Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Detektion og isolering af apoptotiske organer til høj renhed

doi: 10.3791/58317 Published: August 12, 2018

Summary

En arbejdsproces ved hjælp af flow flowcytometri eller differentiale centrifugering er udviklet til at registrere, kvantificere og isolere apoptotiske organer fra en apoptotiske prøve til høj renhed.

Abstract

Apoptotiske organer (ApoBDs), microvesicles og exosomes er de vigtigste medlemmer af familien ekstracellulære vesikel, med ApoBDs at være en af de største type. Det er blevet foreslået, at ApoBDs kan støtte celle clearance samt intercellulær kommunikation gennem menneskehandel biomolekyler. Konventionelle metoder anvendes til identifikation og dyrkning af ApoBDs er ofte begrænset af manglen på nøjagtig kvantificering og lave prøve renhed. Her beskriver vi en arbejdsgang for at bekræfte induktion af apoptose, validere ApoBD dannelse og isolere ApoBDs til høj renhed. Vi vil også redegøre for og sammenligne fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) og differentieret centrifugering baserede tilgange til at isolere ApoBDs. Derudover renheden af isolerede ApoBDs vil blive bekræftet ved hjælp af en tidligere etablere flow flowcytometri-baserede farvning og analysemetode. Taget sammen, ved hjælp af metoden beskrevet THP-1 monocyt apoptose og apoptotiske celle demontering blev induceret og valideret, og ApoBD genereres fra THP-1 monocytter blev isoleret til en renhed på 97-99%.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Apoptose, et godt undersøgt form af programmeret celledød, er forpligtet til at opretholde fysiologiske homeostase og fjerne potentielt skadelige celler i den menneskelige krop1. Efter induktion af apoptose, kan apoptotiske celler (ApoCells) underkastes en række morfologiske ændringer og adskille i lille membran-bundet vesikler betegnes ApoBDs. Samlet set denne proces er kendt som apoptotiske celle demontering og kan opdeles i 3 særskilte foranstaltninger baseret på morfologi2,3. Trin 1 (plasma membran blebbing) er karakteriseret ved dannelsen af ballon-lignende strukturer på cellens overflade kaldes blebs4,5. Trin 2 (apoptotiske fremspring dannelse) omfatter dannelsen af lange membran fremspring såsom apoptopodia, beaded apoptopodia og mikrotubulus pigge6,7,8. Endelig, trin 3 (ApoBD dannelse) omfatter fragmentering af de apoptotiske fremspring og/eller ApoCells til at generere ApoBDs6,9. Tidligere resultater har foreslået en rolle for ApoBDs i medvirken apoptotiske celle clearance og mægle intercellulær kommunikation. For eksempel foreslås det, at fragmenteringen af en ApoCell i ApoBDs kan generere små 'bite-sized' stykker, der let kunne fjernes ved at omgive fagocytter2,10,11. Derudover kan ApoBDs havnen en serie af biomolekyler DNA, RNA og proteiner, som kan være smugles til omkringliggende celler til at lette celle-celle kommunikation12,13,14. Til funktionelt undersøge disse processer, er det afgørende at bekræfte tre nøgleparametre, herunder a validering af apoptose induktion og ApoBD dannelse, (ii) isolation af ApoBDs, og (iii) bekræftelse af ApoBD renhed.

Tidligere har været brugt en række metoder, herunder flowcytometri og elektronmikroskopi at studere apoptose og ApoBDs15,16,17,18. ApoBD påvisning og kvantificering er dog ofte vanskelig eller overset. For eksempel, mest rutinemæssigt anvendes flow flowcytometri-baserede apoptose assay beskæftiger annexin V (A5, et protein, der binder de externalized ' spise-mig ' signal Phosphatidylserin (PtdSer)) og nukleinsyre pletten propidium Iodid (PI)19. Men ved hjælp af denne universelle pletten kombination, analyse forudsætter, at der er kun tre typer af celle subsets (levedygtige celler, ApoCells og nekrotiske celler) i prøven. Desuden, selvom betragtes som "guld standard" af mange forskere for apoptose, flowcytometri undersøgelser og efterfølgende dataanalyse udelukker ofte ApoBDs gennem en indledende gating skridt at vælge FSC/SSCintermediate-høj begivenheder. Derfor, vi har for nylig udviklet en roman flow flowcytometri assay bruger A5 og til-PRO-3, en anden nukleinsyre plet, der selektivt kan tages op af caspase 3/7-aktiveret pannexin 1 (PANX1) kanaler7,20. Som caspase 3-induceret PANX1 aktivering forud PtdSer eksponering på det tidlige stadium af apoptose, pletter til-PRO-3 varierende apoptotiske og nekrotiske celler. Denne indfaldsvinkel kombineret med vores roman, gating strategi indeholder desuden alle erhvervede begivenheder under dataanalyse og som følge heraf seks celle/partikel delmængder er identificeret, herunder: (i) levedygtige celler (FSC/SSCmellemliggende/høj, A5lav , Til-PRO-3lav), (ii) A5- tidlig ApoCells (FSC/SSCmellemliggende/høj, A5lav, til-PRO-3mellemliggende), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCmellemliggende/høj, A5høj , Til-PRO-3mellemliggende), (iv) nekrotiske celler eller sene ApoCells (FSC/SSCmellemliggende/høj, A5højt, til-PRO-3høje), (v) ApoBDs (FSC/SSClav, A5mellemliggende, til-PRO-3lav / mellemliggende), og (vi) vragrester (FSC/SSClav, A5lav, til-PRO-3lav)20. Vores tilgang understreger vigtigheden af at analysere alle celler/partikel delmængder og endnu vigtigere, adskillelsen af ApoBDs fra celler og debris20. Således, denne tilgang viser en effektiv teknik for at validere induktion af apoptose og ApoBD dannelse samtidigt.

ApoBDs har traditionelt været isoleret gennem en række differentierede centrifugering tilgange hvorved ApoBDs kan adskilles fra celler eller andre ekstracellulære vesikler baseret på tæthed. Men sådanne centrifugering metoder er ofte begrænset af lav ApoBD renhed, manglen på en kvantificering trin at bekræfte prøve renhed, og/eller manglende evne til at adskille celle typespecifikke ApoBDs17,21,22. Derfor, vi for nylig udviklet to tilgange, en FACS-baseret og en ny differentieret centrifugering-baseret tilgang, som kan kobles til vores tidligere etablerede flow flowcytometri metode til validering af induktion af apoptose og prøve renhed23. ApoBD isolation via vores FACS-baserede tilgang kan berige ApoBDs til op til 99% renhed, og kan være kombineret med en bred vifte af celle type-specifikke antistoffer til at isolere ApoBDs fra blandet cellepopulationer, vævsprøver og kropsvæsker23. Desuden vores reviderede differential centrifugering tilgang viser en effektiv metode til at isolere ApoBDs til > 90% renhed23.

I dette papir beskriver vi i detaljer vores forsøgsmetoden at validere apoptose induktion, og for at påvise og bestemme ApoBD dannelse. ApoBD isolation arbejdsprocesser ved hjælp af FACS-baseret og differentieret centrifugering-baserede metoder er også udarbejdet og sammenlignet. De repræsentative data viser, at den beskrevne metode giver en effektiv banebrydende værktøj til fremtidige ApoBD undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. induktion af apoptose

  1. Centrifuge celle stikprøve på 300 x g til 5 min og Fjern supernatanten til at fjerne en eksisterende celle debris.
    Bemærk: Når du bruger vedhængende celler, frø celler på forhånd og vask med 1 x fosfatbufferet løsning (PBS) før apoptose induktion.
  2. Bestemme celle nummer og indsamle celler.
    Bemærk: Afhængigt af analysen efter isoleringen anbefaler vi et startnummer celle af mindst 1 x 107 celler.
  3. Resuspend i komplet media (respektive medium indeholder 10% (vol/vol) føtalt kalveserum, 50 IE/mL penicillin, 50 µg/mL streptomycin blanding) til en endelig koncentration på 1 x 106 celler/mL.
  4. Alikvot ~ 2 x 106 celler pr. brønd af et 6 godt plade.
  5. For at inducere apoptose, fjerne pladen låget og bestråle cellerne på 150 mJ/cm2 bruger en UV irradiator. Dette bør tage ca. 30-60 s.
    Bemærk: Før bestråling, sikre, at ~0.5 x 106 celler opbevares for 'Untreated' celle kontrol.
    Bemærk: Apoptose kan også være fremkaldt via andre metoder såsom anti-Fas eller serum sult6.
  6. Der inkuberes ved 37° C, 5% CO2 for 2-8 timer, afhængigt af cellelinie.
  7. Ved hjælp af en bænk top lysmikroskop, visualisere celler for at bekræfte tilstedeværelsen af apoptotiske morfologier, såsom blebbing, apoptopodia dannelse og ApoBD dannelse.
    Bemærk: 40 X forstørrelse er tilstrækkelig
  8. Bruger en P1000 pipette, afpipetteres og indsamle apoptotiske prøver.
  9. Vaske plade med 1 x PBS og kombinere med resterende prøve at sikre maksimalt udbytte.
  10. Indsamle ~1/10th for den 'hele apoptotiske prøve «(WAS) kontrol.
  11. Indsamle de 'Ubehandlet' prøve.
  12. Der centrifugeres både var og Untreated prøver på 3.000 x g for 6 min.
  13. Resuspend i 1 mL PBS, 1 x og der er afsat på is.
  14. For ApoBD isolation, fortsætte til trin 2 eller 3 med den resterende apoptotiske prøve.

2. ApoBD Isolation via FACS

  1. Der centrifugeres hele prøven på 3.000 x g for 6 min.
  2. Fjerne fleste af supernatanten uden at forstyrre pelleten.
  3. Resuspend i en Farvningsopløsningen indeholdende 1 mL af 1 x A5 binding buffer, 75 µL af A5-FITC og 2 µL af til-PRO-3 pr. 1 x 107 celler.
  4. Inkuber prøven i mørke ved stuetemperatur i 10 min.
  5. Tilføje 1-2 mL af 1 x A5 binding buffer og centrifugeres prøve på 3.000 x g for 6 min at fjerne overskydende pletten.
    Bemærk: For blandet cellepopulationer eller vævsprøver, udføre et antistof farvning trin ved hjælp af en kombination af celle type-specifikke markører i 1 x A5 binding buffer og Ruger på isen i 20 min. (eller som pr fabrikantens protokol) inden centrifugering ved 3.000 x g for 6 min.
  6. Resuspend prøve pellet i 3 mL af FACS buffer (1 x PBS, 1 x A5 binding buffer, 10% FSC, 2 mM EDTA) pr. 1 x 107 celler.
  7. Filtreres gennem et 70 µm celle si i en runde-bunden, polypropylen (flowcytometri) rør og holde prøver på is og i mørke.
  8. Tænd FACS maskine og udføre standard sæt op ved hjælp af en 100 µm dyse, udføre drop forsinkelse, og sikre en stabil strøm.
  9. Indlæse prøven og indstille erhvervelse hastighed til ~ 1000 begivenheder/s.
  10. Justere FSC, VSK, APC (til-PRO-3) og FITC (A5) spændinger og holdning begivenheder inden for FACS parceller at sikre befolkningsgrupper kan adskilles klart.
  11. Optage 20.000 begivenheder.
  12. Oprette en gating strategi som i del 4.
  13. Tilføj den endelige ApoBD gate som den ønskede sorterings befolkning i layoutet form.
  14. Begynde at erhverve prøven og udføre en test form ved at samle 5.000-10.000 ApoBDs i en ny tube, som indeholder ~ 250 µL FACS buffer.
  15. Udføre en system tilbage flush og indlæse sorterede ApoBDs.
  16. Erhverve og optage test-slags ApoBDs.
  17. Kontroller, at ApoBD renhed er ~ 99% ved at sammenligne FSC (y-aksen) vs A5 (x-aksen begivenheder).
    Bemærk: A5 farvning kan reducere lidt når re analysere prøver på grund af laser blegning.
  18. Når høj renhed er opnået, indlæse oprindelige prøve og fortsætte sortering indtil det ønskede antal ApoBDs er opnået.
    Bemærk: Hvis det er nødvendigt, dobbelt sortering kan udføres for at samtidig isolere ApoCells og ApoBDs.
    Bemærk: Når sortering over en lang periode, anbefaler vi, inkubere collection tube ved 4 ° C.
  19. Når sortering er komplet, indsamle en lille del af post form ApoBDs, post sortere ApoCells, Untreated, og var til at validere apoptose og bekræfte efter sortering renhed.
    Bemærk: Selv om test-form og efter sortering renhed ikke bør afviger væsentligt, er dette baseret på stream indstillinger og stabilitet.

3. ApoBD Isolation via differentieret centrifugering

  1. Der centrifugeres resterende apoptotiske stikprøven på 300 x g i 10 min.
  2. Indsamle supernatanten, forlader ~ 500 µL for at undgå at forstyrre pelleten celle og tilføje ind i en ny 15 mL konisk rør.
  3. Fjern de resterende 500 µL og resuspenderes celle i 2 mL 1 x PBS (dette repræsenterer 'ApoCell-beriget brøkdel'.
  4. Der centrifugeres indsamlede supernatanten i 20 min. på 3.000 g.
  5. Kontrollere, om en pellet og fjern forsigtigt supernatanten (supernatanten kan indeholde små ekstracellulære vesikler herunder microvesicles og exosomes).
  6. Resuspenderes i 1 mL af 1 x PBS (dette repræsenterer ApoBD beriget brøkdel)
  7. Indsamle 100 µL af hver Viable, WAS, ApoCell-beriget, og ApoBD-beriget prøver i en ny runde-bottom, polystyren (flowcytometri) tube.
  8. Tilsæt 100 µL af pletten indeholdende 2 x A5 binding buffer, 1: 100 A5-FITC, og 1:1,000 til-PRO-3
  9. Inkuber ved stuetemperatur i 10 min. i mørke.
  10. Analysere prøver ved flowcytometri, bruger den gating strategi som beskrevet ovenfor hen til efterprøve den succesfulde induktion af apoptose og renhed af den ApoBD-beriget fraktion.

4. flowcytometri Gating strategi

  1. Plot til-PRO-3 (y-aksen) mod FSC (x-aksen) til at adskille nekrotiske celler (til-PRO-3høje) fra alle andre ikke-permeabilized begivenheder (til-PRO-3lav/mellemliggende).
  2. Vælg alle ikke-permeabilized begivenheder og plot SSC mod A5. Gate to populationer herunder befolkning 1 (P1), SSCmellemliggende/høj, A5lav/mellemliggende celler og befolkning 2 (P2), alle andre begivenheder.
  3. P2, plot til-PRO-3 mod A5 og vælg A5mellemliggende/høj begivenheder at udelukke alle celle debris.
  4. Vælg alle A5 positive begivenheder og plot FSC mod A5. Separate ApoBDs (FSClav) fra ApoCells (FSCmellemliggende/høj).
    Bemærk: Når gating ApoBDs for ApoBD isolation via den FACS-baseret tilgang, anbefaler vi et sidste skridt ved at vælge ApoBDs og sammenligne til-PRO-3 til A5 og vælge alle arrangementer. Dette sikrer, at den endelige sortering gate bruger fluorescens snarere end FSC/SSC parametre.
  5. For levedygtige celle analyse, Vælg P1 og udfører en af to gating strategier. For generelle levedygtige celle analyse, plot FSC mod A5 og vælg alle FSCmellemliggende/høj celler, derfor fjerner resterende celle debris. Alternativt, for dybdegående analyse, levedygtige celler kan være adskilt fra A5- tidlig ApoCells af plotte til-PRO-3 mod FSC. Vælg til-PRO-3lav, FSCmellemliggende/høj levedygtige celler og til-PRO-3mellemliggende, FSCmellemliggende/høj A5- tidlig ApoCells.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ved hjælp af den procedure, der er skitseret her, THP-1 monocyt apoptose var induceret og ApoBDs blev opdaget og isoleret via enten et FACS-baseret eller en differentieret centrifugering tilgang (figur 1). For det første, apoptose var fremkaldt af UV-bestråling og blev prøverne indsamlet efter 2-3 h inkubation når celler udstillet apoptotiske morfologier, herunder blebbing, apoptotiske membran fremspring dannelse og generation af ApoBDs6. En til-PRO-3 og A5-baserede flow flowcytometri metode blev brugt til at bekræfte induktion af monocyt apoptose og ApoBD dannelse ved at adskille levedygtige celler, nekrotiske celler, tidlig ApoCells, ApoCells, ApoBDs og snavs (figur 2). Tilsammen, flow flowcytometri analyse viste, at UV-behandling resulterer i ~ 20% ApoCells (figur 3).

THP-1 monocyt ApoBDs blev derefter isoleret fra WAS via to tilgange. For det første prøver var forberedt på en høj renhed FACS-tilgang, hvor kun en enkelt centrifugering skridt er forpligtet til at pille hele apoptotiske prøven før farvning og FACS. Denne metode er velegnet til funktionelle assays, hvornår betydeligt høj sample renhed er påkrævet (f.eks. til qPCR analyse), når et bestemt antal ApoBDs er påkrævet, eller når erhverve celle typespecifikke ApoBDs fra en kompleks prøve. Brug denne metode, blev ApoBDs isoleret til ~ 99% renhed (figur 4).

Næste, THP-1 monocyt ApoBDs blev også isoleret via en to-trins, differential centrifugering tilgang. Det første trin omfatter isolering af levedygtige celler, ApoCells og nekrotiske celler. Det andet skridt omfatter adskillelse af større ApoBDs fra lille ekstracellulære vesikler såsom microvesicles og exosomes, som er afskåret fra være pelleted på 3.000 x g. flowcytometri blev derefter udført for at bekræfte apoptose induktion og ApoBD prøven renhed og påvist en ApoBD-beriget prøve indeholdende ~ 97% ApoBDs (figur 4). Dette giver en hurtig og effektiv teknik til at isolere ApoBD til relativt høj renhed og er passende, når rensende ApoBDs fra prøver, der indeholder en enkelt celletype.

Figure 1
Figur 1 . Skematisk diagram over ApoBD isolation via enten et FACS-baseret eller differentieret centrifugering tilgang. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Flow flowcytometri gating strategi. Seks celle/partikel delmængder (herunder levedygtige celler, A5- tidlig ApoCells, A5+ ApoCells, nekrotiske celler, ApoBDs og små klippestykker) blev identificeret og bruges til at vælge ApoBD for FACS-baserede isolering. (a) membran permeabilised nekrotiske celler er adskilt fra ikke-permeabilised begivenheder. (b) A5lav-intermediate, SSClav-høj celler adskilles fra A5lav-høj begivenheder. (b.i) For dybtgående analyse, til-POR-3lav levedygtige celler kan være adskilt fra til-PRO-3mellemliggende A5- tidlig ApoCells. (b.ii) Alternativt, når blot beregne ApoBD renhed, levedygtige celler kan være adskilt fra FSClav begivenheder. (c) A5lav vragrester er udelukket. (d) FSCmellemliggende/høj ApoCells er adskilt fra FSClav ApoBDs. (e) alle A5-til-PRO-3øvet/høj ApoBDs er valgt for sortering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 3
Figur 3 . Validering af THP-1 monocyt apoptose. Flow flowcytometri analyse af ubehandlet eller UV-bestråling THP-1 monocytter blev udført for at bestemme niveauet af levedygtige celler, A5- tidlig ApoCells, A5+ ApoCells, og nekrotiske celler.

Figure 4
Figur 4 . Rensning af THP-1 monocyt-afledte ApoBDs. Flow flowcytometri analyse blev udført på isolerede THP-1 monocyt-afledte ApoBDs via enten et FACS-baseret eller differentieret centrifugering baseret tilgang, viser berigelse af ApoBDs fra levedygtige celler, ApoCells og nekrotiske celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Siden sin tidlige beskrivelse i 1950 ' erne, har feltet af apoptose avancerede markant, at blive en fremtrædende forskningsområde. På trods af bred interesse og omfattende indsats, visse aspekter af apoptose, især dannelsen af ApoBDs, ikke er blevet godt undersøgt på grund af manglende egnede metoder. Disse vil navnlig omfatte begrænsning i sporing apoptose progression og ApoBD dannelse samtidigt ved hjælp af den traditionelle flowcytometri A5/PI analyse og urenheder i ApoBD isolation. Vi har for nylig udviklet metoder til at afhjælpe disse metodologiske mangler.

Vores nye flow flowcytometri-baserede analytiske tilgang tillader ApoBDs, som ofte ignoreret ved hjælp af traditionelle analysemetoder, skal påvises og kvantificeres20. Hertil kommer, ændrede dette flow flowcytometri metode med brug af pletten til-PRO-3, afslører en yderligere A5- apoptotiske tidligt, dermed rendering bedre afgrænsning af apoptose progression20. Konventionelt, ApoBD opdagelse har påberåbt sig stærkt image-baserede teknikker såsom Konfokal mikroskopi og histologi, der henviser til, at vores flow flowcytometri metode giver en høj overførselshastighed tilgang for at kvantificere ApoBD dannelse. Selvom tilsyneladende komplekse, proceduren er relativt nemt og kræver kun kommercielt tilgængelige reagenser og en grundlæggende flow Flowcytometret. Logiske påvisning og præcis kvantificering af ApoBDs ønsker yderligere viden om apoptotiske celle mikromiljø at dikterer celle clearance og immunologiske reaktioner. I virkeligheden ved at koble heri beskrevne flow flowcytometri metode med organelle-specifikke pletter, har vi for nylig rapporteret heterogen fordeling af cellulære indholdet i ApoBDs24. Disse resultater tyder på, at ApoBDs kan inddeles i forskellige delmængder og hver ApoBD delmængde kan udvise forskellige funktioner.

Vores nyligt udviklede ApoBD isolation teknikker vil også bidrage til fremskridt inden for ekstracellulære vesikler. Traditionelt, kan differential centrifugering metoder anvendes til ApoBD isolation indeholde en betydelig mængde af mindre celler, som kan påvirke downstream funktionelle assays. Men vores ændrede differential centrifugering tilgang kan bruges til at isolere ApoBDs til 97% renhed. Selv om høj renhed kan opnås ved differentieret centrifugering, kan sådan metode ikke være egnet til at isolere ApoBDs fra komplekse prøver. I modsætning hertil vores FACS-baseret metode kan berige ApoBDs til 99% renhed, og er baseret på de unikke biologiske kendetegn ApoBDs herunder partikelstørrelse, granulering og PtdSer eksponering, stedet for at stole udelukkende på partikel tæthed. Denne tilgang har også potentiale til at identificere og isolere ApoBDs af forskellige celle oprindelse ved hjælp af celle type-specifikke markører24samtidig. Trods en langvarig FACS procedure, som kan tage 1-8 h afhængigt af mængden af ApoBDs kræves, ville nøjagtig ApoBD isolation og efterfølgende downstream analyse tillade direkte tildeling af de molekylære karakteristika og funktionelle roller for ApoBDs. For sådanne metoder er det kritisk at ApoBD isolation tilgange er kombineret med teknikker som flowcytometri (som beskrevet her) for at validere både induktion af apoptose og renhed i eksemplet ApoBD-beriget. Desuden er ordentlig FACS oprettet afgørende for ApoBD isolation via FACS-baseret tilgang, som kan resultere i en ustabil stream eller forkert udført drop forsinkelse i lav renhed.

Kollektivt, har vi skitseret banebrydende metoder til kvantificering af apoptose induktion, ApoBD detektering og isolering af meget rene ApoBDs. Vores tilgang kan give et nyt værktøj til at studere den apoptotiske celle demontering proces og belyse rollen i denne proces i sygdom indstillinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Det fungerede blev støttet af tilskud fra National sundhed og Medical Research Council (GNT1125033 og GNT1140187) og australske Forskningsråd (DP170103790) til I.K.H.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) ATCC -
RPMI 1640 medium Life Technologies 22400-089
Penicillin-streptomycin mixture Life Technologies 15140122
FSC Gibco 10099-141
1x PBS - -
Annexin V FITC BD Bioscience -
TO-PRO-3 iodide Life Technologies T3605 TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact.
10x Annexin V binding buffer BD Bioscience 556454
EDTA Sigma-Aldrich 1001710526
Centrifuge tube (15 mL) Cellstar 188271
Microcentrifuge tube (1.5 mL) Sarstedt 72.690.001
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) - -
Centrifuge Beckman Coulter 392932
FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection BD Bioscience -
FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection BD Bioscience -
FACS Diva 6.1.1 software BD Bioscience -
FlowJo 8.8.6 software - -
 UV Stratalinker 1800 Stratagene -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
  2. Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
  3. Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
  4. Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
  5. Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
  6. Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
  7. Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
  8. Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
  9. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
  10. Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
  11. Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
  12. Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
  13. Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
  14. Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
  15. Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
  16. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
  17. Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  18. Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
  19. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
  20. Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
  21. Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
  22. Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
  23. Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
  24. Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).
Detektion og isolering af apoptotiske organer til høj renhed
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phan, T. K., Poon, I. K., Atkin-Smith, G. K. Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity. J. Vis. Exp. (138), e58317, doi:10.3791/58317 (2018).More

Phan, T. K., Poon, I. K., Atkin-Smith, G. K. Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity. J. Vis. Exp. (138), e58317, doi:10.3791/58317 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter