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Immunology and Infection

Isolement des vésicules extracellulaires du murin lavage broncho-alvéolaire fluide à l’aide d’une Technique de Centrifugation de l’Ultrafiltration

doi: 10.3791/58310 Published: November 9, 2018

Summary

Nous décrivons ici les deux protocoles d’isolement vésicule extracellulaire, centrifugation d’ultrafiltration et ultracentrifugation avec centrifugation en gradient de densité, d’isoler des vésicules extracellulaires des échantillons de liquide de lavage broncho-alvéolaire murine. Les vésicules extracellulaires dérivés du murin de lavage bronchoalvéolaire par ces deux méthodes sont quantifiés et caractérisés.

Abstract

Vésicules extracellulaires (EVs) sont des composants subcellulaires nouvellement découverts qui jouent un rôle important dans de nombreux biologique des fonctions de signalisation lors d’États physiologiques et pathologiques. L’isolement du SVE demeure un défi majeur dans ce domaine, en raison des limites inhérentes à chaque technique. L’ultracentrifugation différentielle avec la méthode de centrifugation en gradient de densité est une approche couramment utilisée et est considérée comme la procédure de l’étalon-or pour l’isolement de l’EV. Toutefois, cette procédure est longue et fastidieuse et donne généralement lieu à faible évolutivité, qui peut ne pas convenir pour les petits échantillons comme liquide de lavage broncho-alvéolaire. Nous démontrons qu’une méthode d’isolement de centrifugation ultrafiltration est simple et efficace-temps et travail encore fournit un rendement élevé de récupération et la pureté. Nous proposons que cette méthode d’isolement pourrait être une approche alternative qui convient pour l’isolation de l’EV, particulièrement pour les petits spécimens biologiques.

Introduction

Exosomes sont le plus petit sous-ensemble du SVE, 50 à 200 nm de diamètre et ont plusieurs fonctions biologiques à travers un large éventail de processus1,2,3,4,5de signalisation. Elles régissent l’homéostasie cellulaire et tissulaire principalement en facilitant la communication intercellulaire par l’intermédiaire de molécules de fret comme les lipides, les protéines et acides nucléiques6,7,8,9 . Une étape critique dans la recherche de l’EV est le processus d’isolement. Ultracentrifugation différentielle (UC), avec ou sans la centrifugation en gradient de densité (DGC), est considéré comme l’approche de l’étalon-or, mais cette méthode comporte des limites importantes, y compris les taux de récupération des EV inefficaces et faible évolutivité10 , 11 , 12, qui limitent sa meilleure utilisation de plus grands échantillons de volume, comme cell culture exosome surnageant ou haute production. Les avantages et les inconvénients des autres méthodes, telles que l’exclusion de taille par ultrafiltration ou chromatographie d’immunoaffinité isolation par perles ou colonnes et microfluidique, sont bien décrits, et des procédures supplémentaires modernes ont été développés pour surmonter et réduire au minimum les limitations techniques dans chaque approche11,12,13,14,15. D’autres ont montré qu’une centrifugation d’ultrafiltration (UFC) par une membrane NANOPOREUSE dans l’unité de filtration est une technique alternative qui assure une pureté comparable à une UC méthode16,17,18. Cette technique pourrait être considérée comme une des méthodes alternatives d’isolation.

Lavage bronchoalvéolaire (LLBA) contient le serveur virtuel Exchange qui possède de nombreuses fonctions biologiques dans diverses affections respiratoires19,20,21,22. Étudier EVs BALF dérivés implique certains défis en raison de l’empiétement que constitue la procédure bronchoscopie chez l’homme, mais aussi une quantité limitée de récupération liquide de lavage. Petits animaux de laboratoire comme les souris, seulement quelques millilitres peuvent être récupérés dans des conditions normales de poumon, encore moins dans les poumons enflammés ou fibreuses23. Par conséquent, recueillir une quantité suffisante de BALF pour EV isolement par une ultracentrifugation différentielle pour les applications en aval ne peut être réalisable. Cependant, les populations EV correctes est d’isoler un facteur crucial pour l’étude des fonctions biologiques EV. Le fragile équilibre entre l’efficience et l’efficacité continue d’être un défi dans les méthodes d’isolation EV bien établies.

Dans cette étude, nous montrons qu’une approche de l’ultrafiltration centrifuge, utilisant une unité de filtration 100 kDa poids moléculaire limite (MWCO) nanomembrane, est adaptée aux petits échantillons biologiques tels que BALF. Cette technique est simple, efficace et fournit la haute pureté et évolutivité pour soutenir l’étude des dérivés BALF EVs.

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Protocol

L’utilisation des animaux et toutes les procédures d’animaux ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation comités (IACUC) au Cedars-Sinai Medical Center (CSMC).

1. préparation et collecte de fluide (LLBA) murin lavage broncho-alvéolaire

  1. Collection de BALF
    1. Euthanasier la souris avec un cocktail de kétamine (300 mg/kg) et de xylazine (30 mg/kg) par voie intrapéritonéale suivie par dislocation cervicale.
    2. Insérer un cathéter 22 G dans la trachée. Fixez une seringue à insuline contenant 1 mL (mL) de solution saline tampon phosphate de Dulbecco stérile glacé (SPD) et instiller 1 mL du SPD dans les deux poumons à travers le cathéter.
    3. Retirer lentement le piston de la seringue pour récupérer BALF et distribuer la BALF dans un tube conique de 50 mL. Garder la BALF sur la glace.
    4. Répétez les étapes 1.1.2 et 1.1.3). 3 x (4 au total dans chacune des souris).
      Remarque : Environ 0,8 mL est généralement récupéré par millilitre de l’instillation. Aussi, les étapes suivantes peuvent être exécutées pour chaque souris (c.-à-d., 3 mL de BALF), mais la mise en commun de plusieurs échantillons BALF permettra l’isolement d’un lot plu d’EVs pour assurer l’uniformité dans les expériences en aval.
  2. Préparation de la BALF
    1. Piscine BALF de 25 souris et divisez-le en deux ensembles égales (environ 35 mL / portion).
    2. Centrifuger le BALF x 400 g, à 4 ° C pendant 5 min, afin de retirer les cellules et autres débris cellulaires et récupérer le surnageant.
    3. Centrifuger le surnageant à 1 500 g, à 4 ° C pendant 10 min, pour supprimer les débris cellulaires. Recueillir le liquide surnageant et passez aux étapes d’isolation EV.

2. isolement des vésicules extracellulaires du fluide Murine lavage broncho-alvéolaire

Remarque : Dans cette étude, EV deux techniques d’isolation, nommément UFC et ultracentrifugation avec flottant utilisé pour isoler EVs de BALF. Le protocole détaillé de chaque méthode est décrite ci-dessous.

  1. Méthode d’enrichissement ultrafiltration centrifugation (UFC)
    Remarque : Cette méthode a été modifiée d’un protocole décrit précédemment10.
    1. Filtrer le surnageant à l’étape 1.2.3 à travers un filtre de seringue stérile 0,2 μm et garder la BALF filtrée sur la glace.
      NOTE : Ceci est une mesure d’exclusion de taille selon laquelle seuls les vésicules inférieurs à 200 nm sont collectées.
    2. Equilibrer l’unité de filtration centrifuge de MWCO 100 kDa avec SPD stérile pendant 10 min. Centrifuger l’unité centrifuge à 1 500 x g pendant 10 min à 4 ° C pour ignorer le SPD.
      ATTENTION : Une fois la membrane dans le dispositif de filtration est équilibrée avec le SPD, la membrane doit rester humide en tout temps jusqu'à ce que l’appareil est utilisé.
    3. Remplir le filtre avec 15 mL d’échantillon BALF étape 2.1.1 et centrifuger à 3 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. La BALF intermédiaires peut être mis au rebut ou recueilli dans une éprouvette canonique et stockée à-80 ° C pour une utilisation future.
    4. Répétez l’étape 2.1.3 pour les restants 0,2 µm filtré BALF.
      Remarque : Il a fallu trois répétitions de centrifugations de concentrer suffisamment l’EVs BALF de volume départ initial de 35 mL. Il en est résulté 1 – 1,5 mL de rétentat.
    5. Laver le rétentat avec 14 mL de SPD stérile par une douceur pipetage répétitivement. Centrifuger l’ensemble filtrant à 3 000 x g, à 4 ° C pendant 30 min, retirez du SPD et de se concentrer le rétentat EV.
    6. Recueillir le SVE concentré BALF-dérivé de l’appareil de filtrage en insérant une pipette dans le bas de l’appareil filtre et en retirant l’échantillon à l’aide d’un mouvement de balayage à côté pour assurer le recouvrement total.
    7. Aliquote le SVE BALF-dérivées et les stocker à-80 ° C pour les autres particules quantification et caractérisation (voir étape 3).
  2. Ultracentrifugation (UC) avec centrifugation en gradient de densité (DGC)
    Remarque : Le protocole suivant a été modifié depuis le protocole décrit précédemment24.
    1. Transférer le surnageant de l’étape 2.1.1 dans un tube de 37 mL ultracentrifugeuse et centrifuger l’échantillon à 10 000 x g pendant 30 min à 4 ° C à l’aide d’ultracentrifugeuse. Recueillir le liquide surnageant et centrifuger à 100 000 x g, à 4 ° C pendant 60 min. Pendant que les pellets EV sont centrifugés, préparer différentes concentrations de tampons de gradient de densité (tableau 1) pour l’étape 2.2.3.
    2. Jeter le surnageant et remettre en suspension les pellets EV dans 200 μl de SPD.
    3. Mélanger la suspension EV à 300 μl de solution de travail iodixanol de 50 % (tableau 1) et transférez-le vers le tube de 15 mL ultracentrifugeuse. Sur le dessus de la suspension de mélange 50 % iodixanol-EV, séquentiellement couche la solution tampon suivant dans l’ordre du bas vers le haut : 30 % iodixanol (4,5 mL), 25 % d’iodixanol (3 mL), 15 % iodixanol (2,5 mL) et 5 % iodixanol (6 mL). Centrifuger à 100 000 x g, à 4 ° C min 230.
      Remarque : Le gradient de densité est basé sur le pourcentage de mise à l’échelle la plus forte concentration (50 %) dans la partie inférieure à la concentration la plus faible (5 %) au sommet d’iodixanol. Pour générer les différentes concentrations d’iodixanol, des quantités variables de milieu d’homogénéisation (tableau 1) ont été mélangées avec la solution de travail (50 % iodixanol).
    4. Recueillir la fraction de 15 % et 25 % et Diluez-les dans SPD stérile pour faire apparaître le volume à 15 mL. Transférez-les dans un nouveau tube petit ultracentrifugeuse et centrifuger à 100 000 x g, à 4 ° C pendant 60 min.
    5. Jeter le surnageant et remettre en suspension les pellets EV dans 50 μL de SPD stérile pour davantage de caractérisation.

3. extracellulaire vésicule Quantification

Remarque : Le rendement de récupération de dérivés BALF EVs est dosé avec deux paramètres.

  1. NANOPARTICULES suivi mesure analyse (NTA)
    1. Diluer l’échantillon EV au 1 : 200 – 1/500 à 1 mL de SPD et charge l’échantillon dans une seringue à insuline. Fixez une seringue d’échantillon à un pousse-seringue et commencer à mesurer le nombre de particules et la taille (voir Table des matières).
    2. Définir le niveau de l’appareil photo à 14 et le seuil de détection à 1 pour toutes les mesures de l’échantillon. Cinq mesures répétitives avec 1 500 cadres en 30 s ont été enregistrés pour chaque échantillon, avec une temporisation de 20 s entre les lectures. Combiner et les données pour les rapports de taille et de concentration finale en moyenne.
      Remarque : Pour capturer précis de toutes les particules, réglez le niveau de la caméra selon qu’il conviendra de visualiser toutes les particules et d’utiliser des paramètres semblables pour toutes les mesures d’échantillons dans chaque expérience.
  2. Quantification des protéines
    Remarque : L’analyse de protéine (BCA) acide bicinchoninic a été utilisé pour mesurer la concentration de la protéine de l’EVs BALF-dérivé.
    1. Solubiliser les échantillons EV dans le tampon de lyse x 1.
    2. Quantifier la quantité de protéine dans le SVE BALF dérivée selon le protocole standard de BCA à l’aide de détection colorimétrique en mesurant l’absorbance à 560 nm dans un lecteur de plaque.

4. détection des vésicules extracellulaires dérivés BALF

NOTE : Protéines de marqueur de surface communément appelé exosome (TSG101 CD63, CD81 et CD9) ont servi à vérifier les recouvrements EV par SDS-PAGE et immunoblotting et écoulement cytometry analyse.

  1. SDS-PAGE et immunoblot
    1. Dissoudre une quantité égale de protéines EV de chaque échantillon avec un buvard tampon (dodécyl sulfate de lithium) et 50 mM le dithiothréitol (DTT) dans un tube de 1,6 mL de chargement. Faire chauffer les échantillons à 70 ° C pendant 10 min.
    2. Charger les échantillons de l’étape 4.1.1 dans un gel d’acrylamide Bis-Tris Plus 4 – 12 % et exécuter l’électrophorèse (150 volts, 35 mA) pendant 35 min.
    3. Protéines de transfert sur une membrane de nitrocellulose en utilisant une méthode de transfert a sec.
    4. Bloquer la membrane avec du lait écrémé en poudre 5 % pendant 60 min, bascule à température ambiante (RT).
    5. Incuber la membrane avec un anticorps dirigé contre un marqueur de la protéine de surface EV, tumeur Susceptibility Gene 101 (TSG101), à la dilution de 1/500 à 5 % de BSA dans du tampon Tris salin Tween-20 (TBST) à 4 ° C, bascule du jour au lendemain.
    6. Le lendemain, lavez la membrane 3 x, 10 min chacun laver, dans un tampon TBST et incuber il avec anti-lapin IgG, un anticorps HRP-joint, à 1:5,000 de dilution pendant 60 min à température ambiante.
    7. Laver la membrane 3 x, 10 min chacun laver, dans un tampon TBST. Développer la membrane avec le réactif de détection des anticorps HRP par chimiluminescence et image (voir la Table des matières pour le système d’imagerie).
  2. Cytométrie en flux
    1. Diluer les dérivés BALF EVs dans le 49 μL de PEB coloration tampon (PBS, 5 mM EDTA + 0,5 % de BSA, filtrée à travers une membrane de filtre de seringue de 0,1 μm).
    2. Ajouter chacun des anticorps suivants dans chaque échantillon individuel : 1) rat de PE CD63 anticorps anti-souris (100 ng par réaction) ; 2) anti-souris rat PE CD81 (500 ng) ; 3) anti-souris rat CD9 FITC (200 ng). Incuber à 4 ° C, bascule pendant 60 min à l’obscurité.
    3. Diluer les échantillons avec 450 μl de membrane filtrée PEB tampon de coloration et de soumettre des échantillons pour analyse en cytométrie en flux (voir Table des matières)25.
    4. Ajuster les paramètres de cytomètre de flux comme suit : 1) Réglez tous les canaux hyper log (hlog) ; 2) régler la gâchette sur SSC à 4 ; 3) désactiver la détente secondaire. Exécuter les exemples dans un environnement à basse vitesse et acquérir au moins 10 000 événements dans chaque échantillon.
    5. Effectuer des analyses de données cytometry faible dans chaque échantillon à l’aide de logiciels d’analyse (voir Table des matières).

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Representative Results

Nous avons réalisé isolement EV de souris BALF à l’aide de méthodes d’isolation UFC et UC-GCR le jour même. La méthode UFC exigeait environ 2,5 à 3 h, tandis que la technique de l’UC-DGC requis 8 h de temps de traitement. Cela ne comprenait pas les tampons et les temps de préparation de réactif. Il est à noter que certaines autres tâches peuvent être effectuées durant les périodes longues de centrifugation. Néanmoins, l’ensemble de la procédure a duré presque une journée entière pour la technique d’isolement de UC-DGC.

EVs BALF-dérivé de souris normales isolées par la méthode UFC affichent une taille plus petite et une distribution plus uniforme de taille (148,8 ± 1,1 nM, la Figure 1 a) par rapport à UC-DGC EVs (176,7 ± 7,8 nM, Figure 1 b). La technique de l’UFC avait un profond numération des 65-fold particules total supérieur par rapport à l’isolement de l’UC-DGC (29,4 ± 18,4 vs 0,5 ± 0,1 x 1010 particules ; p < 0,05 ; Tableau 2 et la Figure 1). La récupération de protéines totales (en µg) de l’UFC EVs était aussi plus élevée (3 136 ± 1 860 contre 73,7 ± 38,3 µg ; p < 0,05 ; Tableau 2 et Figure 1). Ainsi, l’UFC consomme temps et d’effort et fournit un rendement supérieur de EV.

Afin de caractériser phénotypiquement EV BALF-dérivés des populations, nous avons étudié la présence de marqueurs de la protéine de surface communément appelé exosome : CD63, CD9 et CD81 par cytométrie en flux et TSG101 par immunoblotting. Par analyse en cytométrie en flux, nous avons démontré que les EVs de l’UFC et UC-DGC EVs ont tous deux expriment CD63 (Figure 2 a -2C), CD9 (Figure 2D -2F) et CD81 (Figure 2 -2I). L’expression de la moyenne géométrique (accouchement) de CD63 et CD9 CD81 a été quantifiée et pas statistiquement différent entre les deux conditions (Figure 3 a -3F).

Ensuite, nous avons examiné un autre marqueur protéique EV, TSG101, par immunoblotting. Nous avons montré que les 20 µg de l’UFC accréditives (UFC-FT) échantillon ne contient pas de protéines TSG101, suggérant que la technique d’isolement de UFC efficacement sélectionné et conservé la population EV de l’échantillon BALF (Figure 4). Lorsque des quantités égales de protéines totales (20 µg) de l’échantillon de BALF-EV a été chargé, nous avons trouvé que UFC EVs exprimé un niveau supérieur de TSG101 UC-DGC EVs (Figure 4). Nous avons également montré que la pureté de la protéine de l’UFC-EV est acceptable, démontrée par une bande unique protéine isolée.

Pour tous les résultats, de Student t-test a été utilisé pour la comparaison de deux groupes. Les résultats sont présentés en moyenne ± SEM (erreur standard de la moyenne), et p < 0,05 était considérée comme significative.

Figure 1
Figure 1 : centrifugation d’Ultrafiltration de murin de lavage bronchoalvéolaire (LBA)-EVs dérivées ont démontré une granulométrie plus homogène que l’ultracentrifugation avec centrifugation en gradient de densité du SVE de dérivés BALF murin et avait une significativement plus élevée teneur en particules total count et protéine. La distribution des tailles de particules EV a été mesurée par nanoparticules suivi d’analyse (NTA), et la teneur en protéines totales a été mesurée par le dosage d’acide bicinchoninic. Graphe de distribution des (A) UFC-BALF EVs NTA taille. Graphe de distribution de taille des EVs de UC-DGC-BALF (B). Nombre Total de particules (C) par NTA (moyenne ± SEM x 1010 particules ; * p < 0,05). (D) la teneur en protéines totales (en µg, * p < 0,05). Les données proviennent de trois expériences indépendantes. UFC : centrifugation ultrafiltration ; UC-GCR : ultracentrifugation avec centrifugation en gradient de densité ; SVE : vésicules extracellulaires ; SD : écart-type ; Conc : concentration. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : lavage bronchoalvéolaire Murine liquide dérivé EVs isolés par centrifugation d’ultrafiltration et ultracentrifugation avec méthodes de centrifugation en gradient de densité exprimée tétraspanines protéines CD63 et CD9 CD81. Montré que sont les pourcentages des véhicules électriques souillés positives par les techniques d’isolation UFC et UC-DCG, illustrées par Pseudo-couleur parcelles, pour (A - C) PE-CD63,D - FFITC-CD9 etG - jePE-CD9. Les données proviennent de trois expériences indépendantes. UFC = centrifugation ultrafiltration ; UC-DGC = ultracentrifugation avec centrifugation en gradient de densité ; EVs = vésicules extracellulaires ; SSC-A = analyse de côté de nuages de points XY ; PE = phycoérythrine ; FITC = l’isothiocyanate de fluorescéine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Ultrafiltration isolé centrifugation murine bronchoalvéolaire liquide dérivé EVs a exprimé une densité similaire fluorescente des protéines tétraspanines au SVE isolé ultracentrifugation. (A et D) Expression de l’histogramme et la moyenne géométrique (accouchement) de PE-CD63+-teinté EVs. (B et E) histogramme et accouchement de FITC-CD9+-teinté EVs. (C et F) histogramme et accouchement de PE-CD81+-teinté EVs. Ces données proviennent de trois expériences indépendantes. UFC : centrifugation ultrafiltration ; UC-DGC = ultracentrifugation avec centrifugation en gradient de densité ; SVE : vésicules extracellulaires ; Analyse des nuages de points XY SSC-A: côté ; PE : phycoérythrine ; FITC : l’isothiocyanate de fluorescéine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : lavage bronchoalvéolaire Murine liquide dérivé EVs isolés par centrifugation d’ultrafiltration et ultracentrifugation avec méthodes de centrifugation en gradient de densité exprime la protéine de surface exosome, TSG101. Ce panneau indique l’immunoblotting de murins EVs BALF-dérivé pour l’anticorps TSG101 (47 kDa). UFC = centrifugation ultrafiltration ; UC-DGC = ultracentrifugation avec centrifugation en gradient de densité ; EVs = vésicules extracellulaires ; FT = intermédiaire ; STG = gène de susceptibilité de tumeur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Travail Solution Iodixanol (%) 5 15 25 30
Solution de travail (mL)* 2 6 10 12
Milieu d’homogénéisation (mL)* 18 14 10 8

Tableau 1 : tampons de gradient de densité. Ce tableau donne le rapport de composition et de la mémoire tampon de chaque solution dégradé qui a été utilisé pour purifier les populations de dérivé de fluide extracellulaire vésicule lavage bronchoalvéolaire murine isolées par la technique d’ultracentrifugation. * La solution de travail a été iodixanol de 50 % (25 mL de milieu de gradient de densité [Voir la Table des matières] + 5 mL de solution de diluant [pH 7,4 de 0,25 M saccharose + 120 mM HEPES + 0,9 M NaCl]). ** Milieu d’homogénéisation (pH 7,4 de 0,25 M saccharose + 20 mM HEPES + NaCl 150 mM)

Méthodes À partir du Volume (mL) NTA* (x 108/μL) Total des particules(x1010) Protéine Conc (µg/µL) Protéines totales§ (µg)
UFC 35 7.69 ± 2,6 29,4 ± 18,4 3.7 3 136 ± 1860
UC-DGC 35 0,5 ± 0,05 0,5 ± 0,1 0,6 73.7 ± 38,3

Tableau 2 : la méthode d’isolement de centrifugation ultrafiltration a fourni un rendement de dérivés de fluide extracellulaire vésicule lavage bronchoalvéolaire murine haut. La concentration de particules et le nombre total de particules ont été mesurées par nanoparticules suivi d’analyse (NTA). La concentration de protéines et la quantité totale de protéine ont été mesurées par un dosage de la protéine acide bicinchoninic. * La concentration de particules des BALF EVs (moyenne ± SEM x 108/μL de trois expériences indépendantes).  Particule de total des BALF EVs (moyenne ± SEM x 1010 particules de trois expériences indépendantes).  Concentration de protéines des BALF EVs (moyenne ± SEM µg/µL de trois expériences indépendantes). § Protéines totales des BALF EVs (moyenne ± SEM mg de trois expériences indépendantes).
UFC : centrifugation ultrafiltration ; UC-GCR : ultracentrifugation avec centrifugation en gradient de densité ; Conc : concentration ; NTA : nanoparticules suivi d’analyse ; SEM : erreur-type de la moyenne.

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Discussion

Dans les dernières décennies, les scientifiques ont démêlé les significations du SVE dans l’homéostasie cellulaire. Plus important encore, les EVs jouent un rôle important dans de nombreux processus de maladie en modulant les cellules voisines et lointaines à leur cargaison bioactifs molécules1,21,22,26,27 , 28 , 29 , 30. développement futur et les progrès dans ce domaine profondément invoquent fiables et efficaces qui non seulement d’identifier et séparent corriger les sous-ensembles de populations EV mais également de préserver leurs fonctions biologiques pour des applications en aval 10 , 11 , 14 , 31. dans la présente étude, nous avons décrit une méthode de centrifugation (UFC) de l’ultrafiltration nanomembrane pour isoler les EVs de souris BALF. En concordance avec d’autres rapports, nous avons montré que UFC est simple et se traduit par un rendement élevé de récupération et de la pureté et, par conséquent, est adapté aux petits échantillons biologiques10,17,18,32 .

UC-DGC est couramment utilisé et est considéré comme la technique de l’étalon-or pour EV isolement parce qu’il fournit hautement purifiée EV particules10,14. Toutefois, cette méthode est techniquement difficile, fastidieux, fastidieuse et a une faible évolutivité. Les techniques de base microfluidics nouvellement mis au point surmonter ces limites, mais cette approche requiert plus de validation avant que puisse être pleinement appliqué comme une méthode alternative33,34. Ainsi, les méthodes appropriées qui prendre en compte ces difficultés sans compromettre la pureté et l’évolutivité des échantillons font cruellement défaut, en particulier pour les petits volumes de liquide biologique.

Nous avons démontré que UFC à l’aide d’un dispositif de filtration nanomembrane a été efficace pour l’isolation de l’EV de spécimens BALF. Les résultats présentés ici mettent en évidence la supériorité de la procédure de l’UFC par rapport à l’étalon-or méthode UC-DGC en raison de sa simplicité et évolutivité supérieure. L’approche axée sur l’ultrafiltration a devenir largement adoptée pour isoler les EV d’une variété de spécimens biologiques : urine35, conditionné par cellule médias17et sérum de veau fœtal36. L’autre modulaire basée sur la taille EV isolement technique qui utilise ultrafiltration comme plate-forme est exosome isolement total puce (exotique)31. Cette méthode convient également pour les petits spécimens de la taille de l’échantillon. Quelques facteurs comme matériau filtrant et la taille des pores de la nanomembranes, doivent être examinées lors de l’utilisation de la technique de l’UFC car elles peuvent affecter les propriétés du SVE récupérés. Par exemple, différents types de membranes de filtration a entraîné des rendements de récupération associées à EV RNA d’urine18. Dans cette étude, nous avons montré que la cellulose régénérée (RC) avec un 10 kDa MWCO fourni la plus haute expression de l’ARNm de NOP10, OST4, SNRPG, et TOMM7 par rapport à Hydrosart 10 kDa ou polyéthersulfone (PES) de 10 kDa18. De plus, nous avons démontré que la RC avec 10 kDa avait une plus forte reprise de EV rétentat que les 100 kDa. D’autres ont caractérisé le contenu de cargaison de EVs urine qui ont été affecté par le type d’isolement techniques37. Notre étude a montré que la membrane MWCO RC de 100 kDa a fourni un rendement satisfaisant des dérivés BALF EV avec l’avantage des protéines indésirables beaucoup moins dans le compartiment de rétention en raison de la plus grande MWCO.

Cette étude a démontré que la taille et la distribution granulométrique des EVs de l’UFC étaient plus petits et plus homogènement distribués que celles des UC-DGC EVs. Agrégation de vésicules, qui est commune avec les techniques de l’UC, peut expliquer l’hétérogénéité de la dimension de l’UC-DGC EVs38. Nous avons évalué la pureté dérivés BALF EV en détectant les protéines de membrane EV TSG101 CD63, CD9 et CD81, qui confirme la présence d’exosomes dans le retentates. Nous et autres avons également utilisé TEM pour démontrer la morphologie de la SVE UFC35,39,40,41. Liu et al. utilisé une approche axée sur l’ultrafiltration similaire pour isoler le SVE et, comparativement aux EVs isolées par ultracentrifugation, les protéomique et transcriptomique profils étaient similaires31. Ainsi, les auteurs décrivent une méthode de centrifugation d’ultrafiltration à l’aide d’une membrane de cellulose régénérée avec un MWCO de 100 kDa comme une autre méthode d’isolement EV qui convient pour petits échantillons fluides biologiques tels que le liquide de lavage broncho-alvéolaire.

Les étapes critiques à l’aide de cette approche de l’UFC pour isoler le SVE de fluides biologiques incluent filtration initiale nanoporeux membrane 0,2 µm afin que les particules enrichis soient dans la gamme de taille d’exosomal et d’éviter d’appliquer une force additionnelle qui peut les dommages ou déformer l’exosome morphologie et des structures de10,42. EVs peuvent adhérer à la membrane de filtration, qui se traduit par une plus faible évolutivité. Par conséquent, le volume de l’échantillon ne doit pas dépasser la quantité recommandée pour chaque type d’unité de filtration. Nous avons choisi d’utiliser la cellulose régénérée, qui a fourni un rendement plus élevé d’ARNm du dérivé urine EVs18. Le type de membranes de filtration utilisé peut altérer le rendement de la récupération et le type du SVE. Enfin, même si un MWCO de 100 kDa devrait éliminer la plupart des protéines dans les liquides biologiques, certains contaminants de protéine qui étaient plus grands que 100 agrégats kDa ou protéine ont été observés à43. Dans ce cas, une étape de lavage est essentielle pour minimiser l’agrégation EV et en protéines. En outre, études fonctionnelles doivent être correctement contrôlées pour bien interpréter les résultats, comme non-EV-protéines associées aux sera présents à l’EVs de l’UFC.

Nous concluons que l’UFC est une autre approche qui est possible pour les EV d’isolation pour les échantillons de petit ou plus grand-volume. Les unités de microfiltre actuellement disponibles peuvent accueillir jusqu'à 15 mL d’échantillons.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Le travail est soutenu par les subventions NHLBI/NIH HL103868 (à C.P.) et HL137076 (à C.P.), l’American Heart Association subvention (à C.P.) et le Samuel Oschin complets Cancer Institute (SOCCI) Lung Cancer Research Award (à C.P.). Nous tenons à exprimer notre vive reconnaissance à l’Institut de cardiologie de Smidt au Cedars-Sinai Medical Center qui nous fournit une machine Nanosight pour EV NANOPARTICULE analyse de suivi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K Sigma-Millipore, St. Louis, MO UFC910024
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Corning Cellgro, Manassas, VA 21-031-CV
Sucrose Sigma-Millipore, St. Louis, MO EMD8550
HEPES Research Products International, Prospect, IL 75277-39-3
EDTA Corning Cellgro, Manassas, VA 46-034-CI
Sodium Chloride Sigma-Millipore, St. Louis, MO S3014-1KG
OptiPrep Sigma-Millipore, St. Louis, MO MKCD9753 Density Gradient Medium
Ketamine VetOne, Boise, ID 13985-702-10
Xylazine Akorn Animal Health, Lake Forest, IL 59399-110-20
Syringe 1 mL BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 309656
Angiocatheter 20 G BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 381703
Centrifuge tubes 15 mL VWR, Radnor, PA 89039-666
Centrifuge tubes 50 mL Corning Cellgro, Manassas, VA 430828
Bicinchonic acid (BCA) protein assay Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL 23235
Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody AbCam, Cambridge, MA AB125011
Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody Biolegend, San Diego, CA 143904
CD81
CD9
Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody Cell Signaling Technology, Danvers, MA 7074S
4x LDS
10x Reducing agent (Bolt)
10x Lysis buffer (Bolt) Cell Signaling Technology, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA NW04120
iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA IB23002
Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO Denville Scientific, Holliston, MA E2400
Ultracentrifuge tubes 17 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 337986
Ultracentrifuge tubes 38.5 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 326823
Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 09-754-13
Equipment
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany -
Ultracentrifuge Beckman Coulter, Pasadena, CA -
Nanosight (NS300) Malvern, Worcestershire, UK - To measure particle size distribution and particle concentration
MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany -
iBlot Transfer Apparatus Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA -
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System Bio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10 Analysis software

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Isolement des vésicules extracellulaires du murin lavage broncho-alvéolaire fluide à l’aide d’une Technique de Centrifugation de l’Ultrafiltration
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Parimon, T., Garrett III, N. E., Chen, P., Antes, T. J. Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique. J. Vis. Exp. (141), e58310, doi:10.3791/58310 (2018).More

Parimon, T., Garrett III, N. E., Chen, P., Antes, T. J. Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique. J. Vis. Exp. (141), e58310, doi:10.3791/58310 (2018).

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