Summary
Hier stellen wir ein Protokoll der elastischen Färbung vor, um elastische Fasern in pT3N0M0 Magenkrebsgeweben auf formalinfixierten, paraffineingebetteten Abschnitten zu identifizieren. Anschließend beschreiben wir eine Methode, um zu bestimmen, ob Tumorzellen über die elastische Lamina hinaus eindringen.
Abstract
Die elastische Lamina, die sich in der Regel in der submesothelialen Schicht neben den Peritoneum-Mesothelzellen befindet, ist amphiphil auf Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E), kann aber durch elastische Färbung visualisiert werden. Einer der wichtigen Vorteile der elastischen Färbung ist, dass es leicht zu bestimmen, ob Tumorzellen über die elastische Lamina eingedrungen sind. Dies hilft bei der Untersuchung des Ausmaßes der peritonealen Oberflächeninvasion, wodurch die pT3- und pT4-Stadien bei Magen-Darm-Krebs unterschieden werden. In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Identifizierung elastischer Fasern in den formal infixierten, paraffin-eingebetteten pT3N0M0 Magenkrebsgewebeabschnitten vor. Wir bereiten 5-m Paraffinabschnitte auf Dias fest, und dann werden alle Dias während des Färbevorgangs deparaffiniert und rehydriert. Anschließend werden alle Abschnitte durch Kaliumpermanganat oxidiert, mit Oxalsäure gebleicht, durch elastische Färbung gebeizt und von Van Gieson gegengefärbt. Schließlich untersuchen wir die Wirkung der Färbung; elastische Lamina ist blau-schwarz gefärbt und Kollagenfasern sind rot gefärbt, während die Krebszellen in verschiedenen Gelbtönen gefärbt sind. Wir beschreiben auch detailliert die Methoden zur Bestimmung der Positionsbeziehung zwischen Krebszellen und elastischer Lamina. Diese Methode ist einfach, kostengünstig und weit verbreitet bei der Identifizierung von peritonealen Oberflächeninvasion bei Magen-Darm-Krebs wegen seiner hervorragenden Selektivität für elastische Fasern und authentische Ergebnisse.
Introduction
Gemäß dem Tumor-, Knoten- und Metastasen-(TNM)-Krebs-Staging-System ist die Prognose von Magenkrebs im pathologischen Stadium pT4 signifikant schlechter als bei pT3 (8. UICC/AJCC)1. Bei Magenkrebs hängt die Klassifizierung des Primärtumors (pT) in der Regel von der Tiefe der Tumorinvasionab 2. Pathologisches Stadium pT3 Magenkrebs ist definiert als Krebs, der durch die muscularis propria in subserosales Gewebe eindringt, während pT4 Magenkrebs als Krebs definiert wird, der auf die Oberfläche des viszeralen Peritoneums eindringt. Das Vorhandensein der peritonealen Oberflächeninvasivität ist der Schlüssel, um die beiden Stadien2zu unterscheiden. Da die peritoneale mesotheliale Zellschicht jedoch sehr dünn ist, könnte sie während der Operation, der postoperativen Behandlung und der Fixierung3beschädigt werden. Darüber hinaus können tumorbedingte entzündliche Veränderungen und Fibrose die normale Anatomie des Peritoneums schädigen, was es sehr schwierig macht, die peritoneale Oberflächeninvasion nur mit H&E-Färbung4genau zu beurteilen. Aktuelle Hilfsdiagnosemethoden wie Zytologie und Immunhistochemie sind von begrenztem diagnostischem Wert5,6, weil sie falsch-positiv sind oder eine geringe Wirtschaftlichkeit haben.
Die serosale Membran umfasst das Peritoneum, Pleura und Perikard und besteht aus dem Mesothel, einer Kellermembran und einer submesotheliaalen Schicht7. Ein gemeinsames histologisches Merkmal der Serosalmembran ist das Vorhandensein einer elastischen Lamina in der submesotheliaalen Schicht, die an die mesotheliale Zellen8,9angrenzt. Elastische Lamina hat eine starke anti-schädliche Fähigkeit und kann als alternativer prognostischer Marker dienen, wenn die Mesothelzellen durch schwere tumorbedingte Entzündungen oder Fibrose zerstört werden3. Elastische Lamina besteht hauptsächlich aus Elastin und Mikrofibril10, die durch elastische Färbung visualisiert werden können. Der Hauptgrund für die Verwendung der elastischen Färbung ist, dass das Elastin eine Wasserstoffbindung mit der phenolischen Gruppe von Resorcin in der Elastinlösung bildet, wodurch elastische Fasern blau-schwarz gefärbt werden. Nach Van Gieson (VG) kontrastierende Färbung, Kollagenfasern können rot gefärbt werden und Muskelfasernund rote Blutkörperchen können gelb 8,11,12,13gebeizt werden.
Die achte Ausgabe der TNM-Inszenierung von Lungenkrebs definiert viszerale Pleurainvasion (T2) als Tumorinvasion jenseits der elastischen Lamina oder eine Invasion an der Oberfläche der viszeralen Pleura2. Studien über Dickdarmkrebs haben gezeigt, dass die elastische Lamina-Invasion bei pT3-Darmkrebs der Grund für schlechte Prognosen sein kann. Die 5-Jahres-Krankheitsfreie und Gesamtüberlebensrate von Dickdarmkrebs haben sich auch als pT4a13,14,15erwiesen. Basierend auf unseren früheren Studien über elastische Färbung, elastische Lamina Invasion wurde festgestellt, dass einen signifikanten negativen Einfluss auf die Prognose von pT3 Magenkrebs haben und sollte auf die gleiche Weise wie pT4a Magenkrebs behandelt werden12. Daher kann diese einfache und kostengünstige Methode dazu beitragen, Unsicherheiten in den Ergebnissen zu beseitigen, die durch H&E-Färbung und andere häufige Einschränkungen im Zusammenhang mit anderen Hilfsdiagnosemethoden, einschließlich Zytologie und Immunhistochemie, unter Andere. Diese Methode kann effizient verwendet werden, um peritoneale Oberflächeninvasionen von Magen-Darm-Krebs zu diagnostizieren, vor allem in einigen mehrdeutigen Fällen. Es ist bequem, da H&E Flecken und andere Flecken es in der Regel schwierig machen, solche Invasionen zu identifizieren. Diese Methode gewährleistet auch eine Zuverlässigkeit der Ergebnisse, da sie sehr selektiv ist, insbesondere für elastische Fasern. Hier führen wir elastische Färbungen durch, um festzustellen, ob Tumorzellen in die elastische Lamina bei pT3N0M0 Magenkrebs12eingedrungen sind.
Diese Methode wird zur Identifizierung von elastischen Fasern in Geweben auf formalinfixierten, paraffineingebetteten Abschnitten verwendet und kann auch für gefrorene Abschnitte verwendet werden. Hier wählen wir Paraffin-eingebettete Abschnitte für die beste Erhaltung der Zell- und Gewebemorphologie. Alle Schritte in diesem Protokoll finden bei Raumtemperatur statt. In der vorgestellten Studie wird ein kommerzielles Färbeset verwendet, das eine Kaliumpermanganatlösung, eine Oxalsäurelösung, eine Elastinlösung und eine Van Gieson-Lösung enthält.
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Protocol
Zwischen 1994 und 2005 wurden Patientenproben von zwei erfahrenen Magen-Darm-Pathologen im Affiliated Cancer Hospital der Xiangya School of Medicine, Central South University, von Patienten ausgewählt, die an einer Magenneoplasmen-Darm-Darm-Erkrankung litten, postoperative pathologische Diagnose von Magenkrebs im pT3N0M0-Stadium (nach der siebten TNM-Inszenierung). Diese Studie wurde von der Ethik-Überprüfungskommission genehmigt.
1. Schnitt
- Legen Sie den Paraffinblock in einen festen Halter des Schlittenmikrotomes, der sich rückwärts und vorwärts über die Klinge bewegen kann. Passen Sie den optimalen Winkel zwischen dem Block und dem Mikrotomemesser an.
HINWEIS: Der optimale Winkel hängt nicht nur von der Geometrie der Klinge ab, sondern auch von der Schnittgeschwindigkeit und -technik. - Schneiden Sie den Paraffinblock nach Bedarf ab und schneiden Sie ihn in 5-m-dicke Querschnitte.
- Legen Sie die Paraffin-Abschnitte in ein Wasserbad bei ca. 40 - 45 °C und montieren Sie es anschließend vom Wasser auf die Glasrutsche, einen Abschnitt pro Rutsche.
- Drücken Sie den montierten Abschnitt vorsichtig gegen ein Papiertuch, um Restwasser und mögliche Luftblasen zu entfernen.
- Abschnitte 30 min lufttrocknen lassen und dann im Ofen bei 45 - 50 °C für 2 h backen.
2. Deparaffinierung und Rehydrierung aller Dias
- Tauchen Sie die Dias in Xylol in ein Coplin-Glas für 10 min.
- Nehmen Sie die Dias aus dem ersten Xylol-Glas und tauchen Sie sie in Xylol in ein anderes Glas für 10 min.
- Tauchen Sie nun die Dias in 100% Ethanol in ein Coplin-Glas für 5 min ein.
- Tauchen Sie die Dias in 100% Ethanol in ein anderes Coplin-Glas, auch für 5 min.
- Tauchen Sie die Dias in 95% Ethanol in ein Coplin-Glas für 2 min.
- Tauchen Sie die Dias in 70% Ethanol in ein Coplin-Glas für 2 min.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Folien vollständig in die Lösungen eingetaucht sind, während Sie die oben genannten Schritte ausführen. - Spülen Sie die Dias kurz mit destilliertem Wasser in einem neuen Glas.
3. Färbung
- Bevor Sie mit der Färbung fortfahren, wischen Sie überschüssige Lösungen um das Gewebe auf dem Dia mit einem Tissuepapier ab.
- Platzieren Sie die Dias in Raumtemperatur und Raumfeuchtigkeit, um eine Trocknung des Gewebes während des gesamten Färbevorgangs auf dem Dia zu vermeiden.
- Oxidieren Sie die Dias mit ein paar Tropfen Kaliumpermanganat für 5 min. Stellen Sie sicher, dass das Volumen von Kaliumpermanganat genug ist, um den Gewebeabschnitt auf jedem Dia zu decken.
- Spülen Sie die oxidierten Dias mit destilliertem Wasser in einem Coplin-Glas mit 2 - 3 Veränderungen. Beobachten Sie die blaue Farbe des Gewebes.
- Nun, bleichen Sie diese Dias durch Zugabe von ein paar Tropfen Oxalsäure für 5 min. Stellen Sie sicher, dass das Volumen von Oxalsäure genug ist, um den Gewebeabschnitt auf jedem Dia vollständig zu decken.
- Spülen Sie die Dias, indem Sie sie in das mit destilliertem Wasser gefüllte Coplin-Glas eintauchen. Führen Sie die Spülung 2x - 3x aus.
- Waschen Sie nun diese Dias kurz in 95% Alkohol, und tauchen Sie dann die Dias in eine Elastin-Lösung (5 g/L) für 8 - 24 h.
HINWEIS: Die Elastin-Lösung ist flüchtig und ihre Färbezeit ist relativ lang, daher ist es am besten, die Dias mit elastischen Färbungen in einen versiegelten Behälter einzutauchen, wie z. B. eine transparente Glasflasche mit einer Dichtkappe. Die Kapazität des Behälters und das Volumen der Elastin-Lösung hängt von der Anzahl der eingetauchten Dias ab, sofern sie das vollständige Eintauchen aller Dias ermöglicht. - Tauchen Sie diese Dias direkt in 95% Ethanol für 1 - 2 min ein, um jeden Gewebeabschnitt gut zu unterscheiden.
HINWEIS: Differenzierung bezieht sich auf die Änderung der Ladung des Gewebeabschnitts, die die überschüssige Färbung entfernt, die vom Gewebe absorbiert wird, und die Farben klarer macht. Nach der Färbung der Elastinlösung sollten Proben nicht mit destilliertem Wasser gewaschen werden, um Differenzierungsschwierigkeiten zu vermeiden. Prüfen Sie bei Bedarf mikroskopisch auf blau-schwarze elastische Fasern Färbung und grauen Hintergrund. Besser ist es, das Gewebe leicht zu unterdifferenzieren, da der anschließende Van Gieson-Gegenfleck auch den elastischen Fleck etwas extrahieren kann. - Diese Dias nach der Differenzierung vollständig mit destilliertem Wasser abspülen.
- Gegenstain die Rutschen in einer Van Gieson Lösung für 1 min.
HINWEIS: Das Volumen der Van-Gieson-Lösung muss ausreichen, um den Gewebeabschnitt auf jedem Dia vollständig eintauchen zu können. - Lassen Sie schnell 95% Ethanol auf diese Scheiben für ein paar Sekunden fallen, um jeden Gewebeabschnitt gut zu unterscheiden.
HINWEIS: Spülen Sie die Dias nach der Gegenfärbung des Van Gieson nicht mit Wasser ab, da dies die Farbe der Van-Gieson-Gegenfärbung schwächen oder sogar verfälen könnte.
4. Dehydrierung und Montage
- Tauchen Sie die Dias in 95% Alkohol für 5 min ein, um sie schnell dehydrieren zu lassen.
- Fahren Sie fort, diese Scheiben durch 2 Veränderungen von 100% Alkohol zu dehydrieren, jedes Mal tauchen die Rutschen für 5 min.
- Tauchen Sie die Dias in 2 Änderungen von Xylol, jedes Mal für 3 min.
- Fügen Sie einen Tropfen harziges Montagemedium auf die Folie und legen Sie den Deckelrutsch auf der Oberseite.
5. Mikroskopische Beobachtung der Dias
- Finden Sie die serosale Richtung und beobachten Sie die Ergebnisse der elastischen Färbung: elastische Fasern (Lamina) sind blau-schwarz gefärbt, Kollagenfasern sind rot gefärbt und Muskelfasern sind gelb gefärbt.
- Suchen Sie nach den Krebszellen in der ganzen Folie: Krebszellen sind gelb gefärbt12.
- Bestimmen Sie die Positionsbeziehung zwischen den Krebszellen und elastischen Lamina.
HINWEIS: Hier wird es zwei Situationen geben. Solange es eine Tumorzelle gibt, die über die elastische Lamina im gesamten Dia eingedrungen ist, könnte dieser Fall als elastische Laminainvasion betrachtet werden. Andererseits könnte dieser Fall nur dann als elastische Lamina-Nicht-Invasion betrachtet werden, wenn es keine Tumorzelle gibt, die über die elastische Lamina im gesamten Dia hinaus eingedrungen ist.
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Representative Results
Eine erfolgreiche elastische Färbung zeigt deutlich elastische Lamina und Krebszellen bei pT3 Magenkrebs. Abbildung 1 - Low-Power-Feld, mikroskopisch nach Elastin-Lösung Färbung überprüft, vor Van Giesons Gegenfleck nach dem erwähnten Protokoll - zeigt, dass die elastische Lamina in der Nähe der serosalen mesotheliale Zellen ist und blau-schwarz in der Form von Filamenten, und es gibt immer noch einen gewissen Abstand zwischen den Tumorzellen und der elastischen Lamina. Abbildung 2 ist eine typische elastische Färbung mit Van Giesons Gegenfleck, bei der elastische Lamina blau-schwarz, Kollagenfasern rot und Muskelfasern und Krebszellen gelb gefärbt sind. Elastische Lamina-Invasion kann als Krebszellen betrachtet werden, die in die elastische Lamina eindringen (Abbildung 2B), während elastische Lamina-Nicht-Invasion als Krebszellen betrachtet werden kann, die in der Nähe der elastischen Lamina liegen, aber nicht eindringen (Abbildung 2 A). Falls die elastische Färbung eine sich wiederholende Struktur aufweist, was darauf hindeutet, dass es mehr als eine Schicht elastischer Lamina gibt, wenn die Tumorinvasion nicht über die äußerste elastische Lamina hinaus eindringt (durch Pfeile angezeigt), sollte die Probe als elastisch diagnostiziert werden. lamina non-invasion (Abbildung 2C).
Abbildung 1 : Das mikroskopische Bild der elastischen Färbung vor Van Giesons Gegenfärbung. Die elastische Lamina ist durch Pfeile gekennzeichnet, "T" stellt Tumorzellen dar, "S" stellt die Richtung der serosalen Membran dar. Die elastische Lamina lässt sich durch elastische Färbung deutlich visualisieren. Die Pfeile zeigen elastische Lamina an. Die Maßstabsleiste beträgt 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Das repräsentative Ergebnis der elastischen Färbung mit Van Giesons Gegenfleck. Die elastische Lamina ist durch Pfeile gekennzeichnet, "T" stellt Tumorzellen dar, "S" stellt die Richtung der serosalen Membran dar. (A) Tumorzellen wachsen in der Nähe der elastischen Lamina, ohne darüber hinaus einzudringen. (B) Tumorzellen dringen über die elastische Lamina hinaus ein. (C) Tumorzellen weisen eine Invasion in der Nähe von elastischen Lamina auf, dringen aber nicht über die äußerste elastische Lamina hinaus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Diese hier vorgeschlagene Methode bietet einen genauen Ansatz zur Identifizierung der subserosalen elastischen Lamina. Die Methode kann verwendet werden, um zu bewerten, ob Tumorzellen in die elastische Lamina bei pT3N0M0 Magenkrebs eingedrungen sind12. Elastische Lamina ist rötlich in H&E-gefärbten Abschnitten, die nicht leicht von Kollagenfasern unterschieden werden konnte, und andere bestehende Hilfsdiagnosemethoden, wie Zytologie und Immunhistochemie, übten ebenfalls einen begrenzten diagnostischen Wert aus. Der Fund von Tumorzellen in der peritonealen Bewässerungsflüssigkeit deutet nicht notwendigerweise auf das Vorhandensein einer serosalen Invasion des Primärtumors hin, die auf die Lymphknotenmetastasierung oder andere entfernte Metastasen zurückzuführen sein kann5. Da die Mesothelzellen wahrscheinlich durch faserige Entzündungen zerstört werden, ist eine immunhistochemische Diagnose möglicherweise nicht durchführbar, und die Arbeitsbelastung ist relativ groß6. Elastische Färbung als klassische, spezielle Färbemethode kann die elastische Lamina jedoch deutlich sichtbar machen11,12,13. Nach dem Standardbetrieb kann die elastische Lamina nach diesem Protokoll blau-schwarz gebeizt werden, Kollagenfasern können rot gefärbt werden, und Muskelfasern und rote Blutkörperchen können gelb gefärbt werden, was es Pathologen erleichtert, die Verteilung der Tumorzellen und elastische Nalake. Elastische Färbung kann auch einige Einschränkungen in den diagnostischen Kriterien haben. Zum Beispiel, in einigen Fällen, die Struktur der elastischen Lamina ist nicht klar aufgrund offensichtlicher tumorbedingter faseriger Entzündungen. Verschiedene Beobachter können In einem Fall Unterschiede im Verständnis und in der praktischen Anwendung der diagnostischen Kriterien haben, obwohl einige Pathologen immer noch glauben, dass, wenn das Tumorgewebe über eine Seite der verbleibenden elastischen Lamina hinaus eindringt, diagnostiziert als elastische Lamina-Invasion17. Dennoch wird diese Einschränkung mit der fortgesetzten Popularisierung der Anwendung elastischer Färbung und der Standardisierung des Diagnosekonsens von Pathologen in Zukunft geschwächt werden.
Zu den kritischen Schritten in diesem Protokoll gehören die ordnungsgemäße Kontrolle des Differenzierungsprozesses und die Standard-Gewebeprobenauswahl. Nach der Färbung der Elastinlösung sollten Die Dias nicht mit destilliertem Wasser gewaschen werden, sondern differenzierte Dias müssen 1 - 2 Minuten direkt in 95% Ethanol gelegt werden, um die Schwierigkeit der Differenzierung zu vermeiden. Nach Van Giesons Gegenfärbung sollte der Kontakt der Rutschen mit Wasser vermieden werden; Stattdessen müssen die differenzierten Scheiben schnell für ein paar Sekunden in 95% Ethanol gewaschen werden. Andernfalls wird die Farbe des Van-Gieson-Gegenflecks geschwächt oder sogar verdorn. Was die Gewebeprobenauswahl betrifft, so ist der wichtigste Teil der Bereich, in dem das Peritoneum die Richtung ändert, insbesondere der Spitzenwinkelbereich, und nicht der Bereich, der von flachem Mesothelgewebe bedeckt ist4. Alle Fälle in dieser Studie wurden nach dieser Methode gezeichnet, und die Tiefe der Gewebeprobe Auswahl war so tief wie möglich, um die Beziehung zwischen dem Tumor und der Serosa zu beurteilen. Darüber hinaus finden alle Schritte in diesem Protokoll bei Raumtemperatur statt. Da die Elastinlösung leicht zu verflüchtigen ist und die Färbezeit relativ lang ist, ist es am besten, die Dias in elastische Färbungslösung in einen versiegelten Behälter einzutauchen. Was die mikroskopische Beobachtung betrifft, so ist das Ergebnis der elastischen Färbung genau und zuverlässig. In einigen Sonderfällen müssen jedoch einige vernünftige diagnostische Kriterien berücksichtigt werden, wie von Grin et al. vorgeschlagen. 16. In Fällen, in denen tumorbedingte faserige Entzündungen zu einer offensichtlichen Instabilität der elastischen Laminastruktur führen, wenn das Tumorgewebe über die restelastische Lamina auf einer Seite hinaus eindringt, kann es als elastische Laminainvasion diagnostiziert werden. Bei mucinösem Adenokarzinom kann nur dann als elastische Laminainvasion diagnostiziert werden, wenn die zelluläre Schleimkomponente über die elastische Lamina hinaus eindringt. Wenn elastische Färbung zeigt eine sich wiederholende elastische Laminastruktur, kann die Probe als elastische Lamina Invasion nur diagnostiziert werden, wenn die Tumorinvasion außerhalb der äußersten elastischen Lamina ist. Wenn die oben genannte Bedingung in einem oder mehreren Abschnitten auftritt, kann der Fall als elastische Lamina-Invasion diagnostiziert werden16.
Dieses Protokoll demonstriert eine einfache Technik zur visuellen Identifizierung der elastischen Lamina bei Magenkrebs. Diese Technik ist weithin anpassungsfähig und kann erweitert werden, um die serosale Invasion für andere prognostische Vorhersagen zu beurteilen, wie Ösophabil- oder Eierstockkrebs17. Es kann auch verwendet werden, um Blut und Lymphgefäß Invasion bei Darmkrebs sowie bei anderen Krebsarten zu identifizieren, vor allem in einigen schwierigen Fällen, aus dem Grund, dass elastische Lamina auch in Gefäß und lymphatischeen Endothel existiert. Auch, elastische Färbung ist billig und kann leicht von Pathologen an verschiedenen Standorten angenommen werden18. Darüber hinaus ist diese Technik nicht auf Tumorgewebe beschränkt, sondern kann auch für Diagnosen von dermatologischen und Vaskulären verwendet werden, wie Discoid Lupus erythematodes, Alopezie, und Karotis Arterieläsion19,20. Mit der Entwicklung der elastischen Färbetechnologie und der anhäufenden Studien von Tumoren mit großen Probengrößen erwarten wir, dass elastische Färbung vom AJCC-Staging-System akzeptiert werden kann, um die serosale Invasion von Magen- und Dickdarmkrebs zu beurteilen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken der Unterstützung zum Teil von der National Natural Science Foundation (NO.81401902 und NO.81501992) und der Hunan Natural Science Foundation (NO.2017SK2134, NO.2018JJ2238). Das Manuskript wurde von Guang Lei geschrieben. Das ganze Experiment wird von Guang Lei und Haiyan Yang durchgeführt. Die Autoren danken der Hilfe von Pathologen und Stipendiaten, die patientengebundene Patientendaten verfolgen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
References
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