Análise da síntese proteica epidídimo e secreção
Summary
Aqui, nós relatamos a localização de imunofluorescência de Dinamina para ilustrar os protocolos para a detecção de proteínas em seções epidídimo de rato de parafina e aqueles de uma linhagem de células epidídimo imortalizado (mECap18). Também descrevemos os protocolos para o isolamento de proteínas secretoras do epidídimo fluido e mídia celular condicionados.
Abstract
O epidídimo mamíferos gera um dos mais complexos fluidos intraluminal de qualquer glândula endócrina para oferecer suporte a maturação pós-testicular e armazenamento de espermatozoides. Tal complexidade surge devido a atividade secretora e absorvente combinada das pilhas epithelial forro. Aqui, descrevemos as técnicas para a análise da secreção e síntese de proteínas epidídimo, centrando-se sobre a família de proteínas de modelo de Dinamina (DNM) mechanoenzymes; GTPases grandes que têm o potencial para regular eventos de tráfico membrana bi-direcional. Para o estudo da expressão da proteína no tecido epidídimo, descrevemos a metodologia robusta para a rotulagem de imunofluorescência de proteínas alvo nas secções de parafina e a detecção subsequente da distribuição espacial destas proteínas através microscopia de imunofluorescência. Também descrevemos a metodologia otimizada para o isolamento e caracterização de exossomo como vesículas, conhecido como epididymosomes, que são secretadas no lúmen epidídimo para participar na comunicação intercelular com maturação de células de esperma. Como uma abordagem complementar, também descrevemos a detecção de imunofluorescência de proteínas alvo em uma linhagem de células do rato SV40-imortalizado caput epidídimo epitelial (mECap18). Além disso, podemos discutir o utilitário da linha de celular mECap18 como um modelo adequado em vitro com para explorar a regulação da atividade secretora epidídimo. Para este fim, descrevemos as exigências de cultivo para a manutenção da linhagem celular mECap18 e o uso de esquemas de inibição farmacológica seletiva que são capazes de influenciar seu perfil de proteínas secretoras. Os últimos são prontamente avaliaram através da colheita de condicionados de meio de cultura, concentração de proteínas secretadas através de precipitação do ácido tricloroacético/acetona e sua posterior análise através de SDS-PAGE e immunoblotting. Podemos afirmar que esses métodos combinados são apropriados para a análise de alternativas de proteína epidídimo alvos como um prelúdio para determinar seu papel funcional na maturação do esperma e/ou armazenamento.
Introduction
Os espermatozoides de todas as espécies de mamíferos adquirem o potencial para exibir motilidade progressiva e para fertilizar um óvulo durante a sua descida prolongada através do epidídimo, uma região altamente especializada do sistema masculino adesiva extra testicular, que pode 7-14 dias para navegar (dependendo da espécie)1. Devido a extrema condensação da cromatina a paterna e o derramamento da maioria do citoplasma que acompanha a cytodifferentiation de espermatozoides nos testículos, sua maturação funcional subsequente é conduzida exclusivamente por sua interação com o microambiente epidídimo. Neste meio é, por sua vez, criado pela atividade secretora e absorvente da soma de epidídimo forro e exibe um nível excepcional de variação de segmento-segmento1. Assim, os segmentos mais ativos em termos de síntese proteica e secreção são aqueles localizados na porção proximal do epidídimo (ou seja, o caput e corpus)2. Esta actividade espelha o perfil funcional de espermatozoides, com o início de primeira células para exibir marcas de competência funcional (i. e., motilidade progressiva e a capacidade de ligar a zona do ácido-solubilizado glicoproteínas) seguir seus passagem do caput epidídimo3. Esses atributos funcionais continuam a desenvolver-se antes de atingir os níveis ideais como o esperma alcançar o segmento distal epidídimo (cauda), onde eles são armazenados em estado quiescente em prontidão para a ejaculação. A formação e a manutenção deste reservatório de armazenamento de esperma está também intimamente ligada do epitélio de revestimento, que na cauda é dominado pela forte atividade de absorção4,5. Apesar de diferenças anatômicas foram relatados6,7,8, tal divisão regionalizada do trabalho parece ser uma característica do epidídimo que é compartilhado entre a maioria das espécies de mamíferos estudou até à data, incluindo a nossa própria9,10. Com efeito, do ponto de vista clínica, é conhecido que disfunção do epidídimo faz uma importante contribuição para a etiologia do fator masculino infertilidade11, destacando assim a importância de compreender o Regulamento deste tecido especializado.
Assim, é lamentável que o nosso entendimento da fisiologia do epidídimo e os mecanismos que regulam as fases sequenciais de maturação de espermatozoides e armazenamento dentro deste tecido, continuam a ser totalmente resolvido. Entre os fatores que contribuem, limitantes avanços na pesquisa do epidídimo são a complexidade geral deste tecido e conhecimento dos mecanismos que exercem o controlo regulamentar sobre seu microambiente luminal. Anatomicamente, sabemos que, para além da distinção de segmentos caput, corpo e cauda, epidídimo pode ser subdividido em várias zonas (figura 1A), cada um separados por septos12 e caracterizada por perfis distintos de gene/proteína expressão13,14,15,16,17,18. Com efeito, com base em detalhada transcriptional perfilamento segmental da expressão do gene no epidídimo, até 6 e 9 zonas epidídimo distintas têm sido relatadas em modelos do rato e do rato, respectivamente de19,20. Tal complexidade presumivelmente reflete a composição da soma do epidídimo, um epitélio pseudoestratificado composto por numerosos tipos de células diferentes; cada diferindo em relação a suas atividades de abundância, distribuição e secretora/absorção ao longo do comprimento do trato. Assim, as células principais são de longe a mais abundante epidídimo célula tipo que constituem mais de 80% de todas as células epiteliais. Assim, as células principais são responsáveis pela maior parte da proteína epidídimo biossíntese e secreção de5. Em contraste, a população de células claras, que classificar como o tipo de célula a segunda mais abundante dentro do epidídimo soma, está principalmente envolvida na absorção seletiva de componentes luminal e a acidificação deste microambiente5. Adicionar outra camada de complexidade, andrógenos e outros fatores de lumicrine de origem testicular exercem controle diferencial sobre cada um desses tipos de células do epidídimo, dependendo de seu posicionamento ao longo do trato.
Apesar das limitações impostas pelo tal complexidade, incursões significativas continuam a ser feito para resolver a base mecanicista da função do epidídimo. Uma chave para estes estudos tem sido a aplicação de estratégias avançadas espectrometria de massa para estabelecer inventários de larga escala de proteome o epidídimo, em conjunto com análises detalhadas das proteínas individuais, seleccionadas de entre essas pesquisas iniciais. Uma ilustração desta abordagem é nossa recente caracterização da família de mechanoenzymes no rato modelo21de DNM. Nosso interesse inicial em DNM foi alimentado por sua ação dupla no acoplamento de exo – e processos endocytotic. Baseando-se estas observações, fomos capazes de demonstrar que as três isoformas canônicas de DNM (DNM1 – DNM3) são altamente expressa no epidídimo de rato e adequadamente posicionadas para atender funções reguladoras na secreção de proteínas e absorção21 . Além disso, fomos capazes de diferenciar claramente cada isoform DNM com base em sua localização celular e sub celular, sugerindo que eles possuem complementares, em oposição à atividade redundante, dentro do epitélio do epidídimo21.
Aqui, descrevemos a metodologia experimental empregada para o estudo da expressão de DNM no epidídimo de rato com a esperança que esta informação será encontrar ampla aplicação na caracterização de proteínas epidídimo alternativas e, assim, contribuir para nossa compreensão da função desse elemento importante do aparelho reprodutor masculino. Especificamente, descrevemos o desenvolvimento da metodologia robusta para a rotulagem de imunofluorescência de proteínas alvo nas seções epidídimo parafina e a detecção subsequente da distribuição espacial destas proteínas através de imunofluorescência microscopia. Documentamos ainda mais nossos protocolos recentemente otimizado22 para o isolamento e caracterização de epididymosomes; exossomo-como pequenas vesículas que constituem elementos-chave do epidídimo perfil secretora e parecem manter um papel de destaque na promoção de maturação do esperma23. Como uma abordagem complementar, descrevemos também a detecção de imunofluorescência de proteínas do alvo em uma linhagem de células do rato imortalizado caput epidídimo epitelial (mECap18) e o uso deste recurso como um modelo com o qual deseja explorar o Regulamento do epidídimo a atividade secretora em vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estes estudos incorporaram o uso de tecido do Bouin fixo epidídimo que tinha sido submetido a incorporação de parafina e protocolos padrão de corte. Fixador solução de Bouin é composto por uma mistura de formol, ácido pícrico e ácido acético, com cada componente tem uma função específica e complementar. Assim, formaldeído reage com aminas primárias para formar ligações cruzadas de proteína, ácido pícrico lentamente penetra o tecido formando sais e, portanto, coagulação das proteínas básicas e por…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores que gostaria de agradecer a nacionais de saúde e médico pesquisa Conselho de Austrália projeto Grant APP1103176 pelo apoio deste trabalho.
Materials
| Dynamin 1 antibody | Abcam | ab108458 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 2 antibody | Santa Cruz | sc-6400 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Dynamin 3 antibody | Proteintech | 14737-1-AP | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ATP6V1B1 antibody | Santa Cruz | sc-21206 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| CD9 antibody | BD Pharmingen | 553758 | Host species: Rat, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| Flotillin-1 antibody | Sigma | F1180 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| ALOX15 antibody | Abcam | ab80221 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| TUBB antibody | Santa Cruz | sc-5274 | Host species: Mouse, Isotype: IgG, Class: monoclonal |
| PSMD7 antibody | Abcam | ab11436 | Host species: Rabbit, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo | A11008 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 488 | Thermo | A11055 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Goat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11058 | Host species: Donkey, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat Alexa Fluor 594 | Thermo | A11007 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rabbit HRP | Millipore | DC03L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Rat HRP | Millipore | DC01L | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| Anti Mouse HRP | Santa Cruz | sc-2005 | Host species: Goat, Isotype: IgG, Class: polyclonal |
| 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9564 | |
| propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
| Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS-F | |
| DMEM | Thermo | 11960-044 | |
| L-glutamine | Thermo | 25030-081 | |
| penicillin/streptomycin | Thermo | 15140-122 | |
| 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN | Sigma | A8380 | |
| sodium pyruvate | Thermo | 11360-070 | |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | T4049 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 15710 | |
| Xylene | VWR Chemicals | 1330-20-7 | |
| Ethanol | VWR Chemicals | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 | |
| Tris | Astral | 0497-5KG | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| 1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane | Sigma | D2522 | |
| Poly-L-gysine | Sigma | P4832 | |
| Triton X-100 | Sigma | 78787 | |
| Trypan blue | Sigma | T6146 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T9159 | |
| Acetone | Ajax Finechem | A6-2.5 L GL | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Poly (vinyl alcohol) | Sigma | P8136 | |
| D-Glucose | Ajax Finechem | 783-500G | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Fluorescence microscopy | Zeiss | Zeiss Axio Imager A1 | |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | Optima Max-XP | |
| Microcentrifuges | Eppendorf | 5424R | |
| Incubator | Heracell | 150 | |
| Large Orbital Shaker | Ratek | OM7 | |
| Microwave | LG | MS3840SR /00 | |
| Lab pH Meter | MeterLab | PHM220 | |
| Liquid-repellent slide marker | Daido Sangyo | Mini | |
| Coverslip | Thermo | 586 | |
| 6 well plate | CELLSTAR | 657160 | |
| 12 well plate | CELLSTAR | 665180 | |
| Slide | Mikro-Glass | SF41296PLMK | |
| 0.45 µm filter | Millox-HV | SLHV033RS | |
| Kimwipes Dustfree Paper | KIMTECH | 34155 | |
| Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 × 35 mm) | BECKMAN COULTER | 347356 | |
| Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 × 56 mm) | BECKMAN COULTER | 362305 | |
| Cell strainer 70 µm Nylon | FALCON | 352350 | |
| Petri dish 35 × 10 mm with cams | SARSTED | 82.1135.500 | |
| Slide jar | TRAJAN | #23 319 00 |
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