Summary
Ici, nous présentons un protocole de coloration élastique pour identifier les fibres élastiques dans les tissus gastriques de cancer pT3N0M0 sur les sections formalin-fixes et paraffines-incorporées. Par la suite, nous décrivons une méthode pour déterminer si les cellules de tumeur envahissent au-delà de la lame élastique.
Abstract
La lame élastique, qui est habituellement située dans la couche sous-mésothéliale, adjacente aux cellules méthéliales du péritoine, est amphiphile sur l'hématoxylin et l'éosine (H et E) coloration, mais peut être visualisé par coloration élastique. Un des avantages importants de la coloration élastique est qu'il est facile de déterminer si les cellules tumorales ont envahi au-delà de la lame élastique. Ceci aide en examinant l'ampleur de l'invasion de surface péritonéale, distinguant de ce fait les étapes de pT3 et de pT4 dans le cancer gastro-intestinal. Dans cette étude, nous présentons un protocole pour identifier les fibres élastiques dans les sections de tissu gastrique de cancer pT3N0M0 formalin-fixes et paraffin-incorporées. Nous préparons des sections de paraffine de 5 m fixées sur des diapositives, puis toutes les diapositives sont déparaffinées et réhydratées pendant la procédure de coloration. Par la suite, toutes les sections sont oxydées par le permanganate de potassium, blanchies par l'acide oxalique, tachées par des taches élastiques, et contre-tachées par Van Gieson. Enfin, nous examinons l'effet de la coloration; la lame élastique est teintée bleu-noir et les fibres de collagène sont tachées en rouge, tandis que les cellules cancéreuses sont tachées dans différentes nuances de jaune. Nous décrivons également en détail les méthodes utilisées pour déterminer la relation positionnelle entre les cellules cancéreuses et les lames élastiques. Cette méthode est simple, peu coûteuse, et largement applicable dans l'identification de l'invasion de surface péritonéale dans le cancer gastro-intestinal en raison de sa sélectivité exceptionnelle pour des fibres élastiques et des résultats authentiques.
Introduction
Selon le système de stadification du cancer de la tumeur, du nœud et de la métastase (TNM), le pronostic du cancer gastrique au stade pathologique pT4 est nettement pire que celui du pT3 (8e UICC/AJCC)1. Avec le cancer gastrique, la classification de la tumeur primaire(pT) dépend habituellement de la profondeur de l'invasion de tumeur 2. Le cancer gastrique pathologique de stade pT3 est défini comme le cancer envahissant par le propria de muscularis dans les tissus subserosal, alors que le cancer gastrique de pT4 est défini comme cancer pénétrant à la surface du péritoine viscéral. La présence de l'invasivité péritonéale de surface est la clé pour distinguer les deux étapes2. Cependant, parce que la couche mésothéliale péritonéale de cellules est très mince,elle pourrait être endommagée pendant la chirurgie, le traitement postopératoire, et la fixation 3. En outre, les changements inflammatoires liés aux tumeurs et la fibrose peuvent endommager l'anatomie normale du péritoine, ce qui rend très difficile de juger avec précision l'invasion de surface péritonéale en utilisant seulement la coloration de H et E4. Les méthodes actuelles de diagnostic auxiliaire telles que la cytologie et l'immunohistochimie sont d'une valeur diagnostique limitée5,6 parce qu'elles sont faussement positives ou ont un faible rapport coût-efficacité.
La membrane sérosale comprend le péritoine, la pleuréson et le péricarde, et est composée du mésothélium, d'une membrane de sous-sol et d'une couche sous-mésothéliale7. Une caractéristique histologique commune de la membrane sérosale est la présence d'une lame élastique dans la couche sous-mésothéliale, adjacente aux cellules mésothéliales8,9. La lame élastique a une forte capacité anti-damaging et peut servir de marqueur pronostique alternatif si les cellules mésothéliales sont détruites par l'inflammation ou la fibrose liée à la tumeur grave3. Lalame élastique se compose principalement d'élastine et de microfibril10, qui peut être visualisé par coloration élastique. La principale raison derrière l'utilisation de la coloration élastique est que l'élastine forme une liaison d'hydrogène avec le groupe phénolique de résorcinol dans la solution d'élastine, causant des fibres élastiques d'être taché bleu-noir. Après Van Gieson (VG) coloration contrastante, fibres de collagène peuvent être tachées rouges et les fibres musculaires et les globules rouges peuvent être tachés jaune8,11,12,13.
La huitième édition de la mise en scène TNM du cancer du poumon définit l'invasion pleurale viscérale (T2) comme une invasion tumorale au-delà de la lame élastique ou une invasion à la surface de la pleura viscérale2. Des études sur le cancer colorectal ont montré que l'invasion élastique de lalame dans le cancer colorectal pT3 peut être la raison de pronostics pauvres. Le taux de survie de 5 ans sans maladie et de survie globale du cancer colorectal ont également été prouvés comme pT4a13,14,15. Basé sur nos études précédentes sur la coloration élastique, l'invasion élastique de lame s'est avérée pour avoir une influence négative significative sur le pronostic du cancer gastrique de pT3 et devrait être traitée de la même manière que le cancer gastrique de pT4a12. Par conséquent, cette méthode simple et rentable peut aider à éliminer l'incertitude dans les résultats obtenus par la coloration de H et E, et d'autres limitations communes liées à d'autres méthodes auxiliaires de diagnostic, y compris la cytologie et l'immunohistochimie, parmi autres. Cette méthode peut être utilisée efficacement pour diagnostiquer les invasions péritonéales de cancer gastro-intestinal, en particulier dans certains cas ambigus. Il est commode puisque la tache de H et E et d'autres taches rendent habituellement difficile d'identifier de telles invasions. Cette méthode assure également une fiabilité des résultats car elle est très sélective, en particulier pour les fibres élastiques. Ici, nous effectuons la coloration élastique pour déterminer si les cellules de tumeur ont envahi la lame élastique dans le cancer gastrique pT3N0M012.
Cette méthode est utilisée pour identifier les fibres élastiques dans les tissus sur les sections fixées parlaine et paraffines, et peut également être utilisée pour les sections congelées. Ici, nous choisissons des sections intégrées à la paraffine pour le meilleur entretien de la morphologie cellulaire et tissulaire. Toutes les étapes de ce protocole se déroulent à température ambiante. Un kit de coloration commerciale qui comprend une solution de permanganate de potassium, une solution d'acide oxalique, une solution d'élastine, et une solution de Van Gieson est utilisé dans l'étude présentée.
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Protocol
Entre 1994 et 2005, des échantillons de patients ont été sélectionnés par deux pathologistes gastro-intestinaux expérimentés de l'hôpital affilié de l'école de médecine Xiangya de l'Université Central South, auprès de patients ayant subi une gastrectomie de néoplasmes gastilles, Diagnostic pathologique postopératoire du cancer gastrique au stade pT3N0M0 (selon la septième mise en scène du TNM). Cette étude a été approuvée par le comité d'examen de l'éthique.
1. Sectionnement
- Placez le bloc de paraffine dans un support fixe du microtome de luge, qui peut se déplacer vers l'arrière et vers l'avant à travers la lame. Ajuster l'angle optimal entre le bloc et le couteau microtome.
REMARQUE : L'angle optimal dépend non seulement de la géométrie de la lame, mais aussi de la vitesse et de la technique de coupe. - Couper le bloc de paraffine au besoin et le couper en sections transversales de 5 m d'épaisseur.
- Placez les sections de paraffine de 5 m dans un bain d'eau à environ 40 à 45 oC et montez-les, par la suite, de l'eau sur la glissière de verre, une section par toboggan.
- Appuyez soigneusement sur la section montée contre un essuie-tout pour enlever toute eau résiduelle et les bulles d'air potentielles.
- Laisser sécher les sections à l'air pendant 30 min, puis les cuire au four à 45 - 50 oC pendant 2 h.
2. Déparaffinisation et réhydratation de toutes les diapositives
- Immerger les lames en xylène dans un bocal Coplin pendant 10 min.
- Sortez les lames du premier pot de xylène et plongez-les dans du xylène dans un autre bocal pendant 10 min.
- Maintenant, immerger les diapositives dans 100% d'éthanol dans un bocal Coplin pendant 5 min.
- Immerger les lames dans 100% d'éthanol dans un autre pot De Coplin, également pendant 5 min.
- Immerger les lames dans 95 % d'éthanol dans un bocal Coplin pendant 2 min.
- Immerger les lames dans 70 % d'éthanol dans un bocal Coplin pendant 2 min.
REMARQUE : Assurez-vous que les diapositives sont complètement immergées dans les solutions tout en exécutant les étapes ci-dessus. - Rincer brièvement les diapositives avec de l'eau distillée dans un nouveau bocal.
3. Staining
- Avant de procéder à la coloration, essuyez toute solution excédentaire autour du tissu sur la diapositive avec un papier de soie.
- Placez les glissières dans la pièce pour éviter le séchage du tissu sur la glissière tout au long du processus de coloration.
- Oxydez les lames avec quelques gouttes de permanganate de potassium pendant 5 min. Assurez-vous que le volume de permanganate de potassium est suffisant pour couvrir la section tissulaire sur chaque diapositive.
- Rincer les lames oxydées avec de l'eau distillée dans un bocal Coplin avec 2 à 3 changements. Observez la couleur bleue du tissu.
- Maintenant, blanchissez ces diapositives en ajoutant quelques gouttes d'acide oxalique pendant 5 min. Assurez-vous que le volume d'acide oxalique est suffisant pour couvrir complètement la section tissulaire sur chaque diapositive.
- Rincer les toboggans en les immergeant dans le bocal Coplin rempli d'eau distillée. Effectuer le rinçant 2x - 3x.
- Maintenant, lavez ces diapositives brièvement dans 95% d'alcool, puis plongez les diapositives dans une solution d'élastine (5 g/L) pendant 8 - 24 h.
REMARQUE : La solution d'élastine est volatile, et son temps de coloration est relativement long, il est donc préférable d'immerger les glissières avec la coloration élastique dans un récipient scellé, comme une bouteille en verre transparente avec un bouchon d'étanchéité. La capacité du conteneur et le volume de la solution d'élastine dépendent du nombre de diapositives immergées, à long terme, à la mesure de l'immersion complète de toutes les diapositives. - Immerger ces diapositives directement dans 95 % d'éthanol pendant 1 à 2 min pour bien différencier chaque section tissulaire.
REMARQUE : La différenciation se réfère au changement dans la charge de la section de tissu, qui enlève l'excès de coloration absorbée par le tissu et rend les couleurs plus claires. Après la coloration de la solution d'élastine, les échantillons ne doivent pas être lavés avec de l'eau distillée pour éviter toute difficulté de différenciation. Vérifiez au microscope, au besoin, pour les fibres élastiques bleu-noir taches et fond gris. Il est préférable de sous-différencier légèrement le tissu puisque la contre-tache de Van Gieson subséquente peut également extraire quelque peu la tache élastique. - Rincer entièrement ces lames avec de l'eau distillée après différenciation.
- Counterstain les diapositives dans une solution van Gieson pour 1 min.
REMARQUE : Le volume de la solution de Van Gieson doit être suffisant pour pouvoir immerger complètement la section tissulaire sur chaque diapositive. - Déposez rapidement 95 % d'éthanol sur ces tranches pendant quelques secondes pour bien différencier chaque section tissulaire.
REMARQUE: Ne pas rincer les diapositives avec de l'eau après la contre-attaque du Van Gieson, car cela pourrait affaiblir ou même affaiblir la couleur de la contre-staining van Gieson.
4. Déshydratation et montage
- Immerger les lames dans 95% d'alcool pendant 5 min pour les laisser se déshydrater rapidement.
- Continuer à déshydrater ces tranches par 2 changements de 100% d'alcool, chaque fois en immergeant les lames pendant 5 min.
- Immerger les diapositives en 2 changements de xylène, à chaque fois pendant 3 min.
- Ajouter une goutte de support de montage résineux à la glissière et placer la glissière sur le dessus.
5. Observation microscopique des diapositives
- Trouver la direction sérosale et observer les résultats de la coloration élastique: fibres élastiques (lamina) sont tachés bleu-noir, fibres de collagène sont tachés rouge, et les fibres musculaires sont tachées jaune.
- Recherchez les cellules cancéreuses dans toute la diapositive: les cellules cancéreuses sont tachées jaune12.
- Déterminer la relation de position entre les cellules cancéreuses et les lamina élastiques.
REMARQUE: Il y aura deux situations ici. Tant qu'il y a une cellule de tumeur qui a envahi au-delà de la lame élastique dans la diapositive entière, alors ce cas pourrait être considéré comme invasion élastique de lame. D'autre part, seulement quand il n'y a aucune cellule de tumeur qui a envahi au-delà de la lame élastique dans la diapositive entière, ce cas pourrait être considéré comme lamina élastique non-invasion.
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Representative Results
Une coloration élastique réussie révèle clairement la lame élastique et les cellules cancéreuses dans le cancer gastrique pT3. Figure 1 - champ de faible puissance, vérifié au microscope après coloration solution d'élastine, avant la contre-tache de Van Gieson selon le protocole mentionné - montre la lame élastique est proche des cellules mésothéliales séroselles et est tachée bleu-noir dans le forme de filaments, et il ya encore une certaine distance entre les cellules tumorales et la lame élastique. Figure 2 est une coloration élastique typique avec la contre-tache de Van Gieson, où la lamina élastique est tachée bleu-noir, fibres de collagène sont tachées de rouge, et les fibres musculaires et les cellules cancéreuses sont tachées jaune. L'invasion de lalame élastique peut être considérée comme des cellules cancéreuses pénétrant la lame élastique (Figure 2B), tandis que la non-invasion de la lame élastique peut être considérée comme des cellules cancéreuses qui sont proches de la lame élastique, mais pas envahissantes (Figure 2 A). Dans le cas où la coloration élastique révèle une structure répétitive, ce qui suggère qu'il ya plus d'une couche de lame élastique, si l'invasion tumorale n'envahit pas au-delà de la lame élastique la plus externe (indiqué par des flèches), l'échantillon doit être diagnostiqué comme élastique lamina non-invasion (Figure 2C).
Figure 1 : L'image microscopique de coloration élastique avant la contre-soudais de Van Gieson. La lame élastique est marquée par des flèches, "T" représente les cellules tumorales, "S" représente la direction de la membrane sérolienne. La lame élastique peut être clairement visualisée par coloration élastique. Les flèches indiquent la lame élastique. La barre d'échelle est de 200 m. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Le résultat représentatif de la coloration élastique avec la contre-tache de Van Gieson. La lame élastique est marquée par des flèches, "T" représente les cellules tumorales, "S" représente la direction de la membrane sérolienne. (A) Les cellules tumorales se développent près de la lame élastique sans envahir au-delà. (B) Les cellules tumorales envahissent au-delà de la lame élastique. (C) Les cellules tumorales présentent une invasion à proximité de lalame élastique, mais ne pénètrent pas au-delà de la lame élastique la plus externe. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Cette méthode proposée ici fournit une approche précise pour identifier la lame élastique subserosal. La méthode peut être utilisée pour évaluer si les cellules tumorales ont envahi la lame élastique dans le cancer gastrique pT3N0M012. La lame élastique est rougeâtre dans les sections tachées de H et E, qui ne pourraient pas être facilement distinguées des fibres de collagène, et d'autres méthodes auxiliaires existantes de diagnostic, telles que la cytologie et l'immunohistochimie, ont également exercé la valeur diagnostique limitée. La conclusion des cellules de tumeur dans le fluide irriguant péritonéal n'indique pas nécessairement la présence d'une invasion sérolelle de latumeur primaire, qui peut être due à la métastasie de ganglion lymphatique ou à une autre métaste éloignée 5. Comme les cellules mésothéliales sont susceptibles d'être détruites par l'inflammation fibreuse, un diagnostic d'immunohistochimie peut ne pas être faisable, et la charge de travail est relativement grande6. Cependant, la coloration élastique comme un classique, méthode de coloration spéciale peut rendre la lame élastique clairement visible11,12,13. Après le fonctionnement standard, selon ce protocole, la lame élastique peut être tachée bleu-noir, fibres de collagène peuvent être tachées rouge, et les fibres musculaires et les globules rouges peuvent être tachés jaune, ce qui rend plus facile pour les pathologistes d'évaluer la distribution de cellules tumorales et lalame élastique. La coloration élastique peut également avoir certaines limites dans les critères diagnostiques. Par exemple, dans certains cas, la structure de la lame élastique n'est pas claire en raison de l'inflammation fibreuse liée à la tumeur évidente. Différents observateurs peuvent avoir des différences dans la compréhension et l'application pratique des critères diagnostiques dans un cas, bien que certains pathologistes croient toujours que si le tissu tumoral envahit au-delà d'un côté de la lame élastique restante, il peut être diagnostiqué comme une invasion lame élastique17. Néanmoins, avec la popularisation continue de l'application de la coloration élastique et la normalisation du consensus de diagnostic des pathologistes, cette limitation sera affaiblie à l'avenir.
Les étapes critiques de ce protocole comprennent un contrôle approprié du processus de différenciage et la sélection standard des échantillons de tissus. Après la coloration de solution d'élastine, les glissières ne doivent pas être lavées par l'eau distillée, mais les glissières différenciées doivent être placées directement dans l'éthanol de 95% pendant 1 - 2 minutes pour éviter la difficulté dans la différenciation. Après la contre-attaque de Van Gieson, il faut éviter le contact des toboggans avec de l'eau; au lieu de cela, les tranches différenciées doivent rapidement être lavées dans 95% d'éthanol pendant quelques secondes. Sinon, la couleur de la contre-tache de Van Gieson sera affaiblie, voire élucisée. En ce qui concerne la sélection des échantillons de tissus, la partie la plus importante est la zone où le péritoine change de direction, en particulier la zone d'angle aigu, plutôt que la zone couverte par le tissu mésothélial plat4. Tous les cas dans cette étude ont été dessinés selon cette méthode, et la profondeur du spécimen de tissu sélectionnant était aussi profonde que possible afin d'évaluer la relation entre la tumeur et le serosa. En outre, toutes les étapes de ce protocole ont lieu à température ambiante. Puisque la solution d'élastine est facile à volatiliser et le temps de coloration est relativement long, il est préférable d'immerger les glissières dans la solution de coloration élastique dans un récipient scellé. Quant à l'observation microscopique, le résultat de la coloration élastique est précis et fiable. Toutefois, dans certains cas particuliers, certains critères diagnostiques raisonnables doivent être pris en compte, comme l'ont proposé Grin et coll. 16. Dans les cas où l'inflammation fibreuse liée à la tumeur a comme conséquence une instabilité évidente de la structure élastique de lamina, quand le tissu de tumeur envahit au-delà de la lame élastique résiduelle d'un côté, il peut être diagnostiqué comme invasion élastique de lame. Dans le cas de l'adénocarcinome mucine, ce n'est que si le composant muqueuse cellulaire envahit au-delà de la lame élastique qu'il peut être diagnostiqué comme invasion élastique de lame. Si la coloration élastique montre une structure élastique répétitive de lame, l'échantillon peut être diagnostiqué comme invasion élastique de lame seulement quand l'invasion de tumeur est au-delà de la lame élastique la plus externe. Si la condition ci-dessus se produit dans une ou plusieurs sections, le cas peut être diagnostiqué comme invasion élastique de lame16.
Ce protocole démontre une technique simple pour identifier visuellement la lame élastique dans le cancer gastrique. Cette technique est largement adaptable et peut être étendue pour juger de l'invasion sérosale pour d'autres prédictions pronostiques, telles que le cancer oesophagique ou ovarien17. Il peut également être utilisé pour identifier l'invasion de sang et de vaisseau xtutique dans le cancer colorectal aussi bien que dans d'autres cancers, particulièrement dans quelques cas difficiles, pour la raison que la lame élastique existe également dans l'endothélium de vaisseau et lymphatique. En outre, la coloration élastique est bon marché et peut être facilement adoptée par les pathologistes à différents sites18. En outre, cette technique n'est pas limitée aux tissus tumoraux, mais peut également être utilisée pour les diagnostics de maladies dermatologiques et vasculaires, telles que le lupus érythémateux discoïde, l'alopécie, et la lésion de l'artère carotide19,20. Avec le développement de la technologie de coloration élastique et l'accumulation d'études de tumeurs avec de grandes tailles d'échantillon, nous nous attendons à ce que la coloration élastique peut être acceptée par le système de stadification D'AJCC en jugeant l'invasion sérolienne du cancer gastrique et du cancer colorectal.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient en partie le soutien de la National Natural Science Foundation (NO.81401902 et NO.81501992) et de la Hunan Natural Science Foundation (NO.2017SK2134, NO.2018JJ2238). Le manuscrit est écrit par Guang Lei. L'expérience entière est réalisée par Guang Lei et Haiyan Yang. Les auteurs remercient l'aide des pathologistes et des boursiers qui suivent les données des patients.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
References
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