מכתים אלסטי על פרפין-שקופיות מוטבעות של רקמת סרטן pT3N0M0 קיבה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של כתמים אלסטיים כדי לזהות סיבים אלסטיים ברקמות סרטן קיבה pT3N0M0 על formalin-קבוע, פרפין חלקים מוטבעים. לאחר מכן, אנו מתארים שיטה כדי לקבוע אם תאים סרטניים לפלוש מעבר ללבינה אלסטי.

Abstract

לאמינה אלסטי, אשר ממוקם בדרך כלל בשכבת sub-mesothelial, בסמוך צפק mesothelial תאים, הוא אמפיפיפילית על המטאוקסילין ואאוזין (H & E) הצביעת אבל יכול להיות מדמיין דרך כתמים אלסטיים. אחד היתרונות החשובים של כתמים אלסטיים הוא שזה מקל לקבוע אם התאים הסרטניים פלשו מעבר לאמינה אלסטי. זה עוזר לבחון את היקף הפלישה משטח הצפק, ובכך להבחין בשלבים pT3 ו pT4 בסרטן העיכול. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי סיבים אלסטיים ב-formalin קבוע, פרפין-מוטבע pT3N0M0 רקמות סרטן הקיבה סעיפים. אנו מכינים מקטעים פרפין 5-μm שתוקנו בשקופיות, ולאחר מכן כל השקופיות מdeparaffinated ומהתייבשות במהלך הליך הצביעת. לאחר מכן, כל הסעיפים תחמוצת על ידי אשלגן פרמנגנט, מולבן על ידי חומצה אוקסלית, מוכתם על ידי כתמים אלסטיים, ומוכתם על ידי ואן גיסון של. לבסוף, אנו בודקים את השפעת ההכתמים; לאמינה אלסטי הוא סיבים כחול-שחור וקולגן מוכתם אדום, בעוד תאים סרטניים מוכתמים בגוונים שונים של צהוב. כמו כן, אנו מתארים בפרוטרוט את השיטות המשמשות לקביעת מערכת היחסים המקובעת בין תאים סרטניים לבינה אלסטית. שיטה זו פשוטה, בעלות נמוכה, וישימה באופן נרחב בזיהוי של הפלישה משטח הצפק בסרטן העיכול בגלל הסלקטיביות המדהימה שלה לסיבים אלסטיים ותוצאות אותנטיות.

Introduction

לפי הגידול, צומת, ו גרורות (TNM) מערכת האחסון הזמני של סרטן, הפרוגנוזה של סרטן הקיבה בשלב הפתולוגי pT4 הוא גרוע משמעותית מזה ב pT3 (8th UICC/AJCC)¹. עם סרטן קיבה, סיווג של הגידול העיקרי (pT) בדרך כלל תלוי בעומק של הפלישה הגידול². השלב הפתולוגי pT3 סרטן הקיבה מוגדר כמו הפולשים הסרטן דרך המוסקולאריס קינא לתוך רקמות subserosal, בעוד סרטן הקיבה pT4 מוגדר כמו סרטן חודר אל פני השטח של צפק הקרביים. הימצאות של משטח הצפק הינו המפתח להבחנה בין שני השלבים². עם זאת, מכיוון ששכבת התא mesothelial הצפק היא רזה מאוד, זה יכול להיות ניזוק במהלך הניתוח, טיפול פוסט-פעיל, וקיבוע³. יתר על כן, הקשורות לגידול שינויים דלקתיים פיברוזיס יכול להזיק אנטומיה נורמלית של צפק, מה שהופך את זה קשה מאוד לשפוט את הפלישה משטח הצפק באמצעות רק H & E צביעת⁴. שיטות אבחון העזר הנוכחיות, כגון ציטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה, הן בעלות אבחון מוגבל של^5,6 מכיוון שהן מזויפות, או שיש להן עלויות נמוכות.

קרום serosal כולל את צפק, pleura, ואת קרום הלב, והוא מורכב מmesothelium, קרום המרתף, ו-sub-mesothelial שכבה⁷. אחת התכונות היסטולוגית נפוצות של קרום serosal היא הנוכחות של לאמנה אלסטי בשכבת sub-mesothelial, בסמוך mesothelial תאים^8,9. לאמה אלסטי יש יכולת אנטי מזיק חזק והוא יכול לשמש סמן אלטרנטיבי התחזיות כאשר התאים הmesothelial נהרסים על ידי דלקת חמורה הקשורות לגידול או פיברוזיס³. לאמנה אלסטי בעיקר כוללת אלסטין ומיקרופיבריל¹⁰, אשר ניתן לדמיין על ידי כתמים אלסטיים. הסיבה העיקרית מאחורי השימוש של הכתמים האלסטיים היא כי האלסטין יוצר קשר מימן עם הקבוצה פנופילית של ריסיניול בתמיסה אלסטין, גרימת סיבים אלסטיים להיות מוכתם כחול-שחור. לאחר Van gieson (VG) מנוגדים כתמים, סיבי קולגן יכול להיות מוכתם סיבי אדום ושריר ותאי דם אדומים יכול להיות צהוב מוכתם^8,11,12,13.

המהדורה השמינית של ההיערכות tnm של סרטן הריאות מגדיר הפלישה הקרביים פלאורלי (T2) כפלישה הגידול מעבר לטרף אלסטי או פלישה על פני השטח של pleura הקרביים². מחקרים על סרטן המעי הגס הראו כי הפלישה לאמינה אלסטי בסרטן המעי הגס pT3 עשוי להיות הסיבה לתחזיות המסכן. המחלה של 5 שנים ללא שיעור ההישרדות הכוללת של סרטן המעי הגס גם הוכחו להיות כמו pT4a^13,14,15. בהתבסס על המחקרים הקודמים שלנו על כתמים אלסטיים, הפלישה לאמנה אלסטי נמצא יש השפעה שלילית משמעותית על הפרוגנוזה של סרטן קיבה pT3 וצריך להיות מטופלים באותו אופן כמו סרטן קיבה pT4a¹². מכאן, זו שיטה פשוטה וחסכונית יכול לעזור למנוע חוסר ודאות בתוצאות שהתקבלו באמצעות כתמים H & E, ומגבלות נפוצות אחרות הקשורות לשיטות אחרות לאבחון עזר, כולל ציטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה, בין אחרים. שיטה זו ניתן להשתמש ביעילות כדי לאבחן פלישות הקרקע הצפק של סרטן העיכול, במיוחד במקרים מסוימים רב-משמעיים. זה נוח מאז הכתם H & E וכתמים אחרים בדרך כלל להקשות לזהות פלישות כאלה. שיטה זו גם מבטיחה מהימנות של תוצאות מכיוון שהיא סלקטיבית מאוד, במיוחד לסיבים אלסטיים. כאן, אנו מבצעים כתמים אלסטיים כדי לקבוע אם התאים הסרטניים פלשו לאמינה אלסטי בסרטן קיבה pT3N0M0¹².

שיטה זו משמשת לזיהוי סיבים אלסטיים ברקמות על מקטעים של formalin-קבוע, פרפין, וניתן להשתמש בהם גם עבור מקטעים קפואים. כאן, אנו בוחרים פרפין-מקטעים מוטבעים עבור התחזוקה הטובה ביותר של מורפולוגיה תאית ורקמות. כל השלבים בפרוטוקול זה מתקיימים בטמפרטורת החדר. ערכת כתמים מסחרית הכוללת הפתרון אשלגן הפרמנגנט, פתרון חומצה אוקסלית, פתרון אלסטין, והפתרון של ואן גיסון משמש במחקר המוצג.

Protocol

בין 1994 ו 2005, דגימות החולה נבחרו על ידי שני פתולוגים מנוסים מערכת העיכול בבית החולים לסרטן המזוהה של Xiangya בית הספר לרפואה, מרכז דרום האוניברסיטה, מחולים שסבלו הקיבה של ניקילסקה בבטן, עם אבחון פתולוגי לאחר הניתוח של סרטן קיבה בשלב pT3N0M0 (על פי ההיערכות TNM השביעית). מחקר זה אושר על ידי ועדת הביקורת האתיקה.

1. המשך המכירה

1. מניחים את הבלוק פרפין לתוך מחזיק קבוע של מיקרוטומה מזחלת, אשר יכול לנוע אחורה וקדימה על פני הלהב. התאימו את הזווית המיטבית בין הבלוק לסכין המיקרוטומה.
   הערה: הזווית האופטימלית לא רק תלויה בגיאומטריה של הלהב אלא גם במהירות החיתוך ובטכניקה.
2. לקצץ את בלוק פרפין לפי הצורך ולחתוך אותו בסעיפים 5-μm-עובי הצלב.
3. מניחים את הפרפין 5-μm סעיפים באמבט מים בסביבות 40-45 ° c והר זה, לאחר מכן, מן המים על מגלשת הזכוכית, מקטע אחד לכל שקופית.
4. לחץ על המקטע הנטען בזהירות מול מגבת נייר כדי להסיר את כל המים השיורית ובועות האוויר הפוטנציאליות.
5. אפשר לחלקים להתייבש באוויר במשך 30 דקות ולאחר מכן אופים אותם בתנור ב-45-50 ° c עבור 2 h.

2. התחדשות ושחות של כל השקופיות

1. הישאב את השקופיות בתוך קסילן בצנצנת של Coplin במשך 10 דקות.
2. קח את השקופיות מצנצנת הקסילן הראשונה והישאב אותם לתוך הצנצנת האחרת בעוד כ -10 דקות.
3. עכשיו, לטבול את השקופיות ב 100% אתנול בצנצנת Coplin עבור 5 דקות.
4. לטבול את השקופיות ב 100% אתנול בצנצנת אחרת Coplin, גם עבור 5 דקות.
5. לטבול את השקופיות ב 95% אתנול בצנצנת Coplin עבור 2 דקות.
6. לטבול את השקופיות ב 70% אתנול בצנצנת Coplin עבור 2 דקות.
   הערה: ודא שהשקופיות שקועים לחלוטין בפתרונות בעת ביצוע השלבים שלעיל.
7. שטפו את השקופיות בקצרה עם מים מזוקקים בצנצנת חדשה.

3. צביעת מיכל

1. לפני שתמשיך להכתים, נגב את כל הפתרונות העודפים סביב הרקמה בשקופית עם נייר טישו.
2. הניחו את השקופיות בטמפרטורת החדר ובתנאי לחות החדר כדי למנוע ייבוש של הרקמה על השקופית לאורך כל תהליך הצביעת.
3. מחמצן את השקופיות עם כמה טיפות של אשלגן פרמנגנט עבור 5 דקות. ודא שנפח האשלגן פרמנגנט מספיק כדי לכסות את מקטע הרקמה בכל שקופית.
4. שטפו את השקפים המחמצנים עם מים מזוקקים בצנצנת Coplin עם 2-3 שינויים. שימו לב לצבע הכחול של הרקמה.
5. עכשיו, להלבין שקופיות אלה על ידי הוספת כמה טיפות של חומצה אוקסלית עבור 5 דקות. ודא שעוצמת החומצה האוקסלית מספיקה כדי לכסות לחלוטין את מקטע הרקמה בכל שקופית.
6. שטפו את השקופיות על ידי הקצאתם בצנצנת הקופלין המלאה במים מזוקקים. לבצע את השטיפה 2x-3x.
7. עכשיו, לשטוף את השקופיות האלה בקצרה ב 95% אלכוהול, ולאחר מכן לטבול את השקופיות לתוך תמיסת אלסטין (5 g/L) עבור 8-24 h.
   הערה: הפתרון אלסטין הוא נדיף, והזמן המכתים שלו הוא ארוך יחסית, כך שעדיף לטבול את השקופיות עם כתמים אלסטיים במיכל אטום, כגון בקבוק זכוכית שקוף עם כובע איטום. הקיבולת של המיכל והנפח של פתרון האלסטין תלוי במספר השקופיות השקועים, כל עוד היא מאפשרת טבילה מלאה של כל השקופיות.
8. לטבול שקופיות אלה ישירות ב 95% אתנול עבור 1-2 דקות כדי להבדיל כל סעיף רקמות היטב.
   הערה: בידול מתייחס לשינוי במטען של מקטע הרקמה, אשר מסיר את עודף הצבע נספג על ידי הרקמה והופך את הצבעים ברורים יותר. לאחר שאלסטין כתמים פתרון, דגימות לא צריך לשטוף עם מים מזוקקים כדי למנוע כל קושי בידול. בדוק את המיקרוסקואני, בהתאם לצורך, לצביעת סיבים אלסטיים בצבע כחול-שחור ורקע אפור. עדיף להבדיל מעט את הרקמה מאז הכתם הנגדי של ואן גיסון בעקבות יכול גם לחלץ במידת מה את הכתם אלסטי.
9. לשטוף לחלוטין שקופיות אלה עם מים מזוקקים לאחר בידול.
10. מנגד את השקופיות בתמיסה. של ואן-גיסון במשך 1 דקות
    הערה: הנפח של הפתרון של ואן גיסון צריך להיות מספיק כדי להיות מסוגל לטבול את מקטע הרקמה בכל שקופית לחלוטין.
11. ירידה מהירה 95% אתנול על פרוסות אלה במשך כמה שניות כדי להבדיל כל סעיף רקמות היטב.
    הערה: אין לשטוף את השקופיות עם מים לאחר כתמים של ואן גיסון, כי זה יכול להחליש או אפילו להפיל את צבע הנגד של ואן גיסון.

4. התייבשות והרכבה

1. לטבול את השקופיות ב 95% אלכוהול עבור 5 דקות לתת להם ליטול מייבשים במהירות.
2. המשיכו לחלק את הפרוסות האלה בשני שינויים של 100% אלכוהול, בכל פעם שאתם מוסיפים את השקופיות למשך 5 דקות.
3. לטבול את השקופיות לתוך 2 שינויים של קסילין, בכל פעם עבור 3 דקות.
4. הוסף טיפה אחת של מדיום הרכבה מחדש לשקופית ומניחים את הכיסויים בחלק העליון.

5. תצפית מיקרוסקופית על השקופיות

1. מצא את כיוון serosal ולהתבונן בתוצאות של כתמים אלסטיים: סיבים אלסטיים (lamina) הם כחול שחור ויטראז ', סיבי קולגן מוכתמים אדום, סיבי שריר הם צהוב מוכתם.
2. לחפש את התאים הסרטניים בשקופית כולה: תאים סרטניים מוכתם¹²צהוב.
3. לקבוע את הקשר המקובע בין תאים סרטניים לבינה אלסטית.
   הערה: יהיו כאן שני מצבים. כל עוד יש תא גידול אחד שפלש מעבר ללאטינה אלסטי בשקופית כולה, אז המקרה הזה יכול להיחשב הפלישה לאמנה אלסטי. מצד שני, רק כאשר אין תא הגידול שפלש מעבר ללאטינה אלסטי בשקופית כולה, המקרה הזה יכול להיחשב כמו לאמינה אלסטי הפלישה.

Representative Results

מכתים אלסטי מוצלח בבירור מגלה לאמינה אלסטי תאים סרטניים בסרטן קיבה pT3. איור 1 -כוח נמוך השדה, נבדק באופן מאכל אחר לצביעת התמיסה, לפני כתם הנגד של ואן ג'יוסון לפי הפרוטוקול שהוזכר-מראה את לאמינה אלסטי קרוב לתאים mesothelial serosal והוא מוכתם כחול-שחור ב ועדיין קיים מרחק מסוים בין תאי הגידול לבין הלבינה האלסטית. איור 2 הוא מכתים אלסטי אופייני עם כתם הנגד של ואן גיסון, שם אלסטי לאמינה מוכתם כחול-שחור, סיבי קולגן הם אדום מוכתם, סיבי שריר ותאים סרטניים הם צהוב מוכתם. הפלישה לאמנה אלסטי יכול להיחשב תאים סרטניים חודר לאמינה אלסטי (איור 2B), בעוד שאינם גמישים הפלישה יכול להיחשב תאים סרטניים הקרובים לטרף אלסטי, אבל לא הפולשים (איור 2 A). במקרה מכתים אלסטי חושף מבנה חוזר, אשר מציע כי יש יותר משכבה אחת של לאמנה אלסטי, אם הפלישה הגידול לא לפלוש מעבר לאמינה אלסטי החיצוני (המצוין על ידי חיצים), המדגם צריך להיות מאובחן אלסטי לאמנה לא הפלישה (איור 2ג).

איור 1 : הדימוי המיקרוסקופי של הצביעת האלסטי לפני הצביעת הנגדי של ואן גיסון. לאמינה אלסטי מסומן על ידי חיצים, "T" מייצג את תאי הגידול, "S" מייצג את הכיוון של קרום serosal. ניתן לדמיין בבהירות את הלבינה האלסטית באמצעות כתמים אלסטיים. החיצים מצביעים על לאמינה אלסטית. סרגל קנה המידה הוא 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2 : הנציג הנובע מכתם אלסטי עם כתמי הנגד של ואן גיסון. לאמינה אלסטי מסומן על ידי חיצים, "T" מייצג את תאי הגידול, "S" מייצג את הכיוון של קרום serosal. (A) הגידול בתאים לגדול ליד לאמינה אלסטי מבלי לפלוש מעבר לו. (ב) תאים סרטניים לפלוש מעבר האלסטי לאמה. (ג) תאים סרטניים התערוכה הפלישה בקרבת טרף אלסטי אבל לא לחדור מעבר לאמינה אלסטי החיצוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

שיטה זו המוצעת כאן מספקת גישה מדויקת לזיהוי האלסטית הגמישה של subserosal. השיטה יכולה לשמש כדי להעריך אם התאים הסרטניים פלשו לאמה אלסטי בסרטן קיבה pT3N0M0¹². גומי אלסטי הוא אדמדם בסעיפים H & E-ויטראז ', אשר לא ניתן להבדיל בקלות מסיבי קולגן, ושיטות אחרות אבחון עזר נוסף, כגון ציטולוגיה ו אימונוהיסטוכימיה, גם הופעל ערך אבחון מוגבל. הממצא של תאים סרטניים בתוך נוזל הצפק משגלים לא בהכרח מצביעים על נוכחות של הפלישה serosal של הגידול העיקרי, אשר עשוי להיות בשל גרורות הלימפה או גרורות רחוקות אחרים⁵. כמו התאים הmesothelial צפויים להיהרס על ידי דלקת סיבי, אבחון אימונוהיסטוכימיה עשוי לא ריאלי, ואת עומס העבודה הוא גדול יחסית⁶. עם זאת, מכתים אלסטי כמו קלאסי, שיטת מכתים מיוחד יכול להפוך את האלסטי לעין בבירור^11,12,13. לאחר ההפעלה הסטנדרטית, על פי פרוטוקול זה, הגומי האלסטי יכול להיות מוכתם כחול-שחור, סיבי קולגן יכול להיות אדום מוכתם, סיבי שריר ותאי דם אדומים יכולים להיות צהוב מוכתם, מה שמקל על הפתולוגים להעריך את התפלגות תאים סרטניים אלסטי לאמנה. כתמים אלסטיים עשוי להיות גם מספר מגבלות בקריטריוני אבחון. לדוגמה, במקרים מסוימים, המבנה של לאמינה אלסטי אינו ברור בשל דלקת ברורה הקשורות לגידול סיבי. משקיפים שונים עשויים להיות הבדלים הבנה ויישום מעשי של קריטריוני אבחון במקרה אחד, למרות כמה פתולוגים עדיין מאמינים כי אם רקמת הגידול פולש מעבר לצד אחד של לאמינה האלסטי הנותרים, זה יכול להיות אובחן כפלישה גמישה. עם זאת, עם המשך הפופולריזציה של יישום של כתמים אלסטיים וסטנדרטיזציה של קונצנזוס האבחנה של הפתולוגים, מגבלה זו יהיה נחלש בעתיד.

שלבים קריטיים בפרוטוקול זה כוללים שליטה נכונה בתהליך ההבחנה ובבחירת דגימות הרקמה הסטנדרטית. לאחר אלסטין פתרון כתמים, שקופיות לא צריך להיות שטף על ידי מים מזוקקים, אבל שקופיות הבדיל צריך להיות ממוקם ישירות 95% אתנול עבור 1-2 דקות כדי למנוע את הקושי בידול. לאחר הצביעה הנגדית של ואן גיסון, יש להימנע ממגע עם השקופיות עם מים; במקום, הפרוסות הבדיל צריך במהירות לשטוף ב 95% אתנול לכמה שניות. אחרת, הצבע של הכתם הנגדי של ואן-גיסון ייחלש או אפילו ייפלט. באשר לבחירה בדגימה הרקמה, החלק החשוב ביותר הוא האזור שבו צפק משנה כיוון, במיוחד באזור זווית חדה, ולא באזור מכוסה על ידי רקמה mesothelial שטוחה⁴. כל המקרים במחקר זה צוירו על פי שיטה זו, ואת עומק הדגימה של הרקמה הבחירה היה עמוק ככל האפשר כדי להעריך את היחסים בין הגידול לבין serosa. בנוסף, כל השלבים בפרוטוקול זה מתקיימים בטמפרטורת החדר. מאז הפתרון אלסטין קל לvolatilize הזמן מכתים הוא יחסית ארוך, עדיף לטבול את השקופיות בתמיסה מכתים אלסטי במיכל אטום. באשר להתבוננות המיקרוסקופית, התוצאה של כתמים אלסטיים היא מדויקת ואמינה. עם זאת, במקרים מסוימים מסוימים יש לקחת בחשבון כמה קריטריונים האבחון סבירים, כפי שהוצע על ידי גרין et al. ¹⁶. במקרים בהם דלקת הקשורות לגידול סיבי בחוסר יציבות ברורה של המבנה האלסטי, כאשר רקמת הגידול פולשת מעבר ללטינה השיורית בצד אחד, זה יכול להיות מאובחן כפלישה לאמה אלסטית. במקרה של אדנוקרצינומה רירני, רק אם הרכיב הרירי הסלולר פולש מעבר הגומי האלסטי יכול להיות מאובחנים כמו פלישה לאמרינה. אם מרקם אלסטי מראה מבנה לאמינה אלסטי חוזרים, המדגם יכול להיות מאובחן כמו הפלישה לאמנה אלסטי רק כאשר הפלישה הגידול הוא מעבר לאמינה החיצוני אלסטי. אם התנאי הנ ל מתרחשת במקטע אחד או יותר, ניתן לאבחן את האירוע כמו למשל פלישה אלסטית¹⁶.

פרוטוקול זה מדגים טכניקה פשוטה לזיהוי חזותי של לאמינה אלסטי בסרטן קיבה. טכניקה זו היא באופן נרחב הסתגלות ניתן להרחיב כדי לשפוט את הפלישה serosal עבור תחזיות התחזיות האחרות, כגון הוושט או סרטן השחלות¹⁷. זה גם יכול להיות מנוצל כדי לזהות את הפלישה כלי הדם והלימפה בסרטן המעי הגס, כמו גם בסוגי סרטן אחרים, במיוחד במקרים קשים מסוימים, מהסיבה כי לאמה אלסטי קיים גם בכלי קיבול ואנדותל הלימפה. כמו כן, כתמים אלסטיים הוא זול והוא יכול להיות מאומץ בקלות על ידי פתולוגים באתרים שונים¹⁸. יתר על כן, טכניקה זו אינה מוגבלת לרקמות הגידול, אבל יכול לשמש גם עבור אבחונים של מחלות דרמטולוגית וכלי דם, כגון לופוס דיסקאיד מאריתסוס, התקרחות, והעורק הראשי העורקים^19,20. עם פיתוח של הטכנולוגיה מכתים אלסטי וצבירת מחקרים של גידולים עם גדלים גדולים לדוגמה, אנו מצפים כי כתמים אלסטיים ניתן לקבל על ידי מערכת האחסון הזמני של AJCC לשפוט את הפלישה serosal של סרטן הקיבה וסרטן המעי הגס.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Elastin-Van Gieson staining kit	Baso	BA4083B	Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers
Permount TM Mounting Medium	MXB Biotechnologies	DAB-0033	Used for mounting
Ethanol	LMAI Bio	LM64-17-5	100%
Xylene	LMAI Bio	LX820585