Summary

Isolatie van extracellulaire blaasjes aan de lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof met behulp van een techniek van ultrafiltratie centrifugeren

Published: November 09, 2018
doi:

Summary

Hier beschrijven we twee extracellulaire vesikel isolatie protocollen, ultrafiltratie centrifugeren en ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren, te isoleren van extracellulaire blaasjes van lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeibare steekproeven. De extracellulaire blaasjes lymfkliertest bronchoalveolar lavage vloeistof door beide methoden afgeleid zijn gekwantificeerd en gekenmerkt.

Abstract

Extracellulaire blaasjes (EVs) zijn pas ontdekte subcellular componenten die spelen een belangrijke rol in vele biologische functies signalering tijdens fysiologische en pathologische staten. Het isolement van het EVW blijft een grote uitdaging op dit gebied, als gevolg van beperkingen die inherent is aan iedere techniek. De differentiële ultracentrifugatie met dichtheid kleurovergang centrifugeren methode is een veel gebruikte aanpak en wordt beschouwd als de gouden standaard procedure voor EV isolatie. Deze procedure is echter tijdrovend, arbeidsintensief, en over het algemeen resulteert in lage schaalbaarheid, die mogelijk niet geschikt voor kleine aantallen monsters zoals bronchoalveolar lavage vloeistof. We laten zien dat een ultrafiltratie centrifugeren isolatie methode eenvoudig is en tijd en arbeid-energiezuinige nog een hoge herstel opbrengst en zuiverheid biedt. Wij stellen voor dat deze isolatie-methode kan een alternatieve benadering die geschikt is voor EV isolatie, met name voor kleine hoeveelheden biologische specimens.

Introduction

Exosomes zijn de kleinste deelverzameling van het EVW, 50-200 nm in diameter, en meerdere biologische functies overal een veelzijdige signalering processen1,2,3,4,5. Ze regelen cellulaire en weefsel homeostase voornamelijk doordat intercellulaire communicatie via lading moleculen zoals lipiden, eiwitten en nucleïnezuren6,7,8,9 . Een kritieke stap in EV-onderzoek is het proces van isolement. Differentiële ultracentrifugatie (UC), met of zonder dichtheid kleurovergang centrifugeren (DGC), wordt beschouwd als de gouden standaard aanpak, maar deze methode draagt grote beperkingen, met inbegrip van inefficiënte EV herstel tarieven en lage schaalbaarheid10 , 11 , 12, beperken die het beste gebruik te groter volume monsters, zoals cel cultuur bezinken of hoge exosome productie exemplaren. De voor- en nadelen van andere methoden, zoals grootte uitsluiting door ultrafiltratie of chromatografie, immunoaffinity isolatie door kralen of meer sorteerkolommen en microfluidics, worden goed beschreven, en moderne aanvullende procedures zijn ontwikkeld om overwinnen en technische beperkingen in elke aanpak11,12,13,14,15te minimaliseren. Anderen hebben aangetoond dat een ultrafiltratie centrifugeren (UFC) met een nanoporeuze membraan in de filter-eenheid is een alternatieve techniek waarmee vergelijkbare zuiverheid een UC methode16,17,18. Deze techniek kan worden beschouwd als een van de methoden van alternatieve isolatie.

Bronchoalveolar lavage vloeistof (BALF) bevat EVs die talrijke biologische functies in verschillende luchtwegen19,20,21,22 bezitten. Studeren BALF afkomstige EVs houdt sommige uitdagingen als gevolg van de invasiviteit van de bronchoscopie procedure bij de mens, alsmede een beperkte hoeveelheid lavage vloeistof herstel. In kleine laboratoriumdieren zoals muizen, alleen een paar milliliter in normale longaandoeningen kunnen worden hersteld, zelfs minder in longen ontstoken of fibrotische23. Bijgevolg, het verzamelen van een voldoende hoeveelheid BALF voor EV isolatie door een differentiële ultracentrifugatie voor downstream toepassingen kan niet haalbaar. Isoleren van juiste EV populaties is echter een cruciale factor voor het bestuderen van de biologische functies van de EV. Het delicate evenwicht tussen efficiëntie en werkzaamheid blijft een uitdaging in gevestigde EV isolatie methoden.

In deze huidige studie, wij laten zien dat een centrifugaal ultrafiltratie benadering, met gebruikmaking van een 100 kDa molecuulgewicht cut-off (MWCO) nanomembrane filter unit, geschikt voor kleine hoeveelheden biologische specimen zoals BALF. Deze techniek is eenvoudig, efficiënt en biedt hoge zuiverheid en schaalbaarheid ter ondersteuning van de studie van het EVW BALF-afgeleide.

Protocol

Het gebruik van dieren en alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik commissies (IACUC) bij het Cedars-Sinai Medical Center (CSMC). 1. lymfkliertest Bronchoalveolar Lavage vloeistof (BALF) verzameling en voorbereiding BALF collectie Euthanaseren muizen met een cocktail van ketamine (300 mg/kg) en xylazine (30 mg/kg) via de intraperitoneaal route gevolgd door cervicale dislocatie. Plaats een 22 G-angiocatheter in de lu…

Representative Results

We EV isolatie van muis BALF uitgevoerd met behulp van de UFC en UC-DGC isolatie-methoden op dezelfde dag. De UFC-methode vereist ongeveer 2,5-3 h, overwegende dat de UC-DGC techniek 8 h verwerkingstijd vereist. Worden hier niet meegerekend buffers en reagens voorbereidingstijd. Opgemerkt moet worden dat bepaalde andere taken kunnen worden uitgevoerd tijdens de perioden van de lange centrifugeren. Echter duurde de gehele procedure bijna een hele dag voor de UC-DGC isolatie-techniek. <…

Discussion

In de afgelopen decennia, hebben de wetenschappers de betekenissen van het EVW in cellulaire homeostase ontrafeld. Nog belangrijker, spelen EVs een grote rol in vele ziekteprocessen door modulerende ver en naburige cellen via hun bioactieve lading moleculen1,21,22,26,27 , 28 , 29 ,</sup…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het werk wordt ondersteund door de NHLBI/NIH subsidies HL103868 (voor pct.) en HL137076 (tot pct.), de American Heart Association Grant-in-Aid (naar pct.) en de Samuel Oschin uitgebreide kanker instituut (SOCCI) Lung Cancer Research Award (naar pct.). Wij zouden graag onze grote waardering uitspreken voor de Smidt Heart Institute in het Cedars-Sinai Medical Center waarmee ons een Nanosight machine voor EV nanoparticle bijhouden van analyse.

Materials

Material
Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K Sigma-Millipore, St. Louis, MO UFC910024
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Corning Cellgro, Manassas, VA 21-031-CV
Sucrose Sigma-Millipore, St. Louis, MO EMD8550
HEPES Research Products International, Prospect, IL 75277-39-3
EDTA Corning Cellgro, Manassas, VA 46-034-CI
Sodium Chloride Sigma-Millipore, St. Louis, MO S3014-1KG
OptiPrep Sigma-Millipore, St. Louis, MO MKCD9753 Density Gradient Medium
Ketamine VetOne, Boise, ID 13985-702-10
Xylazine Akorn Animal Health, Lake Forest, IL 59399-110-20
Syringe 1 mL BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 309656
Angiocatheter 20G BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 381703
Centrifuge tubes 15 mL VWR, Radnor, PA 89039-666
Centrifuge tubes 50 mL Corning Cellgro, Manassas, VA 430828
Bicinchonic acid (BCA) protein assay Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL 23235
Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody AbCam, Cambridge, MA AB125011
Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody Biolegend, San Diego, CA 143904
CD81
CD9
Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody Cell Signaling Technology, Danvers, MA 7074S
4x LDS
10x Reducing agent (Bolt)
10x Lysis buffer (Bolt) Cell Signaling Technology, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA NW04120
iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA IB23002
Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO Denville Scientific, Holliston, MA E2400
Ultracentrifuge tubes 17 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 337986
Ultracentrifuge tubes 38.5 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 326823
Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 09-754-13
Equipment
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany
Ultracentrifuge Beckman Coulter, Pasadena, CA
Nanosight (NS300) Malvern, Worcestershire, UK To measure particle size distribution and particle concentration
MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany
iBlot Transfer Apparatus Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System Bio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10 Analysis software

References

  1. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
  2. Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
  3. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  4. Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
  5. Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
  6. Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
  7. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  8. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
  9. Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
  10. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
  11. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
  12. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
  13. Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  15. Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
  16. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).
  17. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).
  18. Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
  19. Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
  20. Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
  21. Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
  22. Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
  23. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
  24. Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
  25. Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
  26. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
  27. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
  28. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
  29. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
  30. Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
  31. Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
  32. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  33. Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
  34. Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).
  35. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  36. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
  37. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  38. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).
  39. Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277 (2016).
  40. Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
  41. Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS – Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
  42. Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).
  43. Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).

Play Video

Cite This Article
Parimon, T., Garrett III, N. E., Chen, P., Antes, T. J. Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique. J. Vis. Exp. (141), e58310, doi:10.3791/58310 (2018).

View Video