Summary

Análise da síntese proteica epidídimo e secreção

Published: August 25, 2018
doi:

Summary

Aqui, nós relatamos a localização de imunofluorescência de Dinamina para ilustrar os protocolos para a detecção de proteínas em seções epidídimo de rato de parafina e aqueles de uma linhagem de células epidídimo imortalizado (mECap18). Também descrevemos os protocolos para o isolamento de proteínas secretoras do epidídimo fluido e mídia celular condicionados.

Abstract

O epidídimo mamíferos gera um dos mais complexos fluidos intraluminal de qualquer glândula endócrina para oferecer suporte a maturação pós-testicular e armazenamento de espermatozoides. Tal complexidade surge devido a atividade secretora e absorvente combinada das pilhas epithelial forro. Aqui, descrevemos as técnicas para a análise da secreção e síntese de proteínas epidídimo, centrando-se sobre a família de proteínas de modelo de Dinamina (DNM) mechanoenzymes; GTPases grandes que têm o potencial para regular eventos de tráfico membrana bi-direcional. Para o estudo da expressão da proteína no tecido epidídimo, descrevemos a metodologia robusta para a rotulagem de imunofluorescência de proteínas alvo nas secções de parafina e a detecção subsequente da distribuição espacial destas proteínas através microscopia de imunofluorescência. Também descrevemos a metodologia otimizada para o isolamento e caracterização de exossomo como vesículas, conhecido como epididymosomes, que são secretadas no lúmen epidídimo para participar na comunicação intercelular com maturação de células de esperma. Como uma abordagem complementar, também descrevemos a detecção de imunofluorescência de proteínas alvo em uma linhagem de células do rato SV40-imortalizado caput epidídimo epitelial (mECap18). Além disso, podemos discutir o utilitário da linha de celular mECap18 como um modelo adequado em vitro com para explorar a regulação da atividade secretora epidídimo. Para este fim, descrevemos as exigências de cultivo para a manutenção da linhagem celular mECap18 e o uso de esquemas de inibição farmacológica seletiva que são capazes de influenciar seu perfil de proteínas secretoras. Os últimos são prontamente avaliaram através da colheita de condicionados de meio de cultura, concentração de proteínas secretadas através de precipitação do ácido tricloroacético/acetona e sua posterior análise através de SDS-PAGE e immunoblotting. Podemos afirmar que esses métodos combinados são apropriados para a análise de alternativas de proteína epidídimo alvos como um prelúdio para determinar seu papel funcional na maturação do esperma e/ou armazenamento.

Introduction

Os espermatozoides de todas as espécies de mamíferos adquirem o potencial para exibir motilidade progressiva e para fertilizar um óvulo durante a sua descida prolongada através do epidídimo, uma região altamente especializada do sistema masculino adesiva extra testicular, que pode 7-14 dias para navegar (dependendo da espécie)1. Devido a extrema condensação da cromatina a paterna e o derramamento da maioria do citoplasma que acompanha a cytodifferentiation de espermatozoides nos testículos, sua maturação funcional subsequente é conduzida exclusivamente por sua interação com o microambiente epidídimo. Neste meio é, por sua vez, criado pela atividade secretora e absorvente da soma de epidídimo forro e exibe um nível excepcional de variação de segmento-segmento1. Assim, os segmentos mais ativos em termos de síntese proteica e secreção são aqueles localizados na porção proximal do epidídimo (ou seja, o caput e corpus)2. Esta actividade espelha o perfil funcional de espermatozoides, com o início de primeira células para exibir marcas de competência funcional (i. e., motilidade progressiva e a capacidade de ligar a zona do ácido-solubilizado glicoproteínas) seguir seus passagem do caput epidídimo3. Esses atributos funcionais continuam a desenvolver-se antes de atingir os níveis ideais como o esperma alcançar o segmento distal epidídimo (cauda), onde eles são armazenados em estado quiescente em prontidão para a ejaculação. A formação e a manutenção deste reservatório de armazenamento de esperma está também intimamente ligada do epitélio de revestimento, que na cauda é dominado pela forte atividade de absorção4,5. Apesar de diferenças anatômicas foram relatados6,7,8, tal divisão regionalizada do trabalho parece ser uma característica do epidídimo que é compartilhado entre a maioria das espécies de mamíferos estudou até à data, incluindo a nossa própria9,10. Com efeito, do ponto de vista clínica, é conhecido que disfunção do epidídimo faz uma importante contribuição para a etiologia do fator masculino infertilidade11, destacando assim a importância de compreender o Regulamento deste tecido especializado.

Assim, é lamentável que o nosso entendimento da fisiologia do epidídimo e os mecanismos que regulam as fases sequenciais de maturação de espermatozoides e armazenamento dentro deste tecido, continuam a ser totalmente resolvido. Entre os fatores que contribuem, limitantes avanços na pesquisa do epidídimo são a complexidade geral deste tecido e conhecimento dos mecanismos que exercem o controlo regulamentar sobre seu microambiente luminal. Anatomicamente, sabemos que, para além da distinção de segmentos caput, corpo e cauda, epidídimo pode ser subdividido em várias zonas (figura 1A), cada um separados por septos12 e caracterizada por perfis distintos de gene/proteína expressão13,14,15,16,17,18. Com efeito, com base em detalhada transcriptional perfilamento segmental da expressão do gene no epidídimo, até 6 e 9 zonas epidídimo distintas têm sido relatadas em modelos do rato e do rato, respectivamente de19,20. Tal complexidade presumivelmente reflete a composição da soma do epidídimo, um epitélio pseudoestratificado composto por numerosos tipos de células diferentes; cada diferindo em relação a suas atividades de abundância, distribuição e secretora/absorção ao longo do comprimento do trato. Assim, as células principais são de longe a mais abundante epidídimo célula tipo que constituem mais de 80% de todas as células epiteliais. Assim, as células principais são responsáveis pela maior parte da proteína epidídimo biossíntese e secreção de5. Em contraste, a população de células claras, que classificar como o tipo de célula a segunda mais abundante dentro do epidídimo soma, está principalmente envolvida na absorção seletiva de componentes luminal e a acidificação deste microambiente5. Adicionar outra camada de complexidade, andrógenos e outros fatores de lumicrine de origem testicular exercem controle diferencial sobre cada um desses tipos de células do epidídimo, dependendo de seu posicionamento ao longo do trato.

Apesar das limitações impostas pelo tal complexidade, incursões significativas continuam a ser feito para resolver a base mecanicista da função do epidídimo. Uma chave para estes estudos tem sido a aplicação de estratégias avançadas espectrometria de massa para estabelecer inventários de larga escala de proteome o epidídimo, em conjunto com análises detalhadas das proteínas individuais, seleccionadas de entre essas pesquisas iniciais. Uma ilustração desta abordagem é nossa recente caracterização da família de mechanoenzymes no rato modelo21de DNM. Nosso interesse inicial em DNM foi alimentado por sua ação dupla no acoplamento de exo – e processos endocytotic. Baseando-se estas observações, fomos capazes de demonstrar que as três isoformas canônicas de DNM (DNM1 – DNM3) são altamente expressa no epidídimo de rato e adequadamente posicionadas para atender funções reguladoras na secreção de proteínas e absorção21 . Além disso, fomos capazes de diferenciar claramente cada isoform DNM com base em sua localização celular e sub celular, sugerindo que eles possuem complementares, em oposição à atividade redundante, dentro do epitélio do epidídimo21.

Aqui, descrevemos a metodologia experimental empregada para o estudo da expressão de DNM no epidídimo de rato com a esperança que esta informação será encontrar ampla aplicação na caracterização de proteínas epidídimo alternativas e, assim, contribuir para nossa compreensão da função desse elemento importante do aparelho reprodutor masculino. Especificamente, descrevemos o desenvolvimento da metodologia robusta para a rotulagem de imunofluorescência de proteínas alvo nas seções epidídimo parafina e a detecção subsequente da distribuição espacial destas proteínas através de imunofluorescência microscopia. Documentamos ainda mais nossos protocolos recentemente otimizado22 para o isolamento e caracterização de epididymosomes; exossomo-como pequenas vesículas que constituem elementos-chave do epidídimo perfil secretora e parecem manter um papel de destaque na promoção de maturação do esperma23. Como uma abordagem complementar, descrevemos também a detecção de imunofluorescência de proteínas do alvo em uma linhagem de células do rato imortalizado caput epidídimo epitelial (mECap18) e o uso deste recurso como um modelo com o qual deseja explorar o Regulamento do epidídimo a atividade secretora em vitro.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais envolvendo a coleção de tecidos animais foram aprovados pelo cuidado Animal e Comitê de ética da Universidade de Newcastle. 1. imunofluorescência coloração das seções parafina epidídimo (figuras 1 e 2) Imediatamente após a eutanásia de ratos adultos através da inalação de CO2 (camundongos suíços, mais de 8 semanas de idade), dissecar cuidadosamente o epidídimo (utilizando tesouras cirúrgicas e uma pinça) livre de sob…

Representative Results

Figura 1 e Figura 2 mostram resultados representativos de localização de imunofluorescência de DNM no epidídimo caput do mouse. Cada um das três isoformas DNM investigado exibir localização distintos perfis. Assim, DNM1 caracteriza-se por rotulagem difusa relativamente modesto das células epidídimo durante todo o epidídimo inicial do segmento e caput (Figura 2A). Por outro …

Discussion

Estes estudos incorporaram o uso de tecido do Bouin fixo epidídimo que tinha sido submetido a incorporação de parafina e protocolos padrão de corte. Fixador solução de Bouin é composto por uma mistura de formol, ácido pícrico e ácido acético, com cada componente tem uma função específica e complementar. Assim, formaldeído reage com aminas primárias para formar ligações cruzadas de proteína, ácido pícrico lentamente penetra o tecido formando sais e, portanto, coagulação das proteínas básicas e por…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores que gostaria de agradecer a nacionais de saúde e médico pesquisa Conselho de Austrália projeto Grant APP1103176 pelo apoio deste trabalho.

Materials

Dynamin 1 antibody Abcam ab108458 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 2 antibody Santa Cruz sc-6400 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Dynamin 3 antibody Proteintech 14737-1-AP Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ATP6V1B1 antibody Santa Cruz sc-21206 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
CD9 antibody BD Pharmingen 553758 Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal
Flotillin-1 antibody Sigma F1180 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
ALOX15 antibody Abcam ab80221 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
TUBB antibody Santa Cruz sc-5274 Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal
PSMD7 antibody Abcam ab11436 Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit Alexa Fluor 488 Thermo A11008 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 488 Thermo A11055 Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Goat Alexa Fluor 594 Thermo A11058 Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat Alexa Fluor 594 Thermo A11007 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rabbit HRP Millipore DC03L Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Rat HRP Millipore DC01L Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
Anti Mouse HRP Santa Cruz sc-2005 Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal
4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma D9564
propidium iodide (PI) Sigma P4170
Mowiol 4-88 Calbiochem 475904
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A7906
fetal bovine serum (FBS) Bovogen SFBS-F
DMEM Thermo 11960-044
L-glutamine Thermo 25030-081
penicillin/streptomycin Thermo 15140-122
5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN Sigma A8380
sodium pyruvate Thermo 11360-070
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma T4049
Paraformaldehyde (PFA) EMS 15710
Xylene VWR Chemicals 1330-20-7
Ethanol VWR Chemicals 64-17-5
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma P4417
Sodium citrate Sigma S1804
Tris Astral 0497-5KG
Glycerol Sigma G5516
1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane Sigma D2522
Poly-L-gysine Sigma P4832
Triton X-100 Sigma 78787
Trypan blue Sigma T6146
Trichloroacetic acid Sigma T9159
Acetone Ajax Finechem A6-2.5 L GL
Sucrose Sigma S0389
Poly (vinyl alcohol) Sigma P8136
D-Glucose Ajax Finechem 783-500G
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma D1556
Fluorescence microscopy Zeiss Zeiss Axio Imager A1
Ultracentrifuge BECKMAN COULTER Optima Max-XP
Microcentrifuges Eppendorf 5424R
Incubator Heracell 150
Large Orbital Shaker Ratek OM7
Microwave LG MS3840SR /00
Lab pH Meter MeterLab PHM220
Liquid-repellent slide marker Daido Sangyo Mini
Coverslip Thermo 586
6 well plate CELLSTAR 657160
12 well plate CELLSTAR 665180
Slide Mikro-Glass SF41296PLMK
0.45 µm filter Millox-HV SLHV033RS
Kimwipes Dustfree Paper KIMTECH 34155
Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) BECKMAN COULTER 347356
Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) BECKMAN COULTER 362305
Cell strainer 70 µm Nylon FALCON 352350
Petri dish 35 × 10 mm with cams SARSTED 82.1135.500
Slide jar TRAJAN #23 319 00

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Zhou, W., Sipilä, P., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion. J. Vis. Exp. (138), e58308, doi:10.3791/58308 (2018).

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