Summary
Här presenterar vi ett protokoll av elastisk färgning för att identifiera elastiska fibrer i pT3N0M0 magcancer vävnader på formalin-fast, paraffin-inbäddade sektioner. Därefter beskriver vi en metod för att avgöra om tumörceller invaderar bortom den elastiska lamina.
Abstract
Den elastiska lamina, som vanligtvis ligger i sub-mesothelial skikt, intill bukhinnan mesothelial celler, är amfifila på hematoxylin och eosin (H & E) färgning men kan visualiseras genom elastisk färgning. En av de viktiga fördelarna med elastisk färgning är att det gör det enkelt att avgöra om tumörceller har invaderat bortom den elastiska lamina. Detta hjälper till att undersöka omfattningen av peritonealdialys yta invasion, därigenom skilja pT3 och pT4 stadier i mag-tarmcancer. I denna studie presenterar vi ett protokoll för att identifiera elastiska fibrer i formalin-fast, paraffin-inbäddade pT3N0M0 magcancer vävnad sektioner. Vi förbereder 5-μm paraffin avsnitt fast på diabilder, och sedan alla bilder är avparaffinerade och rehydreras under färgning förfarande. Därefter, alla sektioner oxideras av kaliumpermanganat, blekt av oxalsyra, färgade av elastisk färgning, och motmålat av van Gieson ' s. Slutligen undersöker vi effekten av färgning; elastisk lamina är målat blå-svart och kollagenfibrer är färgade röda, medan cancerceller är färgade i varierande nyanser av gult. Vi beskriver också i detalj de metoder som används för att bestämma positionella förhållandet mellan cancerceller och elastisk lamina. Denna metod är enkel, låg kostnad, och allmänt tillämplig i identifieringen av peritonealdialys yta invasion i mag-tarmcancer på grund av dess enastående selektivitet för elastiska fibrer och autentiska resultat.
Introduction
Enligt tumören, Node, och metastaser (TNM) cancer Staging system, prognosen för magsäckscancer vid patologiska skede pT4 är betydligt värre än på pT3 (8: e UICC/AJCC)1. Med ventrikelcancer, klassificering av den primära tumören (pT) beror oftast på djupet av tumörinvasion2. Pathologic Stage pT3 ventrikelcancer definieras som cancer invaderar genom muscularis hinna propria i subserosal vävnader, medan pT4 ventrikelcancer definieras som cancer tränger in på ytan av visceral peritoneum. Närvaron av peritonealdialys yta invasivitet är nyckeln för att skilja de två stadierna2. Emellertid, eftersom peritonealdialys mesothelial cell skiktet är mycket tunn, det kan skadas under operationen, postoperativ behandling, och fixering3. Dessutom kan tumörrelaterade inflammatoriska förändringar och fibros skada den normala anatomin i peritoneum, vilket gör det mycket svårt att korrekt bedöma peritonealdialys yta invasion med endast H & E färgning4. Nuvarande hjälp diagnosmetoder såsom cytologi och immunohistokemi är av begränsat diagnostiskt värde5,6 eftersom de är falskt positiva eller har en lågkostnads effektivitet.
Den serosal membran inkluderar peritoneum, pleura, och hjärtsäcken, och består av mesothelium, en basalmembran, och en sub-mesothelial Layer7. En vanlig histologisk egenskap hos serosal membranet är närvaron av en elastisk lamina i sub-mesothelial skikt, intill mesothelial celler8,9. Elastisk lamina har en stark anti-skadande förmåga och kan fungera som en alternativ prognostisk markör om mesothelial celler förstörs av svår tumörrelaterad inflammation eller fibros3. Elastisk lamina består huvudsakligen av elastin och microfibril10, som kan visualiseras genom elastisk färgning. Den främsta orsaken bakom användningen av den elastiska färgning är att elastin bildar en vätebindning med fenoliska gruppen av resorcinol i elastin lösning, vilket gör att elastiska fibrer ska färgas blå-svart. Efter van Gieson (VG) kontrasterande färgning, kollagenfibrer kan färgas röda och muskelfibrer och röda blodkroppar kan färgas gul8,11,12,13.
Den åttonde upplagan av TNM iscensättningen av lungcancer definierar visceral pleurautgjutning invasion (T2) som en tumörinvasion bortom elastisk lamina eller en invasion på ytan av visceral lungsäcken2. Studier på kolorektal cancer har visat att den elastiska lamina invasionen i pT3 kolorektal cancer kan vara orsaken till dåliga prognoser. Den 5-åriga sjukdomsfria och totala överlevnaden av kolorektal cancer har också visat sig vara som pT4a13,14,15. Baserat på våra tidigare studier om elastisk färgning, elastisk lamina invasion har visat sig ha en betydande negativ inverkan på prognosen för pT3 ventrikelcancer och bör behandlas på samma sätt som pT4a ventrikelcancer12. Därför kan denna enkla och kostnadseffektiva metod bidra till att eliminera osäkerhet i resultat som erhållits genom H & E färgning, och andra gemensamma begränsningar i samband med andra hjälp diagnosmetoder, inklusive cytologi och immunohistokemi, bland Andra. Denna metod kan användas effektivt för att diagnostisera peritonealdialys yta invasioner av mag-tarmcancer, särskilt i vissa tvetydiga fall. Det är bekvämt eftersom H & E fläcken och andra fläckar brukar göra det svårt att identifiera sådana invasioner. Denna metod garanterar också en tillförlitlighet av resultat eftersom det är mycket selektiv, särskilt till elastiska fibrer. Här, vi utför elastisk färgning för att avgöra om tumörceller har invaderat den elastiska lamina i pT3N0M0 ventrikelcancer12.
Denna metod används för att identifiera elastiska fibrer i vävnader på formalin-fast, paraffin-inbäddade sektioner, och kan användas för frysta sektioner också. Här väljer vi paraffin-inbäddade sektioner för bästa underhåll av cellulära och vävnadens morfologi. Alla steg i detta protokoll sker i rumstemperatur. En kommersiell infärgning kit som innehåller en kaliumpermanganat lösning, en oxalsyra lösning, en elastin lösning, och en van Gieson lösning används i den presenterade studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mellan 1994 och 2005, patientprover valdes av två erfarna gastrointestinala patologer i affilierade cancer sjukhuset i Xiangya School of Medicine, Central South University, från patienter som drabbades gastrektomi av magen neoplasmer, med en postoperativ patologisk diagnos av magsäckscancer vid pT3N0M0 Stadium (enligt den sjunde TNM-iscensättningen). Denna studie godkändes av etikprövningsnämnden.
1. snittning
- Placera paraffin blocket i en fast hållare av släden mikrotomen, som kan röra sig bakåt och framåt över bladet. Justera den optimala vinkeln mellan blocket och mikrotomkniven.
Obs: den optimala vinkeln beror inte bara på bladets geometri utan även på skärhastigheten och tekniken. - Trimma paraffin blocket efter behov och skär det i 5-μm-tjocka tvärsnitt.
- Placera paraffin 5-μm-sektionerna i ett vattenbad vid ca 40-45 ° c och montera den därefter från vattnet till glas glaset, en sektion per bild.
- Tryck försiktigt på den monterade delen mot en pappershandduk för att avlägsna eventuellt kvarvarande vatten och eventuella luftbubblor.
- Låt avsnitten lufttorka i 30 min och baka dem i en ugn vid 45-50 ° c för 2 h.
2. deparaffinization och rehydrering av alla diabilder
- Sänk ned glasen i xylen i en Coplinburk i 10 min.
- Ta ut bilderna från den första xylenburken och doppa dem i xylen i en annan burk i 10 min.
- Nu, sänk ner bilderna i 100% etanol i en Coplin burk för 5 min.
- Sänk ner bilderna i 100% etanol i en annan Coplin burk, även för 5 min.
- Sänk ned bilderna i 95% etanol i en Coplinburk i 2 min.
- Sänk ned bilderna i 70% etanol i en Coplinburk i 2 min.
Observera: se till att bilderna är helt nedsänkt i lösningarna när du utför stegen ovan. - Skölj glasen kort med destillerat vatten i en ny burk.
3. färgning
- Innan du fortsätter för färgning, torka bort eventuella överskott lösningar runt vävnaden på bilden med ett silkespapper.
- Placera bilderna i rumstemperatur och rums luftfuktighet för att undvika torkning av vävnaden på bilden under hela infärgningsprocessen.
- Oxidera bilderna med några droppar kaliumpermanganat i 5 min. se till att volymen av kaliumpermanganat är tillräckligt för att täcka vävnads sektionen på varje bild.
- Skölj de oxiderade glidningen med destillerat vatten i en Coplin burk med 2-3 förändringar. Observera den blå färgen på vävnaden.
- Nu, bleka dessa bilder genom att tillsätta några droppar oxalsyra i 5 min. se till att volymen av oxalsyra är tillräckligt för att helt täcka vävnaden avsnitt på varje bild.
- Skölj glasen genom att doppa dem i Koplinburken fylld med destillerat vatten. Utför sköljningen 2x-3x.
- Nu, tvätta dessa bilder kort i 95% alkohol, och sedan fördjupa bilderna i en elastin lösning (5 g/L) för 8-24 h.
Obs: elastin lösning är volatil, och dess infärgning tid är relativt lång, så det är bäst att doppa bilderna med elastisk färgning i en förseglad behållare, såsom en genomskinlig glas flaska med en tätning mössa. Behållarens kapacitet och elastin-lösningens volym beror på antalet nedsänkta diabilder, så länge det möjliggör fullständig nedsänkning av alla bilder. - Sänk ner dessa bilder direkt i 95% etanol för 1-2 min för att skilja varje vävnad avsnitt väl.
Anmärkning: differentiering hänvisar till förändringen i laddningen av vävnaden avsnitt, som tar bort överflödig färgning absorberas av vävnaden och gör färgerna tydligare. Efter elastin lösning färgning, bör prover inte tvättas med destillerat vatten för att undvika eventuella svårigheter i differentiering. Kontrollera mikroskopiskt, vid behov, för blå-svart elastiska fibrer färgning och grå bakgrund. Det är bättre att något underdifferentiera vävnaden eftersom den efterföljande van Gieson ' s motfärgning kan också något extrahera den elastiska fläcken. - Skölj dessa bilder helt med destillerat vatten efter differentiering.
- Motfärga bilderna i en van Giesons lösning i 1 min.
Obs: volymen av van Gieson lösning måste vara tillräckligt för att kunna fördjupa vävnaden avsnitt på varje bild helt. - Släpp snabbt 95% etanol på dessa skivor i några sekunder för att skilja varje vävnad avsnitt väl.
Obs: Skölj inte bilderna med något vatten efter van giesons motfärgning, eftersom det kan försvaga eller till och med eluera färgen på Van giesons motfärgning.
4. uttorkning och montering
- Sänk ner bilderna i 95% alkohol i 5 min för att låta dem torka snabbt.
- Fortsätt att torka dessa skivor med 2 förändringar av 100% alkohol, varje gång doppa bilderna i 5 min.
- Sänk ned bilderna i två förändringar av xylen, varje gång i 3 minuter.
- Lägg till en droppe resinous monteringsmedel till bilden och placera täckglaset på toppen.
5. mikroskopisk observation av diabilder
- Hitta serosal riktning och observera resultaten av elastisk färgning: elastiska fibrer (lamina) är färgade blå-svart, kollagenfibrer färgas röd, och muskelfibrer är färgade gula.
- Leta efter cancerceller i hela bilden: cancerceller är färgade gula12.
- Bestäm positionella förhållandet mellan cancerceller och elastisk lamina.
Obs: det kommer att finnas två situationer här. Så länge det finns en tumör cell som har invaderat bortom elastisk lamina i hela bilden, då detta fall kan betraktas som elastisk lamina invasion. Å andra sidan, bara när det inte finns någon tumör cell som har invaderat bortom elastisk lamina i hela bilden, kan detta fall betraktas som elastisk lamina icke-invasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En lyckad elastisk färgning avslöjar tydligt elastisk lamina och cancerceller i pT3 ventrikelcancer. Figur 1 -låg effekt fält, mikroskopiskt kontrolleras efter elastin lösning färgning, före van Gieson ' s motfärg enligt det protokoll som nämns-visar elastisk lamina är nära till serosal mesothelial celler och är fläckig blå-svart i form av glödtrådar, och det finns fortfarande ett visst avstånd mellan tumörcellerna och den elastiska lamina. Figur 2 är en typisk elastisk färgning med van Gieson ' s motfärgning, där elastisk lamina är målat blå-svart, kollagenfibrer är färgade röda, och muskelfibrer och cancerceller är färgade gula. Elastisk lamina invasion kan betraktas som cancerceller penetrerande den elastiska lamina (figur 2B), medan elastisk lamina icke-invasion kan betraktas som cancerceller som är nära den elastiska lamina, men inte invaderar (figur 2 A). I fall den elastiska färgning avslöjar en repetitiv struktur, vilket tyder på att det finns mer än ett skikt av elastisk lamina, om tumören invasionen inte invaderar bortom de yttersta elastiska lamina (indikeras med pilar), bör provet diagnostiseras som elastiska lamina icke-invasion (figur 2C).
Figur 1 : Den mikroskopiska bilden av elastisk färgning före van Giesons motfärgning. Den elastiska lamina är markerad med pilar, "T" representerar tumörceller, "S" representerar riktningen av serosal membranet. Den elastiska lamina kan tydligt visualiseras genom elastisk färgning. Pilarna indikerar elastisk lamina. Skalstapeln är 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Det representativa resultatet av elastisk färgning med van Giesons motfärgning. Den elastiska lamina är markerad med pilar, "T" representerar tumörceller, "S" representerar riktningen av serosal membranet. (A) tumörceller växer nära den elastiska lamina utan invaderar bortom den. (B) tumörceller invaderar bortom den elastiska lamina. (C) tumörceller uppvisar invasion i närheten av elastisk lamina men tränger inte bortom de yttersta elastiska lamina. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod som föreslås här ger en korrekt metod för att identifiera subserosal elastisk lamina. Metoden kan användas för att utvärdera om tumörceller har invaderat den elastiska lamina i pT3N0M0 ventrikelcancer12. Elastisk lamina är rödaktig i H & E-färgade sektioner, som inte kunde lätt skiljas från kollagenfibrer, och andra befintliga hjälp diagnosmetoder, såsom cytologi och immunohistokemi, också utövade begränsat diagnostiskt värde. Konstaterandet av tumörceller i peritonealdialys bevattnings vätska inte nödvändigtvis tyder på närvaron av en serosal invasion av den primära tumören, vilket kan bero på lymfkörtel metastaser eller andra avlägsna metastaser5. Eftersom mesothelial celler sannolikt kommer att förstöras av fibrös inflammation, en immunohistokemi diagnos kan inte genomförbart, och arbetsbelastningen är relativt stor6. Men elastisk färgning som en klassisk, speciell färgning metod kan göra den elastiska lamina tydligt synlig11,12,13. Efter standarddrift, enligt detta protokoll, den elastiska lamina kan färgas blå-svart, kollagenfibrer kan färgas röd, och muskelfibrer och röda blodkroppar kan färgas gult, vilket gör det lättare för patologer att bedöma fördelningen av tumörceller och elastisk lamina. Elastisk färgning kan också ha vissa begränsningar i de diagnostiska kriterierna. Till exempel, i vissa fall, strukturen av elastisk lamina är inte klart på grund av uppenbara tumör-relaterade fibrös inflammation. Olika observatörer kan ha skillnader i förståelsen och den praktiska tillämpningen av de diagnostiska kriterierna i ett fall, även om vissa patologer fortfarande tror att om tumörvävnaden invaderar bortom en sida av den kvarvarande elastiska lamina, kan det vara diagnosen som en elastisk lamina invasion17. Icke desto mindre, med fortsatt popularisering av tillämpningen av elastisk färgning och standardisering av diagnos konsensus av patologer, denna begränsning kommer att försvagas i framtiden.
Kritiska steg i detta protokoll inkluderar korrekt kontroll av differentieringsprocessen och standardurvalet av vävnadspreparat. Efter elastin lösning färgning, bör diabilder inte tvättas med destillerat vatten, men differentierade bilder måste placeras direkt i 95% etanol för 1-2 minuter för att undvika svårigheten i differentiering. Efter van Giesons motfärgning bör kontakt med vattenrutschbanor undvikas. i stället måste de differentierade skivorna snabbt tvättas i 95% etanol i några sekunder. Annars kommer färgen på Van Giesons motfärgning att försvagas eller till och med elueras. När det gäller vävnadsprov urvalet, den viktigaste delen är det område där bukhinnan ändrar riktning, särskilt den akuta vinkel området, snarare än det område som täcks av platt mesothelial vävnad4. Alla fall i denna studie drogs enligt denna metod, och djupet av vävnadsprovet välja var så djup som möjligt för att bedöma sambandet mellan tumören och Serosa. Dessutom sker alla steg i detta protokoll i rumstemperatur. Eftersom elastin lösning är lätt att volatilisera och infärgnings tiden är relativt lång, är det bäst att doppa bilderna i elastisk färgning lösning i en förseglad behållare. När det gäller den mikroskopiska observation, är resultatet av elastisk färgning korrekt och tillförlitlig. I vissa särskilda fall måste dock vissa rimliga diagnostiska kriterier beaktas, såsom föreslagits av grin et al. 16. i fall där tumör-relaterade fibrös inflammation resulterar i en uppenbar instabilitet i den elastiska lamina struktur, när tumören vävnaden invaderar bortom resterande elastisk lamina på ena sidan, det kan diagnostiseras som elastisk lamina invasion. När det gäller mucinös adenocarcinom, endast om den cellulära slemhinnor komponenten invaderar bortom elastisk lamina kan det diagnostiseras som elastisk lamina invasion. Om elastisk färgning visar en upprepad elastisk lamina struktur, provet kan diagnostiseras som elastisk lamina invasion endast när tumören invasionen är bortom de yttersta elastiska lamina. Om ovanstående villkor förekommer i ett eller flera avsnitt, kan ärendet diagnostiseras som elastisk lamina invasion16.
Detta protokoll visar en enkel teknik för att visuellt identifiera den elastiska lamina i magsäckscancer. Denna teknik är allmänt anpassningsbar och kan utvidgas till att döma serosal invasionen för andra prognostiska förutsägelser, såsom esofagus eller äggstockscancer17. Det kan också utnyttjas för att identifiera blod och lymfkärl invasion i kolorektal cancer samt i andra cancerformer, särskilt i vissa svåra fall, av den anledningen att elastisk lamina finns också i kärlet och lymfatiska endotelet. Dessutom är elastisk färgning billigt och kan lätt antas av patologer på olika platser18. Dessutom, denna teknik är inte begränsad till tumör vävnader, men kan också användas för diagnoser av dermatologiska och vaskulära sjukdomar, såsom discoides lupus erythematosus, alopeci, och halspulsådern artär lesion19,20. Med utvecklingen av den elastiska färgning teknik och ackumulera studier av tumörer med stora urval storlekar, vi förväntar oss att elastisk färgning kan accepteras av AJCC Staging system i bedömningen av serosal invasion av magcancer och kolorektal cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar stödet delvis från National Natural Science Foundation (nr 81401902 och NO. 81501992) och Hunan Natural Science Foundation (nr 2017SK2134, Nr. 2018JJ2238). Manuskriptet är skriven av Guang Lei. Hela experimentet utförs av Guang lei och Haiyan Yang. Författarna tackar hjälp av patologer och stipendiater som följer upp patienternas data.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
References
- Jiang, C. G., et al. Clinicopathologic characteristics and prognosis of gastric cancer invading the subserosa. Journal of Surgical Oncology. 102 (7), 737-741 (2010).
- Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. 8th ed. , Springer. New York, NY. (2017).
- Kojima, M., et al. Elastic laminal invasion in colon cancer: diagnostic utility and histological features. Frontiers in Oncology. 2, 179 (2012).
- Ludeman, L., Shepherd, N. A. Serosal involvement7 in gastrointestinal cancer: its assessment and significance. Histopathology. 47 (2), 123-131 (2005).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. The prognostic importance of peritoneal involvement in colonic cancer: a prospective evaluation. Gastroenterology. 112 (4), 1096-1102 (1997).
- Liang, W. Y. Retrospective evaluation of elastic stain in the assessment of serosal invasion of pT3N0 colorectal cancers. American Journal of Surgical Pathology. 37 (10), 1565-1570 (2013).
- Carter, D., True, L., Otis, C. N. Serosal membranes. Histology for Pathologists. 3rd ed. Mills, S. E. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 547-562 (2007).
- Knudsen, P. J.
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. Influence of local peritoneal involvement on pelvic recurrence and prognosis in rectal cancer. Journal of Clinical Pathology. 48 (9), 849-855 (1995).
- Uitto, J., Li, Q., Urban, Z. The complexity of elastic fibre biogenesis in the skin--a perspective to the clinical heterogeneity of cutis laxa. Experimental Dermatology. 22 (2), 88-92 (2013).
- Kazlouskaya, V., et al. The utility of elastic Verhoeff-Van Gieson staining in dermatopathology. Journal of Cutaneous Pathology. 40 (2), 211-225 (2013).
- Lei, G., et al. Elastic staining-a rejuvenated method to reassess prognosis and serosal invasion in patients with pT3N0M0 gastric cancer. Human Pathology. 65, 79-84 (2017).
- Hernández-Morera, P., Travieso-González, C. M., Castaño-González, I., Mompeó-Corredera, B., Ortega-Santana, F. Segmentation of elastic fibres in images of vessel wall sections stained with Weigert's resorcin-fuchsin. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 142, 43-54 (2017).
- Kojima, M., Nakajima, K., Ishii, G., Saito, N., Ochiai, A. Peritoneal elastic laminal invasion of colorectal cancer: the diagnostic utility and clinicopathologic relationship. American Journal of Surgical Pathology. 34 (9), 1351-1360 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Reappraisal of Serosal Invasion in Patients With T3 Colorectal Cancer by Elastic Stain. ARCHIVES OF PATHOLOGY & LABORATORY MEDICINE. 140 (1), 81-85 (2016).
- Grin, A., et al. Peritoneal elastic lamina invasion: limitations in its use as a prognostic marker in stage II colorectal cancer. Human Pathology. 44 (12), 2696-2705 (2013).
- Stewart, C. J., Brennan, B. A., Crook, M. L., Russell, P. Value of elastin staining in the assessment of peritoneal implants associated with ovarian serous borderline tumours. Histopathology. 51 (3), 313-321 (2007).
- Kojima, M., et al. Pathological diagnostic criterion of blood and lymphatic vessel invasion in colorectal cancer: a framework for developing an objective pathological diagnostic system using the Delphi method, from the Pathology Working Group of the Japanese Society for Cancer of the Colon and Rectum. Journal of Clinical Pathology. 66 (7), 551-558 (2013).
- Elston, C. A., Kazlouskaya, V., Elston, D. M. Elastic staining versus. fluorescent and polarized microscopy in the diagnosis of alopecia. Journal of the American Academy of Dermatology. 69 (2), 288-293 (2013).
- Vos, A., et al. Predominance of Nonatherosclerotic Internal Elastic Lamina Calcification in the Intracranial Internal Carotid Artery. Stroke. 47 (1), 221-223 (2016).
