Isolering av ekstracellulære blemmer fra Murine Bronchoalveolar Lavage – bruk en ultrafiltrasjon sentrifugering teknikk
Summary
Her beskriver vi to ekstracellulære vesicle isolasjon protokoller, ultrafiltrasjon sentrifugering og ultracentrifugation med tetthet gradert sentrifugering, isolere ekstracellulære blemmer fra murine bronchoalveolar lavage prøver. De ekstracellulære blemmer avledet fra murine bronchoalveolar lavage væske av begge metodene er kvantifisert og preget.
Abstract
Ekstracellulære blemmer (EVs) er nyoppdagede subcellular komponenter som spiller viktige roller i mange biologiske signalering funksjoner under fysiologiske og patologiske tilstander. Isolasjon av EVs fortsetter å være en stor utfordring i dette feltet på grunn av begrensninger iboende til hver teknikk. Differensial ultracentrifugation tetthet gradert sentrifugering metode er en brukte tilnærming og anses å være gullstandarden prosedyren for EV isolasjon. Men denne prosedyren er tidkrevende, arbeidskrevende, og vanligvis resulterer i lav skalerbarhet, som ikke kanskje er egnet for små volumer prøver som bronchoalveolar lavage væske. Vi viser at en ultrafiltrasjon sentrifugering isolasjon metoden er enkel og tid – og arbeidskrevende effektiv ennå gir en høy grad av utvinning avkastning og renhet. Vi foreslår at denne isolasjon metoden kan være en alternativ tilnærming som passer for EV isolasjon, spesielt for små volumer biologiske prøver.
Introduction
Exosomes er den minste undergruppe av EVs, 50-200 nm i diameter, og har flere biologisk funksjoner på tvers av et variert utvalg av signalering prosesser,1,,2,,3,,4,,5. De styrer cellular og vev homeostase av lette intercellulære kommunikasjon gjennom Last molekyler som lipider, proteiner og nukleinsyrer6,7,8,9 . En kritisk trinn i EV forskning er en isolert prosess. Differensial ultracentrifugation (UC), med eller uten tetthet gradert sentrifugering (DGC), anses gullstandarden tilnærming, men denne metoden har store begrensninger, inkludert ineffektiv EV utvinningsgraden og lav skalerbarhet10 , 11 , 12, som begrenser dens beste utnyttelse til større volum utvalgene, for eksempel celle kultur supernatant eller høy exosome produksjon prøver. Fordeler og ulemper med andre metoder, som størrelse utelukkelse av ultrafiltrasjon eller Ture, immunoaffinity isolasjon av perler eller kolonner og microfluidics, er godt beskrevet og moderne supplerende prosedyrer har blitt utviklet til overvinne og minimere tekniske begrensninger i hver tilnærming11,12,13,14,15. Andre har vist at en ultrafiltrasjon sentrifugering (UFC) med en nanoporous membran i filter enheten er en alternativ teknikk som gir sammenlignbare renhet til en UC metoden16,17,18. Denne teknikken kan betraktes som én av metodene alternativ isolasjon.
Bronchoalveolar lavage væske (BALF) inneholder EVs som har mange biologiske funksjoner i ulike åndedrettsproblemer19,20,21,22. Studere BALF-avledet EVs innebærer noen utfordringer på grunn av invasiveness av bronkoskopi prosedyren mennesker, samt et begrenset antall lavage væske utvinning. I lite laboratorium dyr som mus, bare noen få ml kan gjenopprettes i normal tette forhold, selv mindre betent eller fibrotiske lungene23. Følgelig kan samle en tilstrekkelig mengde BALF EV isolering av en differensiell ultracentrifugation for nedstrøms programmer ikke være gjennomførbart. Men er isolere riktig EV populasjoner en avgjørende faktor for å studere EV biologiske funksjoner. Den skjøre balansen mellom effektivitet og effekt fortsetter å være en utfordring i veletablerte EV isolasjon metoder.
I denne nåværende studien viser vi at en sentrifugal ultrafiltrasjon tilnærming, utnytte en 100 kDa molekylvekt cut-off (MWCO) nanomembrane filter enhet, er egnet for små volumer biologiske prøven som BALF. Denne teknikken er enkel og effektiv, og gir høy renhetsgrad og skalerbarhet støtte studiet av BALF-avledet EVs.
Protocol
Representative Results
Discussion
I de siste tiårene, har forskere unraveled betydninger av EVs i mobilnettet homeostase. Enda viktigere, spille EVs viktige roller i mange sykdom prosesser ved modulerende nærliggende og fjerne celler gjennom deres bioaktive Last molekyler1,21,22,26,27 , 28 , 29 , <sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeidet er støttet av NHLBI/NIH tilskudd HL103868 (for PC) og HL137076 (for PC), American Heart Association Grant-in-Aid (for PC) og Samuel Oschin omfattende Cancer Institute (SOCCI) lunge kreft forskning prisen (for PC). Vi ønsker å uttrykke vår stor takknemlighet til Smidt Heart Institute ved Cedars-Sinai Medical Center som gir oss en Nanosight maskin for EV hydrogenion sporing analyse.
Materials
| Material | |||
| Amicon Ultra-15 centrifugal filters Ultracel-100K | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | UFC910024 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Corning Cellgro, Manassas, VA | 21-031-CV | |
| Sucrose | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | EMD8550 | |
| HEPES | Research Products International, Prospect, IL | 75277-39-3 | |
| EDTA | Corning Cellgro, Manassas, VA | 46-034-CI | |
| Sodium Chloride | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | S3014-1KG | |
| OptiPrep | Sigma-Millipore, St. Louis, MO | MKCD9753 | Density Gradient Medium |
| Ketamine | VetOne, Boise, ID | 13985-702-10 | |
| Xylazine | Akorn Animal Health, Lake Forest, IL | 59399-110-20 | |
| Syringe 1 mL | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 309656 | |
| Angiocatheter 20G | BD Syringe, Franklin Lakes, NJ | 381703 | |
| Centrifuge tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Corning Cellgro, Manassas, VA | 430828 | |
| Bicinchonic acid (BCA) protein assay | Pierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL | 23235 | |
| Rabbit anti-mouse TSG101 Antibody | AbCam, Cambridge, MA | AB125011 | |
| Rat anti-mouse PE-CD63 Antibody | Biolegend, San Diego, CA | 143904 | |
| CD81 | |||
| CD9 | |||
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | 7074S | |
| 4x LDS | |||
| 10x Reducing agent (Bolt) | |||
| 10x Lysis buffer (Bolt) | Cell Signaling Technology, Danvers, MA | ||
| Bolt 4-12% Bis-Tris Plus acrylamide gel | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | NW04120 | |
| iBlot 2 Nitrocellulose mini stacks | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | IB23002 | |
| Chemiluminescent HRP antibody detection reagent HyGLO | Denville Scientific, Holliston, MA | E2400 | |
| Ultracentrifuge tubes 17 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 337986 | |
| Ultracentrifuge tubes 38.5 mL | Beckman Coulter, Pasadena, CA | 326823 | |
| Corning SFCA Syringe Filters 0.2 µm pore | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 09-754-13 | |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | – | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter, Pasadena, CA | – | |
| Nanosight (NS300) | Malvern, Worcestershire, UK | – | To measure particle size distribution and particle concentration |
| MACSQuant Analyzer 10 flow cytometer | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany | – | |
| iBlot Transfer Apparatus | Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA | – | |
| Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad, Hercules, CA | ||
| FlowJo v. 10 | Analysis software |
References
- Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology. 2, 569-579 (2002).
- Kosaka, N., et al. Secretory Mechanisms and Intercellular Transfer of MicroRNAs in Living Cells. Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Fujita, Y., Kosaka, N., Araya, J., Kuwano, K., Ochiya, T. Extracellular vesicles in lung microenvironment and pathogenesis. Trends in Molecular Medicine. 21 (9), 533-542 (2015).
- Kalluri, R. The biology and function of exosomes in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).
- Janowska-Wieczorek, A., et al. Microvesicles derived from activated platelets induce metastasis and angiogenesis in lung cancer. International Journal of Cancer. 113 (5), 752-760 (2005).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, Secretion, and Intercellular Interactions of Exosomes and Other Extracellular Vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 255-289 (2014).
- Rocco, G. D., Baldari, S., Toietta, G. Exosomes and other extracellular vesicles-mediated microRNA delivery for cancer therapy. Translational Cancer Research. 6 (Supplement 8), S1321-S1330 (2017).
- Peterson, M. F., Otoc, N., Sethi, J. K., Gupta, A., Antes, T. J. Integrated systems for exosome investigation. Methods. 87 (1), 31-45 (2015).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. Journal of Clinical Investigation. 126, 1152-1162 (2016).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in Exosome Isolation Techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Willis, G. R., Kourembanas, S., Mitsialis, S. A. Toward Exosome-Based Therapeutics: Isolation, Heterogeneity, and Fit-for-Purpose Potency. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 20389 (2017).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 27031 (2015).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Kesimer, M., et al. Characterization of exosome-like vesicles released from human tracheobronchial ciliated epithelium: a possible role in innate defense. The FASEB Journal. 23 (6), 1858-1868 (2009).
- Torregrosa Paredes, P., et al. Bronchoalveolar lavage fluid exosomes contribute to cytokine and leukotriene production in allergic asthma. Allergy. 67 (7), 911-919 (2012).
- Alipoor, S. D., et al. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases. Mediators of Inflammation. 2016, 5628404 (2016).
- Hough, K. P., Chanda, D., Duncan, S. R., Thannickal, V. J., Deshane, J. S. Exosomes in Immunoregulation of Chronic Lung Diseases. Allergy. 72 (4), 534-544 (2017).
- Van Hoecke, L., Job, E. R., Saelens, X., Roose, K. Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration. Journal of Visualized Experiments. (123), e55398 (2017).
- Minciacchi, V. R., et al. MYC Mediates Large Oncosome-Induced Fibroblast Reprogramming in Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (9), 2306-2317 (2017).
- Koliha, N., et al. Melanoma Affects the Composition of Blood Cell-Derived Extracellular Vesicles. Frontiers in Immunology. 7, 581 (2016).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78 (9), 838-848 (2010).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, R125-R134 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutiérrez-Vázquez, C., Sánchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: Regulation of exosome loading. Seminars in Cancer Biology. 28, 3-13 (2014).
- Hoshino, A. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527, 329-335 (2015).
- Liu, F., et al. The Exosome Total Isolation Chip. ACS Nano. 11 (11), 10712-10723 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Zhao, Z., Yang, Y., Zeng, Y., He, M. A Microfluidic ExoSearch Chip for Multiplexed Exosome Detection Towards Blood-based Ovarian Cancer Diagnosis. Lab on a Chip. 16 (3), 489-496 (2016).
- Fang, S., et al. Clinical application of a microfluidic chip for immunocapture and quantification of circulating exosomes to assist breast cancer diagnosis and molecular classification. PloS ONE. 12 (4), e0175050 (2017).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal Physiology-Renal Physiology. 292 (5), F1657-F1661 (2007).
- Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674 (2018).
- Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6 (1), 329 (2016).
- Xiao, J., et al. Cardiac progenitor cell-derived exosomes prevent cardiomyocytes apoptosis through exosomal miR-21 by targeting PDCD4. Cell Death & Disease. 7 (6), e2277 (2016).
- Agarwal, U., et al. Experimental, Systems and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation Research. 120 (4), 701-712 (2017).
- Merchant, M. L., et al. Microfiltration isolation of human urinary exosomes for characterization by MS. PROTEOMICS – Clinical Applications. 4 (1), 84-96 (2010).
- Gouin, K., et al. A comprehensive method for identification of suitable reference genes in extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1347019 (2017).
- Betsuyaku, T., et al. Neutrophil Granule Proteins in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Subjects with Subclinical Emphysema. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (6), 1985-1991 (1999).
