Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo da mancha elástica para identificar fibras elásticas em tecidos pT3N0M0 do cancro gastric em seções formalin-fixadas, parafina-encaixadas. Subseqüentemente, nós descrevemos um método para determinar se as pilhas do tumor invadem além do lamina elástico.
Abstract
O lamina elástico, que é localizado geralmente na camada secundário-Mesothelial, adjacente às pilhas Mesothelial do peritônio, é anfifílico na coloração do hematoxilina e do eosina (H & e) mas pode ser visualizado com a mancha elástica. Um dos benefícios importantes da mancha elástica é que faz fácil determinar se as pilhas do tumor invadiram além do lamina elástico. Isto ajuda em examinar a extensão da invasão peritonealny da superfície, assim distinguindo os estágios de pT3 e de pT4 no cancro gastrintestinal. Neste estudo, nós apresentamos um protocolo para identificar fibras elásticas nas seções formalin-fixadas, parafina-encaixadas pT3N0M0 do tecido do cancro gastric. Nós preparamos seções de parafina de 5 μm fixadas em lâminas e, em seguida, todas as lâminas são desparaffinadas e rehidratados durante o procedimento de coloração. Posteriormente, todas as secções são oxidadas por permanganato de potássio, branqueada por ácido oxálico, manchada por coloração elástica, e contracorada por Van Gieson. Finalmente, examinamos o efeito da coloração; a lâmina elástica é manchada azul-preto e as fibras do colagénio são manchadas vermelhas, quando as pilhas cancerosas forem manchadas em máscaras de variação do amarelo. Também descrevemos detalhadamente os métodos utilizados para determinar a relação posicional entre as células cancerosas e a lâmina elástica. Este método é simples, de baixo custo, e amplamente aplicável na identificação da invasão de superfície peritoneal no cancro gastrintestinal por causa de sua seletividade proeminente para fibras elásticas e resultados autênticos.
Introduction
De acordo com o sistema de estadiamento do câncer de tumor, linfonodo e metástase (TNM), o prognóstico do câncer gástrico no estágio patológico pT4 é significativamente pior do que no pT3 (8º UICC/AJCC)1. Com o câncer gástrico, a classificação do tumor primário (pT) geralmente depende da profundidade da invasão tumoral2. O cancro gastric do pT3 do estágio patológico é definido como o cancro que invade através do própria dos muscularis em tecidos subserosal, visto que pT4 o cancro gastric é definido como o cancro que penetra à superfície do peritoneum visceral. A presença da invasividade da superfície peritoneal é a chave para distinguir os dois estágios2. No entanto, como a camada celular Mesothelial peritoneal é muito fina, pode ser danificada durante a cirurgia, o tratamento pós-operatório e a fixação3. Além disso, alterações inflamatórias relacionadas ao tumor e fibrose podem prejudicar a anatomia normal do peritônio, o que torna muito difícil julgar com precisão a invasão da superfície peritoneal usando apenas a coloração de H & E4. Os métodos auxiliares atuais do diagnóstico tais como a citologia e immunohistochemistry são do valor diagnóstico limitado5,6 porque são falso-positivos ou têm um baixo cost-efetividade.
A membrana serosal inclui o peritônio, a pleura e o pericárdio, e é composta pelo mesothelium, uma membrana basal e uma camada submesothelial7. Uma característica histológica comum da membrana serosal é a presença de uma lâmina elástica na camada submesotelial, adjacente às células mesotheliais8,9. O lamina elástico tem uma habilidade antiprejudicial forte e pode serir como um marcador prognóstico alternativo se as pilhas Mesothelial são destruídas pela inflamação ou pela fibrose tumor-relacionada severa3. A lâmina elástica compreende principalmente do elastina e do Microfibril10, que pode ser visualizado pela mancha elástica. A principal razão por trás do uso da coloração elástica é que a elastina forma uma ligação de hidrogênio com o grupo fenólico de resorcinol na solução de elastina, fazendo com que as fibras elásticas sejam manchadas de cor azul-preta. Após a coloração contrastante de Van Gieson (VG), as fibras colágenas podem ser manchadas de vermelho e as fibras musculares e glóbulos vermelhos podem ser manchadas de amarelo8,11,12,13.
A oitava edição do estadiamento TNM do câncer de pulmão define a invasão pleural visceral (T2) como uma invasão tumoral além da lâmina elástica ou uma invasão na superfície da pleura visceral2. Estudos sobre o cancro colorretal demonstraram que a invasão da lâmina elástica no cancro colorretal pT3 pode ser a razão para prognoses pobres. A taxa de sobrevida total e livre de doença de 5 anos do câncer colorretal também foi comprovada como pT4a,13,14,15. Baseado em nossos estudos precedentes na mancha elástica, a invasão elástica do lamina foi encontrada para ter uma influência negativa significativa no prognóstico do cancro gastric de pT3 e deve ser tratada a mesma maneira que o cancro gastric pT4a12. Assim, este método simples e rentável pode ajudar a eliminar a incerteza nos resultados obtidos através da coloração de H & E, e outras limitações comuns associadas a outros métodos auxiliares de diagnóstico, incluindo citologia e imunoistoquímica, entre Outros. Este método pode ser usado eficientemente para diagnosticar invasões de superfície peritonealny do cancro gastrintestinal, especial em alguns casos ambíguos. É conveniente desde que a mancha de H & e e outras manchas fazem geralmente difícil identificar tais invasões. Este método também garante uma confiabilidade dos resultados, uma vez que é muito seletivo, especialmente para fibras elásticas. Aqui, nós conduzimos a mancha elástica para determinar se as pilhas do tumor invadiram a lâmina elástica em pT3N0M0 o cancro gastric12.
Este método é usado para identificar fibras elásticas nos tecidos em formalin-fixo, seções parafina-encaixadas, e pode ser usado para seções congeladas também. Aqui, nós escolhemos seções parafina-encaixadas para a melhor manutenção da morfologia celular e do tecido. Todas as etapas deste protocolo acontecem à temperatura ambiente. Um kit de coloração comercial que inclui uma solução de permanganato de potássio, uma solução de ácido oxálico, uma solução de elastina e uma solução de Van Gieson é usada no estudo apresentado.
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Protocol
Entre 1994 e 2005, as amostras de pacientes foram selecionadas por dois patologistas gastrintestinais experientes no hospital de câncer afiliado da escola de medicina de Xiangya, Universidade Central do Sul, de doentes que sofreram gastrectomia de Neoplasias do estômago, com um diagnóstico patológico postoperative do cancro gastric no estágio de pT3N0M0 (de acordo com o sétimo estadiamento de TNM). Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética em revisão.
1. seccionamento
- Coloc o bloco da parafina em um suporte fixo do micrótomo do Sledge, que pode se mover para trás e para a frente através da lâmina. Ajuste o ângulo ideal entre o bloco e a faca do micrótomo.
Nota: o ângulo ideal não depende apenas da geometria da lâmina, mas também da velocidade e da técnica de corte. - Aparar o bloco de parafina conforme necessário e cortá-lo em secções transversais de 5 μm de espessura.
- Coloc as seções da parafina 5-μm em um banho de água em aproximadamente 40-45 ° c e monte-a, subseqüentemente, da água na corrediça de vidro, uma seção por a corrediça.
- Pressione a seção montada com cuidado contra uma toalha de papel para remover qualquer água residual e potenciais bolhas de ar.
- Permitir que as secções para secar ao ar por 30 min e, em seguida, assar-los em um forno a 45-50 ° c para 2 h.
2. desparaffinização e reidratação de todas as lâminas
- Mergulhe as lâminas em xileno em um frasco de Coplin por 10 min.
- Tire os slides do primeiro frasco de xileno e mergulhe-os em xileno em outro frasco por 10 min.
- Agora, mergulhe os slides em 100% de etanol em um frasco de Coplin por 5 min.
- Mergulhe as lâminas em 100% de etanol em outro frasco de Coplin, também por 5 min.
- Mergulhe as lâminas em 95% de etanol em um frasco de Coplin por 2 min.
- Mergulhe as lâminas em 70% de etanol em um frasco de Coplin por 2 min.
Observação: Certifique-se de que os slides estão completamente imersos nas soluções ao executar as etapas acima. - Enxague brevemente as lâminas com água destilada num novo jarro.
3. coloração
- Antes de prosseguir para a coloração, limpe fora de todas as soluções excedentes em torno do tecido na corrediça com um papel de tecido.
- Coloc as corrediças a temperatura do inroom e as condições da umidade da sala para evitar a secagem do tecido na corrediça durante todo o processo de coloração inteiro.
- Oxidize as lâminas com algumas gotas de permanganato de potássio por 5 min. Assegure-se de que o volume de permanganato de potássio seja suficiente para cobrir a seção de tecido em cada slide.
- Enxágüe as lâminas oxidadas com água destilada em um frasco de Coplin com 2-3 mudanças. Observe a cor azul do tecido.
- Agora, Bleach estes slides, adicionando algumas gotas de ácido oxálico por 5 min. Assegure-se de que o volume de ácido oxálico é suficiente para cobrir completamente a seção de tecido em cada slide.
- Enxague as lâminas mergultando-as no frasco de Coplin preenchido com água destilada. Realize o enxágüe 2x-3x.
- Agora, lave estes slides brevemente em 95% de álcool e, em seguida, mergulhe as lâminas em uma solução de elastina (5 g/L) para 8-24 h.
Nota: a solução de elastina é volátil, e seu tempo de coloração é relativamente longo, por isso é melhor mergulhar as lâminas com coloração elástica em um recipiente selado, como uma garrafa de vidro transparente com uma tampa de vedação. A capacidade do recipiente e o volume da solução de elastina dependem do número de lâminas imersas, desde que possibilitem a imersão completa de todas as lâminas. - Mergulhe esses slides diretamente no etanol 95% por 1-2 min para diferenciar bem cada seção de tecido.
Nota: a diferenciação refere-se à mudança na carga da seção de tecido, que remove o excesso de coloração absorvida pelo tecido e torna as cores mais claras. Após a coloração da solução de elastina, as amostras não devem ser lavadas com água destilada para evitar qualquer dificuldade de diferenciação. Verifique microscopically, conforme necessário, para coloração azul-preta das fibras elásticas e fundo cinzento. É melhor para ligeiramente underdiferenciar o tecido desde a subsequente contratura de Van Gieson também pode extrair um pouco a mancha elástica. - Enxágüe inteiramente estas corrediças com água destilada após a diferenciação.
- Contratura os slides em uma solução de Van Gieson por 1 min.
Nota: o volume da solução de Van Gieson precisa ser suficiente para ser capaz de mergulhar a seção de tecido em cada slide completamente. - Rapidamente gota 95% etanol sobre estas fatias por alguns segundos para diferenciar cada seção de tecido bem.
Nota: Não enxague as lâminas com água após a contrcoloração de Van Gieson, pois isso pode enfraquecer ou até mesmo eluir a cor da contrcoloração de Van Gieson.
4. desidratação e montagem
- Mergulhe as lâminas em álcool 95% por 5 min para deixá-los desidratar rapidamente.
- Continue a desidratar estas fatias por 2 alterações de 100% de álcool, cada vez que mergulhe os slides por 5 min.
- Mergulhe as lâminas em 2 alterações de xileno, cada vez por 3 min.
- Adicione uma gota de meio de montagem resinoso ao slide e coloque a lamínula na parte superior.
5. observação microscópica das lâminas
- Encontre o sentido serosal e observe os resultados da mancha elástica: as fibras elásticas (lamina) são manchadas azul-pretas, as fibras do colagénio são manchadas vermelhas, e as fibras de músculo são manchadas amarelas.
- Procure as células cancerosas em todo o slide: as células cancerosas são manchadas amarelo12.
- Determine a relação posicional entre as células cancerosas e a lâmina elástica.
Nota: haverá duas situações aqui. Contanto que haja uma pilha do tumor que invadisse além do lamina elástico na corrediça inteira, a seguir este caso poderia ser considerado como a invasão elástica do lamina. De um lado, somente quando não há nenhuma pilha do tumor que invadiu além do lamina elástico na corrediça inteira, este caso poderia ser considerado como a não-invasão elástica do lamina.
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Representative Results
Uma coloração elástica bem sucedida revela claramente A lâmina elástica e as células cancerosas em pT3 cancro gástrico. Figura 1 -campo de baixa potência, verificado microscopicamente após coloração da solução de elastina, antes da contratura de Van Gieson de acordo com o protocolo mencionado-mostra que a lâmina elástica está próxima das células mesotheliais serosais e é manchada de cor azul-preta na forma de filamentos, e ainda há uma certa distância entre as células tumorais e a lâmina elástica. A Figura 2 é uma coloração elástica típica com a contratura de Van Gieson, onde a lâmina elástica é manchada de azul-preto, as fibras colágenas são manchadas de vermelho, e as fibras musculares e as células cancerosas são manchadas de amarelo. A invasão da lâmina elástica pode ser considerada como células cancerosas penetrantes na lâmina elástica (Figura 2B), enquanto que a não invasão da lâmina elástica pode ser considerada como células cancerosas próximas à lâmina elástica, mas não invadindo (Figura 2 A). Caso a coloração elástica revele uma estrutura repetitiva, o que sugere que haja mais de uma camada de lâmina elástica, se a invasão tumoral não invadir além da lâmina elástica mais externa (indicada por setas), a amostra deve ser diagnosticada como elástica Não invasão da lâmina (Figura 2C).
Figura 1 : A imagem microscópica da coloração elástica antes da contrcoloração de Van Gieson. A lâmina elástica é marcada por flechas, "T" representa as células tumorais, "S" representa a direção da membrana serosal. O lamina elástico pode claramente ser visualizado pela mancha elástica. As setas indicam a lâmina elástica. A barra de escala é 200 μm. por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : O resultado representativo da coloração elástica com a contratura de Van Gieson. A lâmina elástica é marcada por flechas, "T" representa as células tumorais, "S" representa a direção da membrana serosal. (A) células tumorais crescem perto da lâmina elástica sem invadir além dela. (B) células tumorais invadem além da lâmina elástica. (C) células tumorais exibem invasão nas imediações da lâmina elástica, mas não penetram além da lâmina elástica mais externa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este método proposto fornece uma abordagem precisa para identificar a lâmina elástica subserosal. O método pode ser usado para avaliar se as células tumorais invadiram a lâmina elástica em pT3N0M0 câncer gástrico12. O lamina elástico é avermelhado em seções H & e-manchadas, que não poderiam facilmente ser distinguidos das fibras do colagénio, e outros métodos auxiliares existentes do diagnóstico, tais como a citologia e Immunohistochemistry, igualmente exercida o valor diagnóstico limitado. O achado de células tumorais no fluido de irrigação peritoneal não indica necessariamente a presença de invasão serosal do tumor primário, o que pode ser decorrente da metástase do linfonodo ou de outra metástase distante5. Porque as pilhas Mesothelial são prováveis ser destruídas pela inflamação fibrosa, um diagnóstico immunohistochemistry não pode praticável, e a carga de trabalho é relativamente grande6. No entanto, a coloração elástica como um método de coloração clássico e especial pode tornar a lâmina elástica claramente visível11,12,13. Após o funcionamento padrão, de acordo com este protocolo, o lamina elástico pode ser manchado azul-preto, as fibras do colagénio podem ser manchadas vermelhas, e as fibras de músculo e os glóbulos vermelhos podem ser manchadas amarelas, que facilita para que os patologistas avaliem a distribuição de células tumorais e lâmina elástica. A coloração elástica também pode ter algumas limitações nos critérios diagnósticos. Por exemplo, em alguns casos, a estrutura do lamina elástico não é desobstruída devido à inflamação fibrosa tumor-relacionada óbvia. Os observadores diferentes podem ter diferenças na compreensão e na aplicação prática dos critérios diagnósticos em um caso, embora alguns patologistas ainda acreditem que se o tecido do tumor invade além de um lado da lâmina elástica restante, pode ser diagnosticada como invasão de lâmina elástica17. No entanto, com a continuação da popularização da aplicação da coloração elástica e a padronização do consenso diagnóstico dos patologistas, essa limitação será enfraquecida no futuro.
As etapas críticas neste protocolo incluem o controle apropriado do processo diferenciador e da seleção padrão do espécime do tecido. Após a coloração da solução de elastina, as lâminas não devem ser lavadas por água destilada, mas as lâminas diferenciadas precisam ser colocadas diretamente em etanol a 95% por 1-2 minutos para evitar a dificuldade de diferenciação. Após a contrcoloração de Van Gieson, o contato das lâminas com água deve ser evitado; em vez disso, as fatias diferenciadas rapidamente precisam ser lavadas em etanol a 95% por alguns segundos. Caso contrário, a cor da contratura de Van Gieson será enfraquecida ou mesmo eluída. Quanto à seleção do espécime tecidual, a parte mais importante é a área onde o peritônio muda de direção, especialmente a área de ângulo agudo, em vez da área coberta pelo tecido Mesothelial plano4. Todos os casos deste estudo foram desenhados de acordo com este método, e a profundidade da seleção do espécime tecidual foi tão profunda quanto possível para avaliar a relação entre o tumor e a serosa. Além, todas as etapas neste protocolo acontecem na temperatura ambiente. Desde que a solução do elastina é fácil de volatilize e o tempo de coloração é relativamente longo, é o melhor mergulhar as corrediças na solução de mancha elástica em um recipiente selado. Quanto à observação microscópica, o resultado da coloração elástica é preciso e confiável. No entanto, em alguns casos especiais, alguns critérios diagnósticos razoáveis precisam ser levados em conta, como proposto por grin et al. 16. nos casos onde a inflamação fibrosa tumor-relacionada conduz a uma instabilidade óbvia da estrutura elástica do lamina, quando o tecido do tumor invade além do lamina elástico residual em um lado, pode ser diagnosticado como a invasão elástica do lamina. No caso do adenocarcinoma mucinous, somente se o componente mucous celular invade além do lamina elástico pode ser diagnosticado como a invasão elástica do lamina. Se a coloração elástica mostra uma estrutura de lâmina elástica repetitiva, a amostra pode ser diagnosticada como invasão de lâmina elástica somente quando a invasão tumoral está além da lâmina elástica mais externa. Se a condição acima ocorre em uma ou mais seções, o caso pode ser diagnosticado como invasão de lâmina elástica16.
Este protocolo demonstra uma técnica direta para identificar visualmente a lâmina elástica no cancro gastric. Esta técnica é amplamente adaptável e pode ser expandida para julgar a invasão serosal para outras predições prognósticas, tais como o cancro esofágico ou ovariano17. Também pode ser utilizado para identificar a invasão do sangue e da embarcação linfática no cancro colorretal assim como em outros cancros, especial em alguns casos difíceis, para a razão que a lâmina elástica igualmente existe na embarcação e no endothelium linfático. Também, a mancha elástica é barata e pode facilmente ser adotada por patologistas em locais diferentes18. Além disso, esta técnica não se limita aos tecidos tumorais, mas também pode ser utilizada para diagnósticos de doenças dermatológicas e vasculares, como Lúpus eritematoso discoide, alopecia e lesão da artéria carotídea19,20. Com o desenvolvimento da tecnologia de coloração elástica e acumulando estudos de tumores com grandes tamanhos de amostra, esperamos que a coloração elástica pode ser aceito pelo sistema de estadiamento AJCC no julgamento da invasão serosal do câncer gástrico e câncer colorretal.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem o apoio em parte da Fundação Nacional de ciências naturais (NO. 81401902 e NO. 81501992) e da Fundação de ciência natural de Hunan (NO. 2017SK2134, NO. 2018JJ2238). O manuscrito foi escrito por Guang lei. Todo o experimento é realizado por Guang lei e Haiyan Yang. Os autores agradecem a assistência de patologistas e de companheiros que acompanham os dados dos pacientes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Elastin-Van Gieson staining kit | Baso | BA4083B | Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers |
| Permount TM Mounting Medium | MXB Biotechnologies | DAB-0033 | Used for mounting |
| Ethanol | LMAI Bio | LM64-17-5 | 100% |
| Xylene | LMAI Bio | LX820585 |
References
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