Summary

Isolering av ekstracellulære blemmer fra Murine Bronchoalveolar Lavage – bruk en ultrafiltrasjon sentrifugering teknikk

Published: November 09, 2018
doi:

Summary

Her beskriver vi to ekstracellulære vesicle isolasjon protokoller, ultrafiltrasjon sentrifugering og ultracentrifugation med tetthet gradert sentrifugering, isolere ekstracellulære blemmer fra murine bronchoalveolar lavage prøver. De ekstracellulære blemmer avledet fra murine bronchoalveolar lavage væske av begge metodene er kvantifisert og preget.

Abstract

Ekstracellulære blemmer (EVs) er nyoppdagede subcellular komponenter som spiller viktige roller i mange biologiske signalering funksjoner under fysiologiske og patologiske tilstander. Isolasjon av EVs fortsetter å være en stor utfordring i dette feltet på grunn av begrensninger iboende til hver teknikk. Differensial ultracentrifugation tetthet gradert sentrifugering metode er en brukte tilnærming og anses å være gullstandarden prosedyren for EV isolasjon. Men denne prosedyren er tidkrevende, arbeidskrevende, og vanligvis resulterer i lav skalerbarhet, som ikke kanskje er egnet for små volumer prøver som bronchoalveolar lavage væske. Vi viser at en ultrafiltrasjon sentrifugering isolasjon metoden er enkel og tid – og arbeidskrevende effektiv ennå gir en høy grad av utvinning avkastning og renhet. Vi foreslår at denne isolasjon metoden kan være en alternativ tilnærming som passer for EV isolasjon, spesielt for små volumer biologiske prøver.

Introduction

Exosomes er den minste undergruppe av EVs, 50-200 nm i diameter, og har flere biologisk funksjoner på tvers av et variert utvalg av signalering prosesser,1,,2,,3,,4,,5. De styrer cellular og vev homeostase av lette intercellulære kommunikasjon gjennom Last molekyler som lipider, proteiner og nukleinsyrer6,7,8,9 . En kritisk trinn i EV forskning er en isolert prosess. Differensial ultracentrifugation (UC), med eller uten tetthet gradert sentrifugering (DGC), anses gullstandarden tilnærming, men denne metoden har store begrensninger, inkludert ineffektiv EV utvinningsgraden og lav skalerbarhet10 , 11 , 12, som begrenser dens beste utnyttelse til større volum utvalgene, for eksempel celle kultur supernatant eller høy exosome produksjon prøver. Fordeler og ulemper med andre metoder, som størrelse utelukkelse av ultrafiltrasjon eller Ture, immunoaffinity isolasjon av perler eller kolonner og microfluidics, er godt beskrevet og moderne supplerende prosedyrer har blitt utviklet til overvinne og minimere tekniske begrensninger i hver tilnærming11,12,13,14,15. Andre har vist at en ultrafiltrasjon sentrifugering (UFC) med en nanoporous membran i filter enheten er en alternativ teknikk som gir sammenlignbare renhet til en UC metoden16,17,18. Denne teknikken kan betraktes som én av metodene alternativ isolasjon.

Bronchoalveolar lavage væske (BALF) inneholder EVs som har mange biologiske funksjoner i ulike åndedrettsproblemer19,20,21,22. Studere BALF-avledet EVs innebærer noen utfordringer på grunn av invasiveness av bronkoskopi prosedyren mennesker, samt et begrenset antall lavage væske utvinning. I lite laboratorium dyr som mus, bare noen få ml kan gjenopprettes i normal tette forhold, selv mindre betent eller fibrotiske lungene23. Følgelig kan samle en tilstrekkelig mengde BALF EV isolering av en differensiell ultracentrifugation for nedstrøms programmer ikke være gjennomførbart. Men er isolere riktig EV populasjoner en avgjørende faktor for å studere EV biologiske funksjoner. Den skjøre balansen mellom effektivitet og effekt fortsetter å være en utfordring i veletablerte EV isolasjon metoder.

I denne nåværende studien viser vi at en sentrifugal ultrafiltrasjon tilnærming, utnytte en 100 kDa molekylvekt cut-off (MWCO) nanomembrane filter enhet, er egnet for små volumer biologiske prøven som BALF. Denne teknikken er enkel og effektiv, og gir høy renhetsgrad og skalerbarhet støtte studiet av BALF-avledet EVs.

Protocol

Utnyttelsen av dyr og alle dyr prosedyrer ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer (IACUC) på Cedars-Sinai Medical Center (CSMC). 1. murine Bronchoalveolar Lavage væske (BALF) innsamling og forberedelse BALF samling Euthanize mus med en cocktail av ketamin (300 mg/kg) og xylazine (30 mg/kg) via intraperitoneal-ruten etterfulgt av cervical forvridning. Sett inn en 22 G angiocatheter i luftrøret. Knytt en insulinsprøyte som inneholder 1 mL (mL…

Representative Results

Vi utførte EV isolert fra mus BALF bruke UFC og UC-DGC isolasjon på samme dag. Metoden UFC kreves ca 2,5-3 h, mens UC-DGC teknikken nødvendig 8t behandling tid. Dette inkluderte ikke buffere og reagens Forberedelsestid. Det bør bemerkes at noen andre oppgaver kan utføres i lang sentrifugering perioder. Likevel varte hele framgangsmåten nesten en hel dag for UC-DGC isolasjon teknikken. BALF-avledet EVs fra normal mus isoler…

Discussion

I de siste tiårene, har forskere unraveled betydninger av EVs i mobilnettet homeostase. Enda viktigere, spille EVs viktige roller i mange sykdom prosesser ved modulerende nærliggende og fjerne celler gjennom deres bioaktive Last molekyler1,21,22,26,27 , 28 , 29 , <sup class="xre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Arbeidet er støttet av NHLBI/NIH tilskudd HL103868 (for PC) og HL137076 (for PC), American Heart Association Grant-in-Aid (for PC) og Samuel Oschin omfattende Cancer Institute (SOCCI) lunge kreft forskning prisen (for PC). Vi ønsker å uttrykke vår stor takknemlighet til Smidt Heart Institute ved Cedars-Sinai Medical Center som gir oss en Nanosight maskin for EV hydrogenion sporing analyse.

Materials

Material
Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K Sigma-Millipore, St. Louis, MO UFC910024
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) Corning Cellgro, Manassas, VA 21-031-CV
Sucrose Sigma-Millipore, St. Louis, MO EMD8550
HEPES Research Products International, Prospect, IL 75277-39-3
EDTA Corning Cellgro, Manassas, VA 46-034-CI
Sodium Chloride Sigma-Millipore, St. Louis, MO S3014-1KG
OptiPrep Sigma-Millipore, St. Louis, MO MKCD9753 Density Gradient Medium
Ketamine VetOne, Boise, ID 13985-702-10
Xylazine Akorn Animal Health, Lake Forest, IL 59399-110-20
Syringe 1 mL BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 309656
Angiocatheter 20G BD Syringe, Franklin Lakes, NJ 381703
Centrifuge tubes 15 mL VWR, Radnor, PA 89039-666
Centrifuge tubes 50 mL Corning Cellgro, Manassas, VA 430828
Bicinchonic acid (BCA) protein assay Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL 23235
Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody AbCam, Cambridge, MA AB125011
Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody Biolegend, San Diego, CA 143904
CD81
CD9
Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody Cell Signaling Technology, Danvers, MA 7074S
4x LDS
10x Reducing agent (Bolt)
10x Lysis buffer (Bolt) Cell Signaling Technology, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA NW04120
iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA IB23002
Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO Denville Scientific, Holliston, MA E2400
Ultracentrifuge tubes 17 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 337986
Ultracentrifuge tubes 38.5 mL Beckman Coulter, Pasadena, CA 326823
Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 09-754-13
Equipment
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany
Ultracentrifuge Beckman Coulter, Pasadena, CA
Nanosight (NS300) Malvern, Worcestershire, UK To measure particle size distribution and particle concentration
MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany
iBlot Transfer Apparatus Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System Bio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10 Analysis software

References

  1. Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
  2. Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
  3. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  4. Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
  5. Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
  6. Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
  7. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  8. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
  9. Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
  10. Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
  11. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
  12. Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
  13. Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
  14. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  15. Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
  16. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).
  17. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).
  18. Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
  19. Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
  20. Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
  21. Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
  22. Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
  23. Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
  24. Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
  25. Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
  26. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
  27. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
  28. Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
  29. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
  30. Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
  31. Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
  32. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  33. Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
  34. Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).
  35. Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
  36. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
  37. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  38. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).
  39. Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277 (2016).
  40. Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
  41. Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS – Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
  42. Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).
  43. Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).

Play Video

Cite This Article
Parimon, T., Garrett III, N. E., Chen, P., Antes, T. J. Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid Using an Ultrafiltration Centrifugation Technique. J. Vis. Exp. (141), e58310, doi:10.3791/58310 (2018).

View Video