Summary
यहाँ, हम लोचदार धुंधला का एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए pT3N0M0 गैस्ट्रिक कैंसर के ऊतकों में लोचदार फाइबर की पहचान formalin-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों पर. बाद में, हम यह निर्धारित करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं कि ट्यूमर कोशिकाएं लोचदार पटल से परे आक्रमण करती हैं या नहीं।
Abstract
लोचदार पटल, जो आमतौर पर उप-मेसोथेलियल परत में स्थित है, peritoneum mesothelial कोशिकाओं के निकट, हेमाटॉक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला पर उभयरागी है, लेकिन लोचदार धुंधला के माध्यम से कल्पना की जा सकती है। लोचदार धुंधला के महत्वपूर्ण लाभों में से एक यह है कि यह निर्धारित करने के लिए आसान बनाता है कि ट्यूमर कोशिकाओं लोचदार पटल से परे हमला किया है या नहीं। यह peritoneal सतह आक्रमण की हद तक की जांच में मदद करता है, जिससे जठरांत्र कैंसर में pT3 और pT4 चरणों भेद. इस अध्ययन में, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए formalin में लोचदार फाइबर की पहचान तय, पैराफिन-एम्बेडेड pT3N0M0 गैस्ट्रिक कैंसर ऊतक वर्गों. हम स्लाइड पर तय 5-m पैराफ़िन वर्गों तैयार करते हैं, और फिर सभी स्लाइड्स को दाग प्रक्रिया के दौरान deparaffinated और rehydrated कर रहे हैं। बाद में, सभी वर्गों पोटेशियम permanganate द्वारा ऑक्सीकरण कर रहे हैं, oxalic एसिड द्वारा विरंजन, लोचदार धुंधला द्वारा दाग, और वान Gieson द्वारा counterstained. अंत में, हम धुंधला के प्रभाव की जांच; लोचदार पटल नीले काले रंग का दाग है और कोलेजन फाइबर लाल दाग रहे हैं, जबकि कैंसर की कोशिकाओं पीले रंग के अलग अलग रंगों में दाग रहे हैं. हम भी विस्तार से कैंसर की कोशिकाओं और लोचदार पटल के बीच स्थितिपरक संबंध निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों का वर्णन. इस विधि सरल है, कम लागत, और लोचदार फाइबर और प्रामाणिक परिणाम के लिए अपनी बकाया चयनात्मकता की वजह से जठरांत्र कैंसर में peritoneal सतह आक्रमण की पहचान में व्यापक रूप से लागू है.
Introduction
ट्यूमर, नोड, और मेटास्टेसिस (टीएनएम) कैंसर स्टेजिंग प्रणाली के अनुसार, पैथोलॉजिकल चरण पीटी 4 में गैस्ट्रिक कैंसर का पूर्वानुमान पीटी3 (8वीं यूआईसीसी/एजेसीसी)1से भी बदतर है। गैस्ट्रिक कैंसर के साथ, प्राथमिक ट्यूमर (पीटी) का वर्गीकरण आमतौर पर ट्यूमर आक्रमण2की गहराई पर निर्भर करता है। पैथोलॉजिकल चरण पीटी 3 गैस्ट्रिक कैंसर को पेशी प्रोपेरिया के माध्यम से सब्सरोसल ऊतकों में कैंसर के हमले के रूप में परिभाषित किया गया है, जबकि पीटी 4 गैस्ट्रिक कैंसर को आंत की सतह के लिए मर्मज्ञ कैंसर के रूप में परिभाषित किया गया है। पर्णामूलक सतह आक्रामकता की उपस्थिति दो अवस्थाओं2में अंतर करने की कुंजी है . हालांकि, क्योंकि peritoneal mesothelial सेल परत बहुत पतली है, यह सर्जरी के दौरान क्षतिग्रस्त हो सकता है, पश्चात उपचार, और निर्धारण3. इसके अलावा, ट्यूमर से संबंधित भड़काऊ परिवर्तन और फाइब्रोसिस peritoneum के सामान्य शरीर रचना विज्ञान को नुकसान पहुंचा सकता है, जो यह बहुत मुश्किल केवल एच एंड ई धुंधला4का उपयोग कर peritoneal सतह आक्रमण का न्याय करने के लिए बनाता है। वर्तमान सहायक निदान विधियों जैसे साइटोलॉजी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सीमित नैदानिक मूल्य5,6 के हैं क्योंकि वे गलत सकारात्मक हैं या कम लागत-प्रभावीता है।
सीरोसल झिल्ली में पेरिटोनम, फुफ्फुस और पेरिकार्डियम शामिल हैं, और यह मेसोथेलियम, बेसमेंट झिल्ली, और एक उप-मेसोथेलियल परत7से बना है। सीरोसल झिल्ली की एक सामान्य हिस्टोलॉजिकल विशेषता मध्यश्लेय कोशिकाओं8,9के निकट उप-मेसोथेलियल परत में एक प्रत्यास्थ पटल की उपस्थिति है। लोचदार पटल एक मजबूत विरोधी हानिकारक क्षमता है और एक वैकल्पिक पूर्वानुमान मार्कर के रूप में सेवा कर सकते हैं अगर mesothelial कोशिकाओं गंभीर ट्यूमर से संबंधित सूजन या फाइब्रोसिस3द्वारा नष्ट कर रहे हैं. लोचदार पटल मुख्य रूप से इलैस्टिन और माइक्रोफाइब्रिल10शामिल हैं, जिन्हें लोचदार दाग द्वारा कल्पना की जा सकती है। लोचदार दाग के उपयोग के पीछे मुख्य कारण यह है कि इलैस्टिन इलैस्टिन समाधान में रेसोर्सिनोल के फेनोलिक समूह के साथ हाइड्रोजन आबंध बनाता है, जिससे लोचदार फाइबर नीले-काले रंग के होते हैं। वान गिसन (वीजी) के बाद दाग के विपरीत , कोलेजन फाइबर लाल और मांसपेशी फाइबर दाग जा सकता है और लाल रक्त कोशिकाओं पीले8दाग जा सकता है,11,12,13.
फेफड़ों के कैंसर के TNM मचान के आठवें संस्करण लोचदार पटल या आंत pleura2की सतह पर एक आक्रमण से परे एक ट्यूमर आक्रमण के रूप में आंत फुफ्फुस आक्रमण (T2) को परिभाषित करता है। कोलोरेक्टल कैंसर पर अध्ययन से पता चला है कि pT3 कोलोरेक्टल कैंसर में लोचदार पटल आक्रमण गरीब prognoses के लिए कारण हो सकता है. कोलोरेक्टल कैंसर के 5 साल के रोग मुक्त और समग्र जीवित रहने की दर भी pT4a13,14,15की तरह साबित हो गया है. लोचदार धुंधला पर हमारे पिछले अध्ययनों के आधार पर, लोचदार पटल आक्रमण pT3 गैस्ट्रिक कैंसर के रोग का पूर्वानुमान पर एक महत्वपूर्ण नकारात्मक प्रभाव पाया गया है और pT4a गैस्ट्रिक कैंसर12के रूप में उसी तरह से इलाज किया जाना चाहिए. इसलिए, इस सरल और लागत प्रभावी विधि एच एंड ई धुंधला के माध्यम से प्राप्त परिणामों में अनिश्चितता को खत्म करने में मदद कर सकते हैं, और अन्य सहायक निदान विधियों के साथ जुड़े अन्य आम सीमाओं, साइटोलॉजी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री सहित, के बीच दूसरों. इस विधि कुशलता पूर्वक जठरांत्र कैंसर के peritoneal सतह हमलों का निदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, विशेष रूप से कुछ अस्पष्ट मामलों में. यह सुविधाजनक है क्योंकि एच एंड ई दाग और अन्य दाग आमतौर पर इस तरह के हमलों की पहचान करने के लिए मुश्किल बनाते हैं। यह विधि भी परिणामकी विश्वसनीयता सुनिश्चित करता है क्योंकि यह बहुत ही चयनात्मक है, विशेष रूप से लोचदार फाइबर के लिए. यहाँ, हम लोचदार धुंधला आचरण निर्धारित करने के लिए कि क्या ट्यूमर कोशिकाओं pT3N0M0 गैस्ट्रिक कैंसर12में लोचदार पटल पर हमला किया है.
इस विधि formalin-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों पर ऊतकों में लोचदार फाइबर की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और जमे हुए वर्गों के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ, हम सेलुलर और ऊतक आकारिकी का सबसे अच्छा रखरखाव के लिए पैराफिन-एम्बेडेड वर्गों का चयन करें। इस प्रोटोकॉल में सभी कदम कमरे के तापमान पर जगह ले. एक वाणिज्यिक धुंधला किट जिसमें पोटेशियम परमैंगनेट समाधान, ऑक्सालिक एसिड समाधान, एक इलैस्टिन समाधान, और एक वान गिसन के समाधान का उपयोग प्रस्तुत अध्ययन में किया जाता है।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1994 और 2005 के बीच, रोगी के नमूने दो अनुभवी जठरांत्र रोग विशेषज्ञों द्वारा जियांगिया स्कूल ऑफ मेडिसिन, मध्य दक्षिण विश्वविद्यालय के संबद्ध कैंसर अस्पताल में, रोगियों से जो पेट neoplasms के gastrectomy का सामना करना पड़ा, एक के साथ चयन किया गया pT3N0M0 चरण में गैस्ट्रिक कैंसर के पश्चात रोग निदान (सातवें TNM मचान के अनुसार). इस अध्ययन को नैतिकता समीक्षा समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. अनुभागिंग
- पैराफिन ब्लॉक को स्लेज माइक्रोटोम के एक निश्चित धारक में रखें, जो ब्लेड के पार पीछे और आगे बढ़ सकता है। ब्लॉक और microtome चाकू के बीच इष्टतम कोण समायोजित करें.
नोट: इष्टतम कोण न केवल ब्लेड की ज्यामिति पर निर्भर करता है, लेकिन यह भी काटने की गति और तकनीक पर. - आवश्यक के रूप में पैराफिन ब्लॉक ट्रिम और यह 5-m-thick पार वर्गों में कटौती।
- लगभग 40 - 45 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में पैराफिन 5 डिग्री मीटर वर्गों प्लेस और यह माउंट, बाद में, कांच स्लाइड पर पानी से, एक खंड प्रति स्लाइड.
- किसी भी अवशिष्ट पानी और संभावित हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए एक कागज तौलिया के खिलाफ सावधानी से घुड़सवार अनुभाग दबाएँ।
- वर्गों को 30 मिनट के लिए हवा से सुखाने की अनुमति दें और फिर उन्हें 45 - 50 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए एक ओवन में सेंकना।
2. सभी स्लाइड ों की डिपेफिनाइजेशन और पुनर्जलीकरण
- 10 मिनट के लिए एक कोपलिन जार में xylene में स्लाइड विसर्जित कर दिया.
- पहले xylene जार से बाहर स्लाइड ले लो और उन्हें 10 मिनट के लिए एक और जार में xylene में विसर्जित कर दिया.
- अब, 5 मिनट के लिए एक Coplin जार में 100% इथेनॉल में स्लाइड विसर्जित.
- एक और Coplin जार में 100% इथेनॉल में स्लाइड विसर्जित, भी 5 मिनट के लिए.
- 2 मिनट के लिए एक Coplin जार में 95% इथेनॉल में स्लाइड विसर्जित कर दिया.
- 2 मिनट के लिए एक Coplin जार में 70% इथेनॉल में स्लाइड विसर्जित कर दिया.
नोट: सुनिश्चित करें कि स्लाइड पूरी तरह से समाधान में डूब रहे हैं, जबकि ऊपर दिए गए चरणों का प्रदर्शन. - एक नए जार में आसुत पानी के साथ संक्षेप में स्लाइड कुल्ला.
3. दाग
- धुंधला के लिए आगे बढ़ने से पहले, एक ऊतक कागज के साथ स्लाइड पर ऊतक के आसपास किसी भी अतिरिक्त समाधान मिटा.
- पूरी धुंधला प्रक्रिया के दौरान स्लाइड पर ऊतक के सुखाने से बचने के लिए कमरे के तापमान और कमरे में नमी की स्थिति में स्लाइड रखें।
- 5 मिनट के लिए पोटेशियम परमैंगनेट की कुछ बूंदों के साथ स्लाइड को ऑक्सीकरण करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक स्लाइड पर ऊतक अनुभाग को कवर करने के लिए पोटेशियम परमैंगनेट की मात्रा पर्याप्त है।
- 2 - 3 परिवर्तन के साथ एक Coplin जार में आसुत पानी के साथ ऑक्सीकरण स्लाइड कुल्ला. ऊतक के नीले रंग का प्रेक्षण कीजिए।
- अब, 5 मिनट के लिए oxalic एसिड की कुछ बूँदें जोड़कर इन स्लाइड ब्लीच. सुनिश्चित करें कि oxalic एसिड की मात्रा पूरी तरह से प्रत्येक स्लाइड पर ऊतक अनुभाग को कवर करने के लिए पर्याप्त है.
- स्लाइड को आसुत पानी से भरे कोपलिन जार में विसर्जित करके कुल्ला करें। कुल्ला 2x - 3x प्रदर्शन करते हैं।
- अब, इन स्लाइड्स को 95% अल्कोहल में संक्षेप में धोलें, और फिर स्लाइडको 8 - 24 ज के लिए इलैस्टिन समाधान (5 ग्राम/
नोट: Elastin समाधान अस्थिर है, और इसके धुंधला समय अपेक्षाकृत लंबा है, तो यह सबसे अच्छा है एक सील कंटेनर में लोचदार धुंधला के साथ स्लाइड विसर्जित करने के लिए, इस तरह के एक सील टोपी के साथ एक पारदर्शी कांच की बोतल के रूप में. कंटेनर की क्षमता और elastin समाधान की मात्रा डूब स्लाइड की संख्या पर निर्भर करता है, जब तक यह सभी स्लाइड का पूरा विसर्जन सक्षम बनाता है. - प्रत्येक ऊतक अनुभाग को अच्छी तरह से अंतर करने के लिए 1 - 2 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में इन स्लाइड्स को विसर्जित करें।
नोट: भेदभाव ऊतक अनुभाग के आरोप में परिवर्तन को संदर्भित करता है, जो ऊतक द्वारा अवशोषित अतिरिक्त धुंधला को हटा देता है और रंग को साफ करता है। इलेस्टिन समाधान धुंधला करने के बाद, नमूने आसुत पानी के साथ नहीं धोया जाना चाहिए भेदभाव में किसी भी कठिनाई से बचने के लिए. सूक्ष्म रूप से जाँच करें, के रूप में आवश्यक, नीले काले लोचदार फाइबर धुंधला और ग्रे पृष्ठभूमि के लिए. यह थोड़ा बाद वान Gieson counterstain के बाद से ऊतक underdifferentiate बेहतर है भी कुछ हद तक लोचदार दाग निकाल सकते हैं. - पूरी तरह से भेदभाव के बाद आसुत पानी के साथ इन स्लाइड कुल्ला.
- 1 मिनट के लिए एक वान Gieson समाधान में स्लाइड काउंटर.
नोट: वान Gieson समाधान की मात्रा के लिए पूरी तरह से प्रत्येक स्लाइड पर ऊतक अनुभाग विसर्जित करने में सक्षम होने के लिए पर्याप्त होने की जरूरत है. - तेजी से प्रत्येक ऊतक अनुभाग में अच्छी तरह से अंतर करने के लिए कुछ सेकंड के लिए इन स्लाइस पर 95% इथेनॉल ड्रॉप.
नोट: वैन Gieson counterstaining के बाद किसी भी पानी के साथ स्लाइड कुल्ला मत करो, के रूप में है कि कमजोर या यहां तक कि वान Gieson counterstaining के रंग को कम कर सकता है.
4. निर्जलीकरण और माउंटिंग
- 5 मिनट के लिए 95% शराब में स्लाइड विसर्जित करने के लिए उन्हें जल्दी से निर्जलित.
- 100% शराब के 2 परिवर्तन द्वारा इन स्लाइस निर्जलित करने के लिए जारी रखें, हर बार 5 मिनट के लिए स्लाइड immersing.
- स्लाइड ्स2 xylene के परिवर्तन में विसर्जित कर दिया, 3 मिनट के लिए हर बार.
- स्लाइड करने के लिए राल बढ़ते मध्यम की एक बूंद जोड़ें और शीर्ष पर कवरस्लिप जगह है।
5. स्लाइड का सूक्ष्म अवलोकन
- सीरोसल दिशा का पता लगाएं और लोचदार धुंधला के परिणामों का निरीक्षण: लोचदार फाइबर (लैमिना) नीले-काले दाग रहे हैं, कोलेजन फाइबर लाल दाग रहे हैं, और मांसपेशी फाइबर पीले रंग दाग रहे हैं।
- पूरी स्लाइड में कैंसर कोशिकाओं के लिए देखो: कैंसर कोशिकाओं पीले रंग का दाग रहे हैं12|
- कैंसर कोशिकाओं और लोचदार पटल के बीच स्थितिपरक संबंध निर्धारित करें.
नोट: यहाँ दो स्थितियों हो जाएगा. जब तक वहाँ एक ट्यूमर सेल है कि पूरी स्लाइड में लोचदार पटल से परे हमला किया है, तो इस मामले लोचदार पटल आक्रमण के रूप में माना जा सकता है. दूसरी ओर, केवल जब कोई ट्यूमर सेल है कि पूरी स्लाइड में लोचदार पटल से परे हमला किया है, इस मामले लोचदार पटल गैर आक्रमण के रूप में माना जा सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
एक सफल लोचदार धुंधला स्पष्ट रूप से pT3 गैस्ट्रिक कैंसर में लोचदार पटल और कैंसर की कोशिकाओं से पता चलता है. चित्रा 1 - कम शक्ति क्षेत्र, सूक्ष्म रूप से elastin समाधान धुंधला के बाद जाँच की, प्रोटोकॉल के अनुसार वान Gieson counterstain से पहले उल्लेख किया है - से पता चलता है लोचदार पटल सीरोसल mesothelial कोशिकाओं के करीब है और नीले काले रंग में दाग है फिलामेंट का रूप, और ट्यूमर कोशिकाओं और लोचदार पटल के बीच अभी भी एक निश्चित दूरी है। चित्रा 2 वान Gieson counterstain, जहां लोचदार पटल दाग है नीले काले, कोलेजन फाइबर लाल दाग रहे हैं के साथ एक ठेठ लोचदार धुंधला है, और मांसपेशी फाइबर और कैंसर की कोशिकाओं को पीला दाग रहे हैं. लोचदार पटल आक्रमण को प्रत्यास्थ पटल (चित्र 2B) के रूप में कैंसर कोशिकाओं के रूप में माना जा सकता है , जबकि लोचदार पटलिकन को कैंसर कोशिकाओं के रूप में माना जा सकता है जो लोचदार पटल के करीब हैं, लेकिन आक्रमण नहीं कर सकते हैं (चित्र 2 एक) मामले में लोचदार धुंधला एक दोहराव संरचना का पता चलता है, जो पता चलता है कि लोचदार पटल की एक से अधिक परत है, अगर ट्यूमर आक्रमण बाहरी लोचदार पटल से परे आक्रमण नहीं करता है (तीर द्वारा इंगित), नमूना लोचदार के रूप में निदान किया जाना चाहिए पटलअहिंसा (चित्र2ग)।
चित्र 1 : वान Gieson counterstaining से पहले लोचदार धुंधला की सूक्ष्म छवि. लोचदार पटल तीर द्वारा चिह्नित है, "टी" ट्यूमर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है, "एस" सीरोसल झिल्ली की दिशा का प्रतिनिधित्व करता है। लोचदार पटल स्पष्ट रूप से लोचदार धुंधला द्वारा कल्पना की जा सकती है। तीर लोचदार पटल को इंगित करते हैं। स्केल बार 200 डिग्री है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : वान Gieson counterstain के साथ लोचदार धुंधला के प्रतिनिधि परिणाम. लोचदार पटल तीर द्वारा चिह्नित है, "टी" ट्यूमर कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है, "एस" सीरोसल झिल्ली की दिशा का प्रतिनिधित्व करता है। (ए) ट्यूमर कोशिकाएं लोचदार पटल के पास उस पर आक्रमण किए बिना उगती हैं। (बी) ट्यूमर कोशिकाओं लोचदार पटल से परे आक्रमण. (ग) ट्यूमर कोशिकाएं लोचदार पटल के आस-पास आक्रमण प्रदर्शित करती हैं लेकिन बाह्यलोच पटल से परे नहीं प्रवेश करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
यहाँ प्रस्तावित इस विधि subserosal लोचदार पटल की पहचान करने के लिए एक सटीक दृष्टिकोण प्रदान करता है. विधि का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि क्या ट्यूमर कोशिकाओं pT3N0M0 गैस्ट्रिक कैंसर12में लोचदार पटल पर आक्रमण किया है . लोचदार पटल एच एंड ई-सना हुआ वर्गों में लाल है, जो आसानी से कोलेजन फाइबर से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है, और अन्य मौजूदा सहायक निदान विधियों, जैसे साइटोलॉजी और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, भी सीमित नैदानिक मूल्य लगाया। पेरिटोनल सिंचाई तरल पदार्थ में ट्यूमर कोशिकाओं की खोज जरूरी प्राथमिक ट्यूमर के एक सेरोसल आक्रमण की उपस्थिति का संकेत नहीं है, जो लिम्फ नोड मेटास्टेसिस या अन्य दूर मेटास्टेसिस5के कारण हो सकता है। चूंकि मध्यश्लेय कोशिकाओं को रेशेदार सूजन से नष्ट होने की संभावना है, इसलिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री निदान संभव नहीं हो सकता है, और कार्यभार अपेक्षाकृत बड़ा6है। हालांकि, एक क्लासिक, विशेष धुंधला विधि के रूप में लोचदार धुंधला लोचदार पटल स्पष्ट रूप से दिखाई दे सकता है11,12,13. मानक संचालन के बाद, इस प्रोटोकॉल के अनुसार, लोचदार पटल नीले-काले दाग किया जा सकता है, कोलेजन फाइबर लाल दाग किया जा सकता है, और मांसपेशी फाइबर और लाल रक्त कोशिकाओं पीले रंग का दाग हो सकता है, जो यह आसान पैथोलॉजिस्ट के वितरण का आकलन करने के लिए बनाता है ट्यूमर कोशिकाओं और लोचदार पटल. लोचदार धुंधला भी नैदानिक मानदंडों में कुछ सीमाएं हो सकती है. उदाहरण के लिए, कुछ मामलों में, लोचदार पटल की संरचना स्पष्ट ट्यूमर से संबंधित रेशेदार सूजन के कारण स्पष्ट नहीं है। विभिन्न पर्यवेक्षकों को एक मामले में नैदानिक मानदंडों की समझ और व्यावहारिक आवेदन में मतभेद हो सकते हैं, हालांकि कुछ पैथोलॉजिस्ट अभी भी मानते हैं कि अगर ट्यूमर ऊतक शेष लोचदार पटल के एक तरफ से अधिक आक्रमण करता है, तो यह हो सकता है एक लोचदार पटल आक्रमण17के रूप में निदान . फिर भी, लोचदार धुंधला के आवेदन के निरंतर लोकप्रिय ीकरण और पैथोलॉजिस्ट के निदान आम सहमति के मानकीकरण के साथ, यह सीमा भविष्य में कमजोर हो जाएगी।
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम differentiating प्रक्रिया और मानक ऊतक नमूना चयन के उचित नियंत्रण शामिल हैं. इलेस्टिन समाधान धुंधला करने के बाद, स्लाइड को आसुत पानी से धोया नहीं जाना चाहिए, लेकिन विभेदित स्लाइडों को भेदभाव में कठिनाई से बचने के लिए 1 - 2 मिनट के लिए 95% इथेनॉल में सीधे रखा जाना चाहिए। वान Gieson counterstaining के बाद, पानी के साथ स्लाइड के संपर्क से बचा जाना चाहिए; इसके बजाय, विभेदित स्लाइस तेजी से कुछ सेकंड के लिए 95% इथेनॉल में धोया जा करने की जरूरत है। अन्यथा, वान Gieson counterstain का रंग कमजोर हो जाएगा या यहां तक कि eluted. ऊतक नमूना चयन के लिए के रूप में, सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा क्षेत्र है जहां peritoneum दिशा में परिवर्तन, विशेष रूप से तीव्र कोण क्षेत्र, बजाय फ्लैट mesothelial ऊतक4द्वारा कवर क्षेत्र . इस अध्ययन में सभी मामलों को इस विधि के अनुसार तैयार किए गए थे, और ऊतक नमूना चयन की गहराई ट्यूमर और सेरोसा के बीच संबंधों का आकलन करने के लिए संभव के रूप में गहरी थी। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल में सभी कदम कमरे के तापमान पर जगह ले. चूंकि elastin समाधान volatilize करने के लिए आसान है और धुंधला समय अपेक्षाकृत लंबा है, यह सबसे अच्छा है एक सील कंटेनर में लोचदार धुंधला समाधान में स्लाइड विसर्जित करने के लिए. सूक्ष्म अवलोकन के लिए के रूप में, लोचदार धुंधला का परिणाम सटीक और विश्वसनीय है. हालांकि, कुछ विशेष मामलों में, कुछ उचित नैदानिक मानदंडों को ध्यान में रखा जाना चाहिए, के रूप में ग्रिन एट अल द्वारा प्रस्तावित. 16.ऐसे मामलों में जहां ट्यूमर से संबंधित रेशेदार सूजन लोचदार पटल संरचना की एक स्पष्ट अस्थिरता में परिणाम है, जब ट्यूमर ऊतक एक तरफ अवशिष्ट लोचदार पटल से परे आक्रमण करता है, तो इसे लोचदार पटल आक्रमण के रूप में निदान किया जा सकता है। म्यूसिनस एडेनोकार्सीनोमा के मामले में, केवल तभी जब सेलुलर श्लेष्म घटक लोचदार पटल से परे आक्रमण करता है, तो इसे लोचदार पटल आक्रमण के रूप में निदान किया जा सकता है। यदि लोचदार धुंधला एक दोहराव लोचदार पटल संरचना से पता चलता है, नमूना लोचदार पटल आक्रमण के रूप में ही निदान किया जा सकता है जब ट्यूमर आक्रमण बाहरी लोचदार पटल से परे है। यदि उपरोक्त स्थिति एक या अधिक वर्गों में होती है, तो मामले को लोचदार पटल आक्रमण16के रूप में निदान किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल नेत्रहीन गैस्ट्रिक कैंसर में लोचदार पटल की पहचान के लिए एक सीधी तकनीक को दर्शाता है. इस तकनीक को व्यापक रूप से अनुकूलनीय है और इस तरह के esophageal या डिम्बग्रंथि के कैंसर17के रूप में अन्य पूर्वानुमान भविष्यवाणियों के लिए serosal आक्रमण न्याय करने के लिए विस्तार किया जा सकता है. यह भी कोलोरेक्टल कैंसर में रक्त और लसीका पोत आक्रमण की पहचान करने के लिए उपयोग किया जा सकता है और साथ ही अन्य कैंसर में, विशेष रूप से कुछ कठिन मामलों में, कारण है कि लोचदार पटल भी पोत और लसीका endothelium में मौजूद है के लिए. इसके अलावा, लोचदार धुंधला सस्ता है और आसानी से विभिन्न स्थलों पर पैथोलॉजिस्ट द्वारा अपनाया जा सकताहै 18. इसके अलावा, इस तकनीक ट्यूमर के ऊतकों तक ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी त्वचा विज्ञान और संवहनी रोगों के निदान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे डिस्कॉइड लुपस एरिथेमेटोसस, खालित्य, और ग्रीवा धमनी घाव19,20. लोचदार धुंधला प्रौद्योगिकी के विकास और बड़े नमूना आकार के साथ ट्यूमर के अध्ययन जमा के साथ, हम उम्मीद करते हैं कि लोचदार धुंधला गैस्ट्रिक कैंसर और कोलोरेक्टल कैंसर के सीरोसल आक्रमण को पहचानने में AJCC मचान प्रणाली द्वारा स्वीकार किया जा सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
लेखकों राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (NO.81401902 और NO.81501992) और हुनान प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (NO.2017SK2134, NO.2018JJ2238) से भाग में समर्थन धन्यवाद. पांडुलिपि गुआंग लेई द्वारा लिखा गया है। पूरा प्रयोग गुआंग लेई और हैयान यांग द्वारा किया जाता है। लेखक पैथोलॉजिस्ट और रोगियों के डेटा का पालन करने वाले साथियों की सहायता का धन्यवाद करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
References
- Jiang, C. G., et al. Clinicopathologic characteristics and prognosis of gastric cancer invading the subserosa. Journal of Surgical Oncology. 102 (7), 737-741 (2010).
- Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. 8th ed. , Springer. New York, NY. (2017).
- Kojima, M., et al. Elastic laminal invasion in colon cancer: diagnostic utility and histological features. Frontiers in Oncology. 2, 179 (2012).
- Ludeman, L., Shepherd, N. A. Serosal involvement7 in gastrointestinal cancer: its assessment and significance. Histopathology. 47 (2), 123-131 (2005).
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. The prognostic importance of peritoneal involvement in colonic cancer: a prospective evaluation. Gastroenterology. 112 (4), 1096-1102 (1997).
- Liang, W. Y. Retrospective evaluation of elastic stain in the assessment of serosal invasion of pT3N0 colorectal cancers. American Journal of Surgical Pathology. 37 (10), 1565-1570 (2013).
- Carter, D., True, L., Otis, C. N. Serosal membranes. Histology for Pathologists. 3rd ed. Mills, S. E. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 547-562 (2007).
- Knudsen, P. J.
- Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. Influence of local peritoneal involvement on pelvic recurrence and prognosis in rectal cancer. Journal of Clinical Pathology. 48 (9), 849-855 (1995).
- Uitto, J., Li, Q., Urban, Z. The complexity of elastic fibre biogenesis in the skin--a perspective to the clinical heterogeneity of cutis laxa. Experimental Dermatology. 22 (2), 88-92 (2013).
- Kazlouskaya, V., et al. The utility of elastic Verhoeff-Van Gieson staining in dermatopathology. Journal of Cutaneous Pathology. 40 (2), 211-225 (2013).
- Lei, G., et al. Elastic staining-a rejuvenated method to reassess prognosis and serosal invasion in patients with pT3N0M0 gastric cancer. Human Pathology. 65, 79-84 (2017).
- Hernández-Morera, P., Travieso-González, C. M., Castaño-González, I., Mompeó-Corredera, B., Ortega-Santana, F. Segmentation of elastic fibres in images of vessel wall sections stained with Weigert's resorcin-fuchsin. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 142, 43-54 (2017).
- Kojima, M., Nakajima, K., Ishii, G., Saito, N., Ochiai, A. Peritoneal elastic laminal invasion of colorectal cancer: the diagnostic utility and clinicopathologic relationship. American Journal of Surgical Pathology. 34 (9), 1351-1360 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Reappraisal of Serosal Invasion in Patients With T3 Colorectal Cancer by Elastic Stain. ARCHIVES OF PATHOLOGY & LABORATORY MEDICINE. 140 (1), 81-85 (2016).
- Grin, A., et al. Peritoneal elastic lamina invasion: limitations in its use as a prognostic marker in stage II colorectal cancer. Human Pathology. 44 (12), 2696-2705 (2013).
- Stewart, C. J., Brennan, B. A., Crook, M. L., Russell, P. Value of elastin staining in the assessment of peritoneal implants associated with ovarian serous borderline tumours. Histopathology. 51 (3), 313-321 (2007).
- Kojima, M., et al. Pathological diagnostic criterion of blood and lymphatic vessel invasion in colorectal cancer: a framework for developing an objective pathological diagnostic system using the Delphi method, from the Pathology Working Group of the Japanese Society for Cancer of the Colon and Rectum. Journal of Clinical Pathology. 66 (7), 551-558 (2013).
- Elston, C. A., Kazlouskaya, V., Elston, D. M. Elastic staining versus. fluorescent and polarized microscopy in the diagnosis of alopecia. Journal of the American Academy of Dermatology. 69 (2), 288-293 (2013).
- Vos, A., et al. Predominance of Nonatherosclerotic Internal Elastic Lamina Calcification in the Intracranial Internal Carotid Artery. Stroke. 47 (1), 221-223 (2016).
