פעפוע מוגברת של חומרים מזינים וחמצן. בנוסף, שיטה זו מבוססת על עובש מתיר יצירת סימולטני של רקמות בגדלים שונים מדבקות במינימום מאמץ ידנית, הרקמה הנובעת ניתן להסיר בקלות התבנית. שיטה חדשנית זו מאפשרת יצירת לשחזור ויעילה של מדבקות לב נטולת לגרדום, מרובה שכבות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת Cardiomyocytes

  1. מעיל טוב 6 צלחות עם קרום המרתף מטריקס ותרבות אנושית-induced גזע pluripotent (hiPSCs) כפי שתואר לעיל17.
  2. להבדיל hiPSCs אל תוך שימוש בשיטות שתוארו18hiPSC-CMs.
  3. ב- 16-18 d פוסט-בידול, להשעות את cardiomyocytes בשטיפת בכל טוב עם 2 מ ל 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ללא סידן או מגנזיום, ואחריו הדגירה 1 מ"ל/טוב של ריאגנט דיסוציאציה של טריפסין או תא-(ראה טבלה של חומרים) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. לנטרל הכימית דיסוציאציה טריפסין או תא (ראה טבלה של חומרים) באמצעות אמצעי אחסון שווה של המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) תא מדיה בתוספת B-27 (מדיה תא RPMI/B-27). פיפטה למעלה ולמטה כדי לשחרר תאים מודבקת.
  5. לאסוף את cardiomyocytes מושעה עם פיפטה סרולוגית 10-mL ומעבירים אותם אל צינור חרוטי 50-mL.
  6. Centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להשיג גלולה התא.
  7. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של מדיה תא RPMI/B-27.
  8. לשלב 20 µL תא השעיה עם כמות שווה של 0.4% Trypan blue פתרון ומערבבים בעדינות.
  9. השתמש hemocytometer ידני של סופרים ולקבל את הכדאיות ריכוז ותא של התליה תא.

2. הכנת Fibroblasts

  1. ליזום תרבות של פיברובלסט הלב האנושי (HCF) (סוג חדרית למבוגרים) קו תא כפי שתואר לעיל16.
  2. להשעות את HCFs על ידי המקננת בהם עם הכמות המתאימה של ריאגנט דיסוציאציה טריפסין או תא (ראה טבלה של חומרים) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר16. בשביל בקבוקון T175, שימש 10 מ"ל של ריאגנט דיסוציאציה טריפסין או תא.
  3. לנטרל הכימית דיסוציאציה טריפסין או תא (ראה טבלה של חומרים) באמצעות אמצעי אחסון שווה של מדיום, ואז להעביר את הדגימה אל צינור חרוטי 50-mL, centrifuge התליה תא ב x 250 g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לקבל גלולה.
  4. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של מדיום הגידול פיברובלסט (ראה טבלה של חומרים).
  5. לשלב 20 µL של התליה תא HCF עם כמות שווה של 0.4% trypan blue פתרון ומערבבים בעדינות.
  6. להשתמש מונה תא אוטומטית או ידנית hemocytometer נחשב ולקבל את הכדאיות ריכוז ותא של התליה תא חדש.

3. הכנה של תאי אנדותל

  1. ליזום תרבות של קו תא אנדותל (HUVEC) הוא יפתור כפי שתואר לעיל17. להשעות את HUVECs על ידי המקננת בהם עם הכמות המתאימה של ריאגנט דיסוציאציה טריפסין או תא (ראה טבלה של חומרים) למשך 3 דקות על טמפרטורת חדר17. לנטרל הכימית דיסוציאציה טריפסין או תא (ראה טבלה של חומרים) באמצעות אמצעי אחסון שווה של מדיום, ואז להעביר צינור חרוטי 50-mL, centrifuge התליה תא ב 250 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להשיג גלולה.
    הערה: עבור בקבוקון T175, 10 מ של ריאגנט דיסוציאציה טריפסין או תא שימש.
  2. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של מדיום הגידול תא אנדותל (ראה טבלה של חומרים).
  3. לשלב 20 µL של ההשעיה HUVEC, את הכתם עם כמות שווה של 0.4% Trypan blue פתרון ומערבבים בעדינות.
  4. השתמש מונה הניתן תא אוטומטית או hemocytometer ידני של ספור ולקבל את הכדאיות ריכוז ותא של התליה תא.

4. יצירה של תלויים טיפה Spheroids

  1. במקום לבלות את המכשיר טיפה אשר מכיל micropores 850 (כל אחד בקוטר של 350 מיקרומטר) לוחות 6-ובכן סטרילי.
  2. לבודד את שלושת סוגי תאים כמתואר לעיל: hiPSC-CMs, HCFs ו- HUVECs. לשלב אותם ביחס של 70% iPSC-CMs, HCFs 15% 15% HUVECs 50-mL צינור חרוטי עם מדיה תא RPMI/B-27-ריכוז של תאי 2,475,000 מ.
  3. לוותר על 4 מ"ל של התליה תא (2,475,000 תאים לכל mL) על כל טוב של מצורף נמוך במיוחד תלוי מערכת טיפה (בקוטר micropore של 350 מיקרומטר) לתוך צלחת 6-. טוב.
  4. Spheroids יהוו באופן ספונטני בתוך 12 שעות של מחלק התליה תא לתוך התליה המכשיר טיפה. נמשכות לתרבות עבור סכום כולל של 72 h (3 יח)-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% לחות ההבשלה של spheroids.
  5. לאחר 72 h של תרבות, לקצור את spheroids דרך הנקבוביות בתחתית התליה להפיל את המערכת על-ידי הצבת המכשיר לתוך קערה בינונית מתערבל אותו בעדינות כדי לשחרר את spheroids מן התליה המכשיר טיפה.

5. יצירת תיקון תלת-ממדי משתמש בתבנית נטו הרומן

  1. הבסיס, צלחת מרובע התחתון, התחתון נטו, ואת הצד בשכבות 10 רשתות הם התאספו כדי ליצור את התבנית הרומן בסיועם של זוג מלקחיים סטרילי. ראשית, מחסנית ליישר את הבסיס, צלחת מרובע התחתון ו למטה נטו באמצעות ההודעות בפינה. לאחר מכן, מחסנית, שכבה הרשתות בצד 10 מתחלפים כיוונים כדי ליצור רשת של צדדים נירוסטה משובחים.
  2. לרוקן את הבסיס עם PBS או בינוני כדי להפחית את המתח, אז, העברת כייר שהורכב על גבי הבסיס מילוי המילוי.
  3. הרטב את חלל עובש רשת PBS או במדיום באותה השיטה. לאט לאט למלא את spheroids לתוך חלל presupposed בגודל הרצוי (2 x 2 x 1 מ מ, 4 x 4 x 1 מ מ, או 6 x 6 x 1 מ מ).
    הערה: ודא כי 120% נפח הצפויה של spheroids מוזן לתוך החלל כך מצרפי תא יש קשר הדוק, נשאר סטטי.
  4. להרכיב את העליון נטו ואת הפלטה מרובע על ההודעות בפינה ולאבטח פקקים וצינורות אחזקות כדי למנוע כשלון של spheroids.
  5. להעביר את המערכת מלא עובש נטו צלחת 6-ובכן עם 6 מ של RPMI/B-27 תא מדיה או לתוך מיכל סטרילי עם מדיום מספיק כדי לכסות את התבנית שהורכב כולו.
  6. תקופת דגירה לצלחת 6-ובכן עם מערכת מלא עובש על מטרף מתנדנדים של 7-10 ימים ב 3000-4000 x g.
    הערה: משך הדגירה הוא החליט לפי גודל המדבקות הלב. טלאים גדולים יותר זמן הדגירה צריך להיות מוגברת על תיקון הלב ההבשלה.

6. הסרת התיקון של העובש נטו הרומן

  1. להסיר את המערכת עובש התקשורת ומניחים אותו על המשטח טיפול סטיריליים בקערה ס מ-10 סטרילי.
  2. הסר את הצינור אחזקות, פקקים, הפלטה מרובע, הרשת העליונה. החלק בזהירות את הרשתות בשכבות בצד אחד עם זוג מלקחיים סטרילי. לאחר decannulation, תיקון הלב שלם מתקבל על גבי התחתון נטו.
  3. להרים התחתון נטו עם התיקון באמצעות מלקחיים סטרילי ולהעביר התחתון נטו לתוך תבשיל 35 מ מ 5 מ של RPMI/B27 מדיה. בעדינות שחרר את התיקון מלמטה נטו מאת לאט מתערבל נטו בצלחת, או עם המגרד של התא סטרילי. לאחר ניתוק מלמטה נטו, רקמת הלב יכול להיות מחונן עם RPMI/B27 מדיה
  4. להמשיך דגירה התיקון לב לתרשים תלת-ממדי בצלחת 35 מ מ. מכות סינכרונית פונקציונלי יכול להיות שנצפו מוקדם ככל 24 שעות לאחר הסרת של העובש.
  5. לאחר הסרת התיקון כייר נטו, לבחון את צורתה נשמר עם יושרה, את עוצמת המכות סינכרונית גדל עם הזמן.
    הערה: תלת-ממדי נטו מבוסס-עובש לב המדבקות הציג שילוב חשמלי של רכיב cardiospheres לאחר decannulation. הבחנו תדר הכאה ועד 60 80 פעימות לדקה. זה נמשך יותר מ- 60 יום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בניסויים שלנו, אנחנו מנוצל השעיה תא של 70% iPSC-CMs, HCFs 15% 15% HUVECs בתקשורת תא RPMI/B-27-ריכוז של תאי 2,475,000 מ. לאחר יצירת התליה תא, וויתרנו 4 מ"ל של התליה תא כדי כל טוב של מצורף נמוך במיוחד תלוי במערכת המסירה, כפי שמתואר בשלב 4.3 של הפרוטוקול. השימוש של התליה מערכת טיפה, גרמו היווצרות ספונטנית של מאות להכות spheroids אחרי 3 ימים של תרבות-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% לחות. Spheroids נצפו בקלות כדי להיות פועם תחת מיקרוסקופ אור בבית 4 X 10 X הגדלה עם קוטר ממוצע של מיקרומטר 350 לאחר 72 h של תרבות (איור 1).

בסוף שלב 6.5 של הפרוטוקול, לאחר קציר של spheroids, כייר היה נזרע בקלות עם שיטות פשוטות pipetting. Culturing התבנית המותר עבור פיוז'ן של spheroids; עוקבות הסרת התבנית הביא תיקון הלב שלם עם מכנית. לאחר הסרת עובש, 24 שעות ביממה של תרבות, מכות סינכרונית פונקציונלי של רקמת הלב נצפתה, המאשר שילוב מכני spheroids (איור 2, משמאל). הבחנו גם שכבות מרובות של spheroids היו להכות ספונטני, בצורה מתואמת על מיקרוסקופ אור (איור 2, נכון).

ניתוח immunohistochemical של הרשת מבוססת-עובש תיקון הלב תלת-ממדי בוצעה גם עם מיכשור טרופונין טי קונאפוקלית ההדמיה הראה כי cardiomyocytes מיושר היטב את כל הציג ביטוי טרופונין T (איור 3).

Figure 1
איור 1 : יצירה של תלויים טיפה spheroids. Cardiomyocytes נגזר תאי גזע pluripotent אנושית-induced (hiPSC-CMs) fibroblasts הלב האנושי (HCFs), תאי אנדותל יפתור (HUVECs) היו מבודדים, המשמש ליצירת השעיה התא עם 70% iPSC-CMs, HCFs 15% 15% HUVECs, ב ריכוז של תאים 2,475,000 לכל mL. לאחר 72 h, spheroids בנוי באופן ספונטני בתוך כל micropore נצפו בקלות כדי להיות פועם תחת מיקרוסקופ אור. סרגל קנה המידה בחלונית השמאלית = 1,000 מיקרומטר; סרגל קנה מידה שבחלונית הימנית = 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : יצירה של רקמת לב מרובה שכבות מציג שילוב רכיב spheroids. לאחר ניתוק כייר נטו, תיקון הלב תלת-ממדי של שמר על צורתו והפגינו מהמכות סינכרונית, המציין שילוב מכני spheroids, כפי שמוצג בחלונית השמאלית (איפה הבר בקנה מידה = 1,000 מיקרומטר). Multilayers מוערמת של spheroids נבדקו עם מיקרוסקופ אור, כפי שמוצג בלוח הימני (איפה הבר בקנה מידה = 400 מיקרומטר), ולא נצפתה להכות ספונטני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : Immunofluorescence הערכה של רקמת הלב. על ניתוח immunofluorescence, נמצא את רשת מבוססי עובש תלת-ממדי ברקמת הלב מורכב cardiomyocytes מיושר היטב עם ביטוי טרופונין T. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המשמעות של שיטה זו נעוץ הפארמצבטית שלה ואת האפקטיביות של רקמת הלב הנובעת מרובה שכבות. בתחום של הנדסת רקמות הלב, אחת המטרות הנוכחית היא לזהות שיטה לבנות מכות מרובה שכבות, פונקציונלי תיקונים לב תלת-ממדי. . מדווחים שיטה לשחזור ויעילה של יצירת רקמות הלב מרובה שכבות על ידי זריעה ידנית ישירה של spheroids מורכב cardiomyocytes, תאי אנדותל ו fibroblasts לתוך תבנית נטו הרומן. כייר נטו להשתמש בשיטה זו יש מגוון רחב של גדלים שונים ליצירת רקמות 2 x 2 x 1 מ מ ועד 6 x 6 x 1 מ מ. כן, ניתן לשנות את הטכניקות שתיארנו צורות עובש שונים ולמערכות בהתאם הגיאומטריה של הרקמה הרצויה. תא תיאר ריכוזים של יחסי אופטימציה בעבר עבור hiPSC-CMs, שינויים לסוג תאים שונים ידרשו הערכה נוספים.

היצירה במבחנה של רקמות הלב תלת-ממדי באמצעות טכנולוגיית bioprinter חקר בתקווה לפתח מודלים איבחוניות. עם זאת, שיטות bioprinting הנוכחי מסורבל, דורש זמן ניכר ושימוש של מבנים תמיכה נלווים כגון מחטים או חומרים לגרדום. הנוכחות של חיובים משניים אלה תומכים מבנים ירידות פעפוע של חומרים מזינים ו חמצן18. לכן, נמק במרכז היא דאגה עיקרית ב בונה לב תלת-ממדי הנוכחי, בשל היעדר נימים לאספקת חמצן וחומרים מזינים19. . Sakaguchi et al. להחיל את השיטה של sandwiching מונחה תא גליונות ושימוש המיטה וסקולרית ריאקטורים לפתח רשת אנדותל של20. במערכת עובש נטו המוצגת כאן, חלל עובש יכול לאפשר דיפוזיה מספקת של חומרים מזינים וחמצן ללא הדרישה של כל המבנים התומכים או פיגומים. יתר על כן, בשיטה מבוססת-עובש נטו יעיל, לא דורשת כישורים מיוחדים עבור שניהם זריעה של spheroids לתוך העובש ותחזוקה של התיקון עוקבות. בתור שכזה, זה בצורה מהירה וזולה לרכוש באופן סינכרוני להכות ותיקוני לב פונקציונלי.

כדי למטב את הקוטר ספרואיד ואת המספר של spheroids להשתמש בכל אחד מהם תלוי התקן טיפה, אנחנו בוצעו שינויים לגבי סוגי תאים ו כמויות ופתרון. השיטה מבוססת על עובש נטו, הקוטר ספרואיד ואת המספר של spheroids השתמשו היו חשיבות עליונה ליצירת רקמת הלב תפקודית נאותה גודל. ניסינו ריכוזים תא שונים כדי למטב את גודל ספרואיד הטוב ביותר עבור הבריאה ברקמת הלב. שלושה סוגי תאים שימשו כדי ליצור spheroids הלב ע י התליה טיפה התקן, שכללה 70% iPSC-CMs, 15% HCFs ו- 15% HUVECs. תחת מיקרוסקופ אור, spheroids בנוי באופן ספונטני בתוך כל micropore נצפו בקלות להכות לאחר 72 h. הבחנו כי בקוטר של spheroids גדל עם ריכוז התליה תא המכשיר טיפה. ניסינו ריכוזים שונים של spheroids, מ spheroids 100 ל 300 spheroids של כל התקן, עם 4 מ של RPMI/B27 בינוני. עם ניסויים רבים, מצאנו זה את ריכוז תאי 2,475,000 mL הניב של קוטר אופטימלית של spheroids תוצאות. בקוטר אופטימיזציה של spheroids, שחווינו ללא מאמץ ואוסף זריעה של spheroids ב כייר נטו מוערמת, אשר היו צעדים חשובים בשיטה מבוססת-עובש נטו עבור יצירת ברקמת הלב מרובת שכבות.

השלב הקריטי ביותר של הפרוטוקול הוא אופטימיזציה של גודל ספרואיד. ראוי להזכיר כי spheroids בשימוש בשיטה זו הם קטנים יותר מהגודל של גופים ספרואיד בשימוש בטכניקות אחרות bioprinting21. Spheroids גדולים יותר נמצאו יש נמק במרכז בשל דיפוזיה לא מספקת של תזונה וחמצן22. עם spheroids בקוטר קטן יותר, נאותה דיפוזיה של חומרים מזינים וחמצן למרכז של כל ספרואיד בקלות רבה יותר מושגת, הגדלת את הכדאיות הסלולר בכל תחומי התיקון תוצאות. בפרוטוקול המובאת כאן, קוטר ספרואיד של מיקרומטר 350 מאפשר הכדאיות תא משופר יותר קשר שטח בין spheroids, אשר אנו מאמינים תורמת ליצירת מוצלחת של רקמת הלב באמצעות זה עובש נטו. לכן, זה צעד קריטי המתודולוגיה המתוארת. להתאים את פרוטוקול סוגי תאים אחרים, נדרשים נוספים ספרואיד גודל אופטימיזציה ניסויים.

המגבלות של גישה זו כוללים את היכולת לשלוט בדיוק הערימה של spheroids. התוצאה באזורים של הלא-אחידות עובי heterogenous ותיקונים רקמות וכתוצאה מכך. יתר על כן, למרות הפעם תרגולים בפועל עבור זריעה של spheroids הוא מזערי, היצירה של תיקונים מרובה שכבות גדולות דורש זמן בלתי-תרבות מורחב כדי לאפשר היתוך של spheroids.

עבור יישומים עתידיים, הרומן נטו מבוסס-עובש שיטה זו היא שיטה לשחזור ויעילה של יצירת רקמות הלב תלת-ממדי, לגרדום ללא במינימום מאמץ ידנית. הרקמות מרובה שכבות וכתוצאה מכך מורכב מאוחה spheroids עם המבנית משביע רצון והתנהגות מכות סינכרוני. שיטה זו מבוססת על עובש נטו ' מציג חסכוני ומדרגי אלטרנטיבה הנוכחי ביו-זיוף שיטות של רקמות מהונדסים, יש את הפוטנציאל ליצור רקמות הלב החלים קלינית לטיפול באי ספיקת לב עם המטרה של החלפת cardiomyocytes איסכמי או לקוי23. בנוסף, שיטה זו יכול להיות מנוצל כדי ליצור ברקמת הלב עבור הקרנות לחולה ספציפי של סמים הרומן פוטנציאל טיפולי24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים להכיר את מקור המימון הבאים: קסם כי ענייני הקרן למחקר קרדיו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Cardiac fibroblasts (HCF) Sciencell 6310
FM-2 Consists of Basal Medium Sciencell 2331 HCF culture medium
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) Lonza CC-2935
EGM+Bullet Kit  Lonza CC5035 HUVEC culture medium
E8 media  Invitrogen A1517001 HiPSC culture medium
Geltrex  Invitrogen A1413202
TrypLE Express Enzyme (1X) Thermo Fisher 12604013 Trypsin and Cell dissociation reagent
RPMI media Invitrogen 11875093 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
B-27 supplement (50x) Thermo Fisher 17504044 RPMI media with B-27 supplement is hiPSC-CM culture medium
Trypan Blue Solution, 0.4% Thermo Fisher 15250061
Novel net mold  TissueByNet Co.,Ltd NM25-1
Hanging drop plate Kuraray Co.,Ltd MPc350
6 well plates  Sigma-Aldrich CLS-3516

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gao, L., et al. Myocardial Tissue Engineering With Cells Derived From Human-Induced Pluripotent Stem Cells and a Native-Like, High-Resolution, 3-Dimensionally Printed Scaffold. Circulation Research. 120, (8), 1318-1325 (2017).
  2. Borovjagin, A. V., Ogle, B. M., Berry, J. L., Zhang, J. From Microscale Devices to 3D Printing: Advances in Fabrication of 3D Cardiovascular Tissues. Circulation Research. 120, (1), 150-165 (2017).
  3. Tandon, N., et al. Electrical stimulation systems for cardiac tissue engineering. Nature Protocols. 4, (2), 155-173 (2009).
  4. Duran, A. G., et al. Regenerative Medicine/Cardiac Cell Therapy: Pluripotent Stem Cells. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 66, (1), 53-62 (2018).
  5. Lux, M., et al. In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation. Acta Biomaterialia. 30, 177-187 (2016).
  6. Eschenhagen, T., et al. Three-dimensional reconstitution of embryonic cardiomyocytes in a collagen matrix: a new heart muscle model system. The FASEB Journal. 11, (8), 683-694 (1997).
  7. Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23, (3), 237-244 (2017).
  8. Sugiura, T., Hibino, N., Breuer, C. K., Shinoka, T. Tissue-engineered cardiac patch seeded with human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes promoted the regeneration of host cardiomyocytes in a rat model. Journal of Cardiothoracic Surgery. 11, (1), 163 (2016).
  9. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circulation Research. 100, (2), 263-272 (2007).
  10. Ong, C. S., et al. Biomaterial-Free Three-Dimensional Bioprinting of Cardiac Tissue using Human Induced Pluripotent Stem Cell Derived Cardiomyocytes. Scientific Reports. 7, (1), 4566 (2017).
  11. Kelm, J. M., et al. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. Journal of Biotechnology. 148, (1), 46-55 (2010).
  12. Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 35, (1), 137-145 (2016).
  13. Zuppinger, C. 3D culture for cardiac cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1863, (7 Pt B), 1873-1881 (2016).
  14. Langenbach, F., et al. Generation and differentiation of microtissues from multipotent precursor cells for use in tissue engineering. Nature Protocols. 6, (11), 1726-1735 (2011).
  15. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31, (2), 108-115 (2013).
  16. Agocha, A., Sigel, A. V., Eghbali-Webb, M. Characterization of adult human heart fibroblasts in culture: a comparative study of growth, proliferation and collagen production in human and rabbit cardiac fibroblasts and their response to transforming growth factor-beta1. Cell Tissue Research. 288, (1), 87-93 (1997).
  17. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nature Protocols. 2, (3), 481-485 (2007).
  18. Pimentel, C. R., et al. Three-dimensional fabrication of thick and densely populated soft constructs with complex and actively perfused channel network. Acta Biomaterialia. 65, 174-184 (2018).
  19. Shimizu, T., et al. Polysurgery of cell sheet grafts overcomes diffusion limits to produce thick, vascularized myocardial tissues. The FASEB Journal. 20, (6), 708-710 (2006).
  20. Sakaguchi, K., Shimizu, T., Okano, T. Construction of three-dimensional vascularized cardiac tissue with cell sheet engineering. Journal of Controlled Release. 205, 83-88 (2015).
  21. Ong, C. S., et al. Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting. Journal of Visualized Experiments. 125, (e55438), (2017).
  22. Tan, Y., et al. Cell number per spheroid and electrical conductivity of nanowires influence the function of silicon nanowired human cardiac spheroids. Acta Biomaterialia. 51, 495-504 (2017).
  23. Karra, R., Poss, K. D. Redirecting cardiac growth mechanisms for therapeutic regeneration. Journal of Clinical Investigation. 127, (2), 427-436 (2017).
  24. Bartholoma, P., et al. Three-dimensional in vitro reaggregates of embryonic cardiomyocytes: a potential model system for monitoring effects of bioactive agents. Journal of Biomolecular Screening. 10, (8), 814-822 (2005).
שיטה המבוססת על עובש נטו הבריאה ברקמת הלב לגרדום ללא תלת מימדי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, Y., Yeung, E., Lui, C., Ong, C. S., Pitaktong, I., Huang, C., Inoue, T., Matsushita, H., Ma, C., Hibino, N. A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation. J. Vis. Exp. (138), e58252, doi:10.3791/58252 (2018).More

Bai, Y., Yeung, E., Lui, C., Ong, C. S., Pitaktong, I., Huang, C., Inoue, T., Matsushita, H., Ma, C., Hibino, N. A Net Mold-based Method of Scaffold-free Three-Dimensional Cardiac Tissue Creation. J. Vis. Exp. (138), e58252, doi:10.3791/58252 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter