Summary
Qui, presentiamo un protocollo di colorazione elastica per identificare le fibre elastiche nei tessuti del cancro gastrico pT300M0 su sezioni di cancro in formalina e incorporate in paraffina. Successivamente, descriviamo un metodo per determinare se le cellule tumorali invadono oltre la lamina elastica.
Abstract
La lamina elastica, che di solito si trova nello strato sub-mesoteliale, adiacente alle cellule mesoteliali peritoneo, è anfifila sulla colorazione ematossia ed eosina (H&E), ma può essere visualizzata attraverso la colorazione elastica. Uno dei vantaggi importanti della colorazione elastica è che rende facile determinare se le cellule tumorali hanno invaso oltre la lamina elastica. Questo aiuta a esaminare l'estensione dell'invasione superficiale peritoneale, distinguendo così gli stadi pT3 e pT4 nel cancro gastrointestinale. In questo studio, presentiamo un protocollo per identificare le fibre elastiche nelle sezioni del tessuto del cancro gastrico pT3N0M0 fissato in formalina e incorporato in paraffina. Prepariamo sezioni di paraffina di 5-m fissate su vetrini, e poi tutti i vetrini vengono deparaffinati e reidratati durante la procedura di colorazione. Successivamente, tutte le sezioni sono ossidati da permanganato di potassio, sbiancate dall'acido osalico, macchiate da macchie elastiche e contrastate da Van Gieson. Infine, esaminiamo l'effetto della colorazione; la mina elastica è macchiata di blu-nero e le fibre di collagene sono colorate di rosso, mentre le cellule tumorali sono macchiate in varie tonalità di giallo. Descriviamo in dettaglio anche i metodi utilizzati per determinare la relazione posizionale tra le cellule tumorali e la lamina elastica. Questo metodo è semplice, a basso costo, e ampiamente applicabile nell'identificazione dell'invasione superficiale di superficie nel cancro gastrointestinale a causa della sua eccezionale selettività per fibre elastiche e risultati autentici.
Introduction
Secondo il sistema di staging per tumore, nodo e metastasi (TNM), la prognosi del cancro gastrico allo stadio patologico pT4 è significativamente peggiore di quella di pT3 (8a UICC/AJCC)1. Con il cancro gastrico, la classificazione del tumore primario (pT) di solito dipende dalla profondità dell'invasione del tumore2. Lo stadio patologico per il cancro gastrico pT3 è definito come cancro gastrico che invade attraverso il muscolosi in tessuti sottosrosali, mentre il cancro gastrico pT4 è definito come cancro penetrante sulla superficie del peritoneo viscerale. La presenza dell'invasività superficiale della superficie è lachiave per distinguere le due fasi 2. Tuttavia, poiché lo strato di cellule mesoteliaper peritoneali è molto sottile, potrebbe essere danneggiato durante l'intervento chirurgico, il trattamento postoperatorio e la fissazione3. Inoltre, i cambiamenti infiammatori e la fibrosi correlati al tumore possono danneggiare la normale anatomia del peritoneo, il che rende molto difficile giudicare con precisione l'invasione superficiale peritoneale utilizzando solo la colorazione H&E4. Gli attuali metodi di diagnosi ausiliaria come la cattualelogologia e l'immunohistochimica hanno un valore diagnostico limitato5,6 perché sono falsi positivi o hanno una bassa efficacia in termini di costi.
La membrana sirosale comprende il peritoneo, la pleura e il pericardio, ed è composta dal mesotelio, una membrana del seminterrato e uno strato sub-mesoteliale7. Una caratteristica istologica comune della membrana sirosa è la presenza di una lamina elastica nello strato sub-mesoteliale, adiacente alle cellule mesoteliali8,9. La lamina elastica ha una forte capacità anti-dannosa e può servire come marcatore prognostico alternativo se le cellule mesoteliane vengono distrutte da una grave infiammazione o fibrosi del tumore3. La lamina elastica comprende principalmente elastina e microfibrilla10, che può essere visualizzata per colorazione elastica. La ragione principale dietro l'uso della colorazione elastica è che l'elastina forma un legame di idrogeno con il gruppo fenolico di risorcinolo nella soluzione di elastina, causando fibre elastiche da macchiare blu-nero. Dopo Van Gieson (VG) colorazione contrastante, fibre di collagene possono essere macchiati di rosso e fibre muscolari e globuli rossi possono essere macchiati giallo8,11,12,13.
L'ottava edizione della messa in scena TNM del cancro del polmone definisce l'invasione pleretale viscerale (T2) come un'invasione tumorale oltre la lamina elastica o un'invasione sulla superficie della pleura viscerale2. Studi sul cancro colorettale hanno dimostrato che l'invasione della lamina elastica nel cancro del colon-retto pT3 può essere la ragione per le previsioni poveri. Il tasso di sopravvivenza globale e privo di malattie di 5 anni del cancro colorettale si è dimostrato simile a pT4a13,14,15. Sulla base dei nostri studi precedenti sulla colorazione elastica, invasione di lamina elastica è stato trovato per avere una significativa influenza negativa sulla prognosi del cancro gastrico pT3 e dovrebbe essere trattata allo stesso modo come il cancro gastrico pT4a12. Di conseguenza, questo metodo semplice ed economico può aiutare a eliminare l'incertezza nei risultati ottenuti attraverso la colorazione H&E e altre limitazioni comuni associate ad altri metodi di diagnosi ausiliaria, tra cui la cattuale e l'immunohistochimica, tra cui Altri. Questo metodo può essere utilizzato in modo efficiente per diagnosticare invasioni superficiali peritoneali del cancro gastrointestinale, soprattutto in alcuni casi ambigui. E 'conveniente dal momento che H&E macchia e altre macchie di solito rendono difficile identificare tali invasioni. Questo metodo garantisce anche un'affidabilità dei risultati poiché è molto selettivo, in particolare per le fibre elastiche. Qui, conduciamo colorazione elastica per determinare se le cellule tumorali hanno invaso la lamina elastica nel cancro gastrico pT3N0M012.
Questo metodo viene utilizzato per identificare le fibre elastiche nei tessuti su sezioni con valori fissati con formalina, incorporati in paraffina, e può essere utilizzato anche per le sezioni congelate. Qui, scegliamo sezioni con paraffina incorporata per la migliore manutenzione della morfologia cellulare e tissutale. Tutte le fasi di questo protocollo si svolgono a temperatura ambiente. Nello studio presentato viene utilizzato un kit di colorazione commerciale che include una soluzione permanganata di potassio, una soluzione di acido osalico, una soluzione di elastina e una soluzione Van Gieson.
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Protocol
Tra il 1994 e il 2005, campioni di pazienti sono stati selezionati da due patologi gastrointestinali esperti presso l'Affiliated Cancer Hospital della Xiangya School of Medicine, Università Del Sud Centrale, da pazienti affetti da gastrectomia di neolasmi dello stomaco, con diagnosi patologica postoperatoria del cancro gastrico nella fase pT3N0M0 (secondo la settima messa in scena TNM). Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione etica.
1. Sezionamento
- Posizionare il blocco di paraffina in un supporto fisso del microtoma a slitta, che può muoversi avanti e indietro attraverso la lama. Regolare l'angolo ottimale tra il blocco e il coltello a microtomi.
NOTA: L'angolo ottimale dipende non solo dalla geometria della lama, ma anche dalla velocità di taglio e dalla tecnica. - Tagliare il blocco di paraffina in base alle esigenze e tagliarlo in sezioni trasversali spesse 5 m.
- Posizionare le sezioni di paraffina di 5 m in un bagno d'acqua a circa 40 - 45 gradi centigradi e montarlo, successivamente, dall'acqua allo scivolo di vetro, una sezione per scivolo.
- Premere la sezione montata con attenzione su un tovagliolo di carta per rimuovere l'acqua residua e le potenziali bolle d'aria.
- Lasciare asciugare le sezioni ad aria per 30 min e cuocerle in forno a 45 - 50 gradi centigradi per 2 ore.
2. Deparaffinazione e reidratazione di tutte le diapositive
- Immergere i vetrini nello xilene in un barattolo Coplin per 10 min.
- Togliere gli scivoli dal primo barattolo di xilene e immergerli nello xilene in un altro barattolo per 10 min.
- Ora, immergere i vetrini in 100% etanolo in un barattolo Coplin per 5 min.
- Immergi i vetrini al 100% di etanolo in un altro barattolo Coplin, anche per 5 min.
- Immergere i vetrini nel 95% di etanolo in un barattolo Coplin per 2 min.
- Immergere i vetrini nel 70% di etanolo in un barattolo Coplin per 2 min.
NOTA: Assicurarsi che le diapositive siano completamente immerse nelle soluzioni durante l'esecuzione dei passaggi precedenti. - Sciacquare brevemente gli scivoli con acqua distillata in un nuovo barattolo.
3. Colorazione
- Prima di procedere per la colorazione, pulire eventuali soluzioni in eccesso intorno al tessuto sul vetrino con una carta velina.
- Posizionare i vetrini in ambiente e le condizioni di umidità della stanza per evitare l'essiccazione del tessuto sul vetrino durante l'intero processo di colorazione.
- Ossidare i vetrini con qualche goccia di potassio permanganato per 5 min. Assicurarsi che il volume di permanganazione di potassio è sufficiente per coprire la sezione di tessuto su ogni diapositiva.
- Sciacquare i vetrini ossidati con acqua distillata in un barattolo Coplin con 2 - 3 cambi. Osservare il colore blu del tessuto.
- Ora, sbiancare questi vetrini aggiungendo alcune gocce di acido ossilico per 5 min. Assicurarsi che il volume di acido osalico sia sufficiente a coprire completamente la sezione di tessuto su ogni diapositiva.
- Sciacquare gli scivoli immergendoli nel barattolo Coplin pieno di acqua distillata. Eseguire il risciacquo 2x - 3x.
- Ora, lavare questi vetrini brevemente in 95% alcol, e poi immergere i vetrini in una soluzione di elastina (5 g /L) per 8 - 24 h.
NOTA: La soluzione Elastin è volatile e il tempo di colorazione è relativamente lungo, quindi è meglio immergere i vetrini con colorazione elastica in un contenitore sigillato, come una bottiglia di vetro trasparente con un tappo di tenuta. La capacità del contenitore e il volume della soluzione elastin dipende dal numero di diapositive immerse, purché consenta l'immersione completa di tutte le diapositive. - Immergere questi vetrini direttamente nel 95% di etanolo per 1 - 2 min per differenziare bene ogni sezione di tessuto.
NOTA: La differenziazione si riferisce al cambiamento nella carica della sezione del tessuto, che rimuove la colorazione in eccesso assorbita dal tessuto e rende i colori più chiari. Dopo la colorazione della soluzione di estensione, i campioni non devono essere lavati con acqua distillata per evitare qualsiasi difficoltà nella differenziazione. Controllare microscopicamente, se necessario, per le fibre elastiche blu-nero colorazione e sfondo grigio. È meglio sottodifferenziare il tessuto poiché la successiva contromacchia di Van Gieson può anche estrarre un po 'la macchia elastica. - Sciacquare completamente questi vetrini con acqua distillata dopo la differenziazione.
- Contrapporre gli scivoli in una soluzione di Van Gieson per 1 min.
NOTA: il volume della soluzione Van Gieson deve essere sufficiente per poter immergere completamente la sezione dei tessuti su ogni diapositiva. - Lasciare rapidamente cadere 95% etanolo su queste fette per alcuni secondi per differenziare bene ogni sezione di tessuto.
NOTA: Non sciacquare i vetrini con acqua dopo la controtendenza del Van Gieson, in quanto ciò potrebbe indebolire o addirittura eluire il colore della controfazione del Van Gieson.
4. Disidratazione e montaggio
- Immergere i vetrini al 95% di alcol per 5 min per farli disidratare rapidamente.
- Continuare a disidratare queste fette da 2 cambiamenti di 100% alcol, ogni volta immergendo i vetrini per 5 min.
- Immergere le diapositive in 2 cambiamenti di xilene, ogni volta per 3 min.
- Aggiungere una goccia di supporto di montaggio resinoso al vetrino e posizionare il coperchio sulla parte superiore.
5. Osservazione microscopica dei vetrini
- Trova la direzione sirosa e osserva i risultati della colorazione elastica: le fibre elastiche (lamina) sono macchiate di blu-nero, le fibre di collagene sono di colore rosso e le fibre muscolari sono di colore giallo.
- Cercare le cellule tumorali in tutto lo scivolo: le cellule tumorali sono macchiate di giallo12.
- Determinare la relazione posizionale tra le cellule tumorali e la lamina elastica.
NOTA: Ci saranno due situazioni qui. Finché c'è una cellula tumorale che ha invaso oltre la lamina elastica in tutto lo scivolo, allora questo caso potrebbe essere considerato come invasione elastica della lamina. D'altra parte, solo quando non c'è nessuna cellula tumorale che ha invaso oltre la lamina elastica in tutta la diapositiva, questo caso potrebbe essere considerato come lamina elastica non-invasione.
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Representative Results
Una colorazione elastica di successo rivela chiaramente la lamina elastica e le cellule tumorali nel cancro gastrico pT3. Figura 1 - campo a bassa potenza, microscopicamente controllato dopo la colorazione soluzione di elastina, prima della contromacchia di Van Gieson come da parte del protocollo menzionato - mostra la lamina elastica è vicino alle cellule mesotelia sirosae ed è macchiato blu-nero nel forma di filamenti, e c'è ancora una certa distanza tra le cellule tumorali e la lamina elastica. La figura 2 è una tipica colorazione elastica con la controstatistica di Van Gieson, dove la lamina elastica è macchiata di blu-nero, le fibre di collagene sono di colore rosso macchiato e le fibre muscolari e le cellule tumorali sono di colore giallo macchiato. L'invasione della lamina elastica può essere considerata come cellule tumorali che penetrano nella lamina elastica (Figura 2B), mentre la lamina elastica non-invasione può essere considerata come cellule tumorali che sono vicine alla lamina elastica, ma non invadendo (Figura 2 A). Nel caso in cui la colorazione elastica riveli una struttura ripetitiva, il che suggerisce che ci sia più di uno strato di lamina elastica, se l'invasione tumorale non invade oltre la lamina elastica più esterna (indicata dalle frecce), il campione deve essere diagnosticato come elastico lamina non-invasione (Figura 2C).
Figura 1 : L'immagine microscopica della colorazione elastica prima della controtendenza di Van Gieson. La lamina elastica è contrassegnata da frecce, "T" rappresenta le cellule tumorali, "S" rappresenta la direzione della membrana sirosa. La lamina elastica può essere chiaramente visualizzata con una colorazione elastica. Le frecce indicano la lamina elastica. La barra della scala è di 200 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Il risultato rappresentativo della colorazione elastica con la contromacchia di Van Gieson. La lamina elastica è contrassegnata da frecce, "T" rappresenta le cellule tumorali, "S" rappresenta la direzione della membrana sirosa. (A) Le cellule tumorali crescono vicino alla lamina elastica senza invaderla. (B) Le cellule tumorali invadono oltre la lamina elastica. (C) Le cellule tumorali mostrano un'invasione in prossimità di lamina elastica, ma non penetrano oltre la lamina elastica più esterna. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo metodo qui proposto fornisce un approccio accurato per identificare la lamina elastica sottosrosale. Il metodo può essere utilizzato per valutare se le cellule tumorali hanno invaso la lamina elastica nel cancro gastrico pT3N0M012. La lamina elastica è rossastra nelle sezioni macchiate di H&E, che non potevano essere facilmente distinte dalle fibre di collagene, e altri metodi di diagnosi ausiliaria esistenti, come la citologia e l'immunohistochimica, esercitavano anche un valore diagnostico limitato. La scoperta di cellule tumorali nel liquido di irrigazione peritoneale non indica necessariamente la presenza di un'invasione sirosale del tumore primario, che può essere dovuta alla metastasi del linfonodo o ad altre metastasi distanti5. Poiché è probabile che le cellule mesoteliavia vengano distrutte da un'infiammazione fibrosa, una diagnosi di immunoistochimica potrebbe non essere fattibile e il carico di lavoro è relativamente grande6. Tuttavia, la colorazione elastica come un classico, metodo di colorazione speciale può rendere la lamina elastica chiaramente visibile11,12,13. Dopo il funzionamento standard, secondo questo protocollo, la lamina elastica può essere macchiata di blu-nero, le fibre di collagene possono essere macchiate di rosso e le fibre muscolari e i globuli rossi possono essere macchiati di giallo, il che rende più facile per i patologi valutare la distribuzione di cellule tumorali e lamina elastica. La colorazione elastica può anche avere alcune limitazioni nei criteri diagnostici. Per esempio, in alcuni casi, la struttura della lamina elastica non è chiara a causa di evidente infiammazione fibrosa legata al tumore. Diversi osservatori possono avere differenze nella comprensione e nell'applicazione pratica dei criteri diagnostici in un caso, anche se alcuni patologi credono ancora che se il tessuto tumorale invade oltre un lato della lamina elastica rimanente, può essere diagnosticato come un'invasione di lamina elastica17. Ciò nonostante, con la continua divulgazione dell'applicazione della colorazione elastica e la standardizzazione del consenso di diagnosi dei patologi, questa limitazione sarà indebolita in futuro.
Le fasi critiche di questo protocollo includono il corretto controllo del processo di differenziazione e della selezione standard dei campioni di tessuto. Dopo la colorazione della soluzione di estensione, i vetrini non devono essere lavati con acqua distillata, ma i vetrini differenziati devono essere posizionati direttamente nel 95% di etanolo per 1 - 2 minuti per evitare la difficoltà di differenziazione. Dopo la controtendenza di Van Gieson, il contatto degli scivoli con acqua dovrebbe essere evitato; invece, le fette differenziate devono essere lavate rapidamente nel 95% di etanolo per alcuni secondi. In caso contrario, il colore della contromacchia del Van Gieson sarà indebolito o addirittura eluito. Per quanto riguarda la selezione dei campioni di tessuto, la parte più importante è l'area in cui il peritoneo cambia direzione, in particolare l'area dell'angolo acuto, piuttosto che l'area coperta dal tessuto mesoteliale piatto4. Tutti i casi in questo studio sono stati disegnati secondo questo metodo, e la profondità della selezione del campione di tessuto era il più profonda possibile al fine di valutare la relazione tra il tumore e la serosa. Inoltre, tutti i passaggi di questo protocollo si svolgono a temperatura ambiente. Poiché la soluzione elastina è facile da volatilizzare e il tempo di colorazione è relativamente lungo, è meglio immergere i vetrini in una soluzione di colorazione elastica in un contenitore sigillato. Per quanto riguarda l'osservazione microscopica, il risultato della colorazione elastica è accurato e affidabile. Tuttavia, in alcuni casi particolari, è necessario tener conto di alcuni criteri diagnostici ragionevoli, come proposto da Grin et al. 16. Nei casi in cui l'infiammazione fibrosa legata al tumore si traduce in un'evidente instabilità della struttura elastica della lamina, quando il tessuto tumorale invade oltre la lamina elastica residua su un lato, può essere diagnosticata come invasione elastica della lamina. Nel caso di adenocarcinoma mucinoso, solo se il componente mucoso cellulare invade oltre la lamina elastica può essere diagnosticato come invasione elastica della lamina. Se la colorazione elastica mostra una struttura di lamina elastica ripetitiva, il campione può essere diagnosticato come invasione elastica della lamina solo quando l'invasione del tumore è oltre la lamina elastica più esterna. Se la condizione di cui sopra si verifica in una o più sezioni, il caso può essere diagnosticato come invasione elastica della lamina16.
Questo protocollo dimostra una tecnica semplice per identificare visivamente la lamina elastica nel cancro gastrico. Questa tecnica è ampiamente adattabile e può essere ampliata per giudicare l'invasione sierorosa per altre previsioni prognostiche, come il cancro esofageo o ovarico17. Può anche essere utilizzato per identificare l'invasione del sangue e del vaso linfatico nel cancro del colon-retto così come in altri tumori, soprattutto in alcuni casi difficili, per il motivo che la lamina elastica esiste anche nel vaso e nell'endotelio linfatico. Inoltre, la colorazione elastica è a buon mercato e può essere facilmente adottata dai patologi in diversi siti18. Inoltre, questa tecnica non è limitata ai tessuti tumorali, ma può essere utilizzata anche per diagnosi di malattie dermatologiche e vascolari, come discoid lupus lupus erythematosus, alopecia e lesione carotide19,20. Con lo sviluppo della tecnologia di colorazione elastica e l'accumulo di studi di tumori con grandi dimensioni di campione, ci aspettiamo che la colorazione elastica possa essere accettata dal sistema di staging AJCC nel giudicare l'invasione sirosa del cancro gastrico e del cancro colorettale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il sostegno in parte della National Natural Science Foundation (NO.81401902 e NO.81501992) e della Hunan Natural Science Foundation (NO.2017SK2134, NO.2018JJ2238). Il manoscritto è scritto da Guang Lei. L'intero esperimento viene eseguito da Guang Lei e Haiyan Yang. Gli autori ringraziano l'assistenza dei patologi e dei borsisti che seguono i dati dei pazienti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
References
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