Summary
在这里,我们提出了弹性染色方案,以识别pT3N0M0胃癌组织在形式固定,石蜡嵌入部分的弹性纤维。随后,我们描述了一种确定肿瘤细胞是否侵入弹性层压外的方法。
Abstract
弹性层状通常位于亚中上层,毗邻围肠中皮细胞,在血氧素和欧辛(H&E)染色上是两年期的,但可以通过弹性染色可视化。弹性染色的一个重要好处是,它很容易确定肿瘤细胞是否侵入了弹性层压。这有助于检查围膜表面入侵的程度,从而区分胃肠道癌的pT3和pT4阶段。在这项研究中,我们提出了一个协议,以识别在形式固定,石蜡嵌入pT3N0M0胃癌组织部分的弹性纤维。我们准备固定在幻灯片上的5μm石蜡部分,然后在染色过程中对所有幻灯片进行脱蜡和补水。随后,所有部分均被高锰酸钾氧化,由草酸漂白,被弹性染色染色,并反染范吉森。最后,我们考察了染色的效果;弹性层压是彩色蓝黑色和胶原纤维被染成红色,而癌细胞被染色在不同色调的黄色。我们还详细介绍了用于确定癌细胞和弹性层压作用关系的方法。该方法简单、成本低,因其对弹性纤维的选择性和真实效果,在胃肠癌的围膜表面入侵的鉴定中应用广泛。
Introduction
根据肿瘤、节点和转移(TNM)癌症分期系统,病理阶段pT4的胃癌预后明显比pT3(第8次UICC/AJCC)1的晚期差。与胃癌,原发性肿瘤(pT)的分类通常取决于肿瘤入侵的深度2。病理阶段 pT3 胃癌被定义为通过肌肉体侵入到亚血清组织中的癌症,而 pT4 胃癌被定义为渗透到内脏围气体的表面的癌症。围层表面侵入性的存在是区分两个阶段2的关键。然而,由于围肠间细胞层非常薄,在手术、术后治疗和固定3过程中可能会受损。此外,肿瘤相关的炎症变化和纤维化会损害围肠的正常解剖结构,因此很难仅使用H&E染色4准确判断围肠表面入侵。目前的辅助诊断方法,如细胞学和免疫组织化学,由于是假阳性或成本效益低,诊断价值有限。
血清膜包括围肠、胸膜和心包膜,由中皮膜、基底膜和亚中上层7组成。血清膜的一个常见组织学特征是,在亚中皮层中存在弹性层,与中上层细胞8、9相邻。弹性拉米纳具有很强的抗损伤能力,如果间皮细胞被严重的肿瘤相关炎症或纤维化3破坏,可以作为替代预后标记。弹性层压片主要由弹性蛋白和微纤维10组成,可以通过弹性染色进行可视化。弹性染色使用的主要原因是弹性素与弹性素溶液中的红素酚组形成氢键,导致弹性纤维被染成蓝黑色。在范吉森(VG)对比染色后,胶原纤维可以染成红色,肌肉纤维和红血球可以染黄色8,11,12,13。
肺癌的TNM分期第八版将内脏胸膜入侵(T2)定义为肿瘤入侵,超出弹性层膜或内脏胸膜2表面的入侵。对结肠直肠癌的研究表明,pT3结肠直肠癌的弹性层压瘤入侵可能是预后不佳的原因。大肠癌的5年无病和整体存活率也被证明像pT4a13,14,15。根据我们以前对弹性染色的研究,弹性拉米纳入侵对pT3胃癌的预后有显著的负面影响,应像pT4a胃癌12一样对待。因此,这种简单且经济高效的方法可以帮助消除通过H&E染色获得的结果的不确定性,以及与细胞学和免疫性化学在内的其他辅助诊断方法相关的其他常见限制。别人。该方法可有效地诊断胃肠癌的围膜表面入侵,特别是在一些模棱两可的情况下。它很方便,因为H&E污渍和其他污渍通常很难识别这种入侵。这种方法还确保了结果的可靠性,因为它非常有选择性,尤其是弹性纤维。在这里,我们进行弹性染色,以确定肿瘤细胞是否侵入了pT3N0M0胃癌12的弹性层压。
该方法用于识别形式固定、石蜡嵌入部分的组织中的弹性纤维,也可用于冷冻部分。在这里,我们选择石蜡嵌入部分,以最佳维护细胞和组织形态。此协议中的所有步骤都在室温下执行。一种商业染色试剂盒,包括高锰酸钾溶液、草酸溶液、艾莱他溶液和Van Gieson溶液。
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Protocol
1994年至2005年间,中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院的两名经验丰富的胃肠道病理学家从胃肿瘤胃切除术患者中抽取了患者样本,pT3N0M0阶段胃癌术后病理诊断(根据第七期TNM分期)。这项研究得到了道德审查委员会的批准。
1. 分段
- 将石蜡块放入雪橇微体固定支架中,该支架可在刀片上前后移动。调整块和微托刀之间的最佳角度。
注:最佳角度不仅取决于刀片的几何形状,还取决于切削速度和技术。 - 根据需要修剪石蜡块并将其切成 5 μm 厚的横截面。
- 将石蜡 5-μm 部分置于约 40 - 45 °C 的水浴中,然后将其从水安装到玻璃滑块上,每张滑片一部分。
- 小心地将安装部分按在纸巾上,以清除任何残留水和潜在的气泡。
- 让部分空气干燥30分钟,然后在45-50°C的烤箱中烘烤2小时。
2. 所有幻灯片的脱蜡和补液
- 将幻灯片浸入二甲苯中的科普林罐中 10 分钟。
- 从第一个二甲苯罐中拿出幻灯片,将它们浸入另一个罐子中 10 分钟。
- 现在,将幻灯片浸入 100% 乙醇中,在科普林罐中浸泡 5 分钟。
- 将幻灯片浸入 100% 乙醇中,另一个 Coplin 罐中,也持续 5 分钟。
- 将幻灯片浸入 95% 乙醇中,在科普林罐中浸泡 2 分钟。
- 将幻灯片浸入 70% 乙醇中,在科普林罐中浸泡 2 分钟。
注:在执行上述步骤时,确保幻灯片完全沉浸在解决方案中。 - 用蒸馏水在新的罐子中短暂冲洗幻灯片。
3. 染色
- 在继续染色之前,用纸巾擦去幻灯片上组织周围的任何多余的溶液。
- 将幻灯片置于室内温度和室内湿度条件下,以避免在整个染色过程中使滑道上的组织干燥。
- 用几滴高锰酸钾氧化幻灯片5分钟。确保高锰酸钾的体积足以覆盖每张幻灯片上的组织部分。
- 在科普林罐中用蒸馏水冲洗氧化幻灯片,更换 2 - 3 个。观察组织的蓝色。
- 现在,通过加入几滴草酸5分钟漂白这些幻灯片。
- 将幻灯片浸入装满蒸馏水的科普林罐中,冲洗幻灯片。执行冲洗 2x - 3x。
- 现在,用 95% 的酒精短暂清洗这些幻灯片,然后将幻灯片浸入石化溶液 (5 g/L) 中,持续 8 - 24 小时。
注:弹性体溶液易挥发性,染色时间相对长,因此最好将带弹性染色的幻灯片浸入密封容器中,如带密封盖的透明玻璃瓶。容器的容量和艾莱他溶液的体积取决于浸入式幻灯片的数量,只要它能够完全浸入所有幻灯片。 - 将这些幻灯片直接浸入 95% 乙醇中 1 - 2 分钟,以很好地区分每个组织部分。
注:分化是指组织部分的电荷的变化,它去除组织吸收的多余染色,使颜色更清晰。在艾莱他溶液染色后,样品不应用蒸馏水清洗,以避免任何分化困难。必要时,检查蓝黑色弹性纤维染色和灰色背景。最好稍微低估组织,因为随后的范吉森的计数器污渍也可以提取弹性染色。 - 分化后用蒸馏水完全冲洗这些幻灯片。
- 在范吉森的解决方案中将幻灯片反比 1 分钟。
注:Van Gieson 溶液的体积需要足够,以便能够将组织部分完全浸入每张幻灯片上。 - 迅速将 95% 的乙醇滴到这些切片上几秒钟,以很好地区分每个组织部分。
注意:不要在范吉森的反面污渍后用任何水冲洗幻灯片,因为这可能会削弱甚至洗去范吉森的反面污渍的颜色。
4. 脱水和安装
- 将幻灯片浸入 95% 酒精中 5 分钟,使其快速脱水。
- 继续脱水这些切片2变化100%酒精,每次浸入幻灯片5分钟。
- 将幻灯片浸入 2 次二甲苯中,每次 3 分钟。
- 在幻灯片中加入一滴树脂安装介质,并将盖玻片放在顶部。
5. 幻灯片的微观观察
- 找到血清方向并观察弹性染色的结果:弹性纤维(拉米纳)被染色蓝黑色,胶原纤维被染成红色,肌肉纤维染成黄色。
- 寻找整个幻灯片中的癌细胞:癌细胞被染成黄色12。
- 确定癌细胞和弹性层压之间的位置关系。
注意:这里将有两种情况。只要有一个肿瘤细胞已经入侵超过弹性层片在整个幻灯片,那么这个情况可以被认为是弹性拉米纳入侵。另一方面,只有当整个幻灯片中没有超过弹性层压的肿瘤细胞入侵时,此情况可被视为弹性拉比纳非入侵。
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Representative Results
成功的弹性染色清楚地揭示了pT3胃癌中的弹性拉米纳和癌细胞。图1 - 低功率场,在弹性蛋白溶液染色后进行显微检查,在范吉森的逆色之前,根据上述协议 - 显示弹性层状接近血清中质细胞,并在长丝的形式,并且肿瘤细胞和弹性拉比纳之间仍有一定的距离。图2是范吉森的反面染色的典型弹性染色,其中弹性层片被染成蓝黑色,胶原纤维被染成红色,肌肉纤维和癌细胞被染成黄色。弹性层状层入侵可视为癌细胞穿透弹性层压(图2B),而弹性层状非入侵可被视为接近弹性拉米纳的癌细胞,但不侵入(图2) A)如果弹性染色显示一个重复的结构,这表明有一个以上一层弹性拉米纳,如果肿瘤入侵没有侵入超过最外层弹性拉米纳(指示箭头),样品应诊断为弹性拉米纳非入侵 (图 2C)。
图 1:范吉森反染色前的弹性染色的微观图像。弹性层压用箭头标记,"T"表示肿瘤细胞,"S"表示血清膜的方向。弹性层状可以清楚地可视化的弹性染色。箭头表示弹性拉比纳。刻度条为 200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2:用范吉森的反污弹性染色的代表性结果。弹性层压用箭头标记,"T"表示肿瘤细胞,"S"表示血清膜的方向。(A) 肿瘤细胞生长在弹性层状层附近,而不会侵入它。(B) 肿瘤细胞侵入弹性层压外.(C) 肿瘤细胞在弹性层状层附近表现出入侵,但不会穿透最外层弹性层压。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
这里提出的该方法为识别亚血清弹性层压提供了一种准确的方法。该方法可用于评估肿瘤细胞是否侵入了pT3N0M0胃癌12中的弹性层。弹性层压在H&E染色部分是红色的,很难与胶原纤维区分,其他现有的辅助诊断方法,如细胞学和免疫组织化学,也具有有限的诊断价值。在围肠灌溉液中发现肿瘤细胞并不一定表明原发性肿瘤存在血清入侵,这可能是由于淋巴结转移或其他遥远的转移5。由于间皮细胞很可能被纤维炎症破坏,免疫组织化学诊断可能不可行,工作量较大。然而,弹性染色作为一种经典的特殊染色方法,可以使弹性层状可清晰可见11、12、13。标准手术后,根据此协议,弹性层状可染成蓝黑色,胶原纤维可染成红色,肌肉纤维和红血球可染成黄色,这使得病理学家更容易评估其分布情况。肿瘤细胞和弹性拉米纳。弹性染色在诊断标准中也可能有一些限制。例如,在某些情况下,由于明显的肿瘤相关纤维炎症,弹性层膜的结构不明确。不同的观察者在理解和实际应用诊断标准在一个病例中可能存在差异,尽管一些病理学家仍然认为,如果肿瘤组织侵入超过剩余弹性层压的一侧,它可以被诊断为弹性拉米纳入侵17。然而,随着弹性染色应用的不断普及和病理学家诊断共识的标准化,这一局限性将在未来减弱。
该协议的关键步骤包括正确控制区分过程和标准组织标本选择。在艾莱他溶液染色后,幻灯片不应用蒸馏水清洗,但差异化的幻灯片需要直接放置在95%乙醇中1-2分钟,以避免分化困难。范吉森反污后,应避免滑梯与水接触;相反,分化切片需要快速用95%乙醇洗涤几秒钟。否则,范吉森的反色颜色将被削弱,甚至被洗脱。至于组织标本的选择,最重要的部分是围肠改变方向的区域,特别是急性角区,而不是平面间皮组织4覆盖的区域。本研究的所有病例均采用该方法绘制,组织标本选择的深度尽可能深,以评估肿瘤与serosa的关系。此外,本协议中的所有步骤都在室温下执行。由于弹性酶溶液易于挥发,而且染色时间相对长,因此最好将幻灯片浸入弹性染色溶液中密封的容器中。在微观观察中,弹性染色结果准确可靠。然而,在某些特殊情况下,需要考虑到格林等人提出的一些合理的诊断标准。16.在肿瘤相关纤维炎症导致弹性层膜结构明显不稳定的情况下,当肿瘤组织侵入一侧超过残余弹性层压时,可诊断为弹性层膜入侵。在粘腺腺癌的情况下,只有当细胞粘细胞成分侵入弹性拉米纳之外,它才能被诊断为弹性拉皮那入侵。如果弹性染色显示重复的弹性层压结构,则只有在肿瘤入侵超出最外层弹性层压时,才能诊断为弹性拉皮纳入侵。如果上述情况发生在一个或多个部分,该病例可被诊断为弹性拉米纳入侵16。
该协议演示了一种用于视觉识别胃癌中弹性层压的直观技术。这种技术是广泛的适应性,并可能扩大判断血清入侵的其他预后预测,如食管癌或卵巢癌17。它也可以用来识别血液和淋巴血管入侵在结肠直肠癌以及其他癌症,特别是在一些困难的情况下,因为弹性拉米那也存在于血管和淋巴内皮内皮。此外,弹性染色是廉价的,可以很容易地被病理学家在不同的网站18采用。此外,这种技术不仅限于肿瘤组织,但也可用于诊断皮肤病和血管疾病,如红斑狼疮,脱发,和胡萝卜动脉病变19,20。随着弹性染色技术的发展和对大样本肿瘤研究的积累,我们期望弹性染色在判断胃癌和结肠直肠癌的血清入侵时,能够被AJCC分期系统所接受。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者部分感谢国家自然科学基金(NO.81401902和NO.81501992)和湖南省自然科学基金(NO.2017SK2134,NO.2018JJ2238)的支持。手稿由广磊撰写。整个实验由杨光磊和杨海燕进行。作者感谢病理学家和跟踪患者数据的研究员的帮助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
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