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Biochemistry

Détection et isolement des corps apoptotiques de haute pureté

doi: 10.3791/58317 Published: August 12, 2018

Summary

Un flux de travail par écoulement cytometry ou prime de centrifugation est conçu pour détecter, quantifier et isoler les corps apoptotiques d’un échantillon d’apoptotic à haute pureté.

Abstract

Corps apoptotiques (ApoBDs), les microvésicules et les exosomes sont les principaux membres de la famille de vésicule extracellulaire, avec ApoBDs étant un des plus grand type. Il a été proposé que les ApoBDs peuvent aider clairance cellulaire ainsi que communication intercellulaire via trafic biomolécules. Les approches conventionnelles utilisées pour l’identification et l’isolement des ApoBDs sont souvent limités par l’absence de quantification précise et pureté de l’échantillon faible. Nous décrivons ici un flux de travail pour confirmer l’induction de l’apoptose, valider la formation ApoBD et isoler ApoBDs à haute pureté. Aussi nous décrire et comparer cellule activée par fluorescence triant (FACS) et les approches de centrifugation différentielle basée à isoler ApoBDs. En outre, la pureté des ApoBDs isolées sera confirmée en utilisant un préalablement établir écoulement cytometry-base coloration et méthode d’analyse. Pris ensemble, à l’aide de l’approche décrite, THP-1 monocyte apoptose et apoptose cellulaire démontage a été induite et validé, et ApoBD provenant des monocytes THP-1 ont été isolés à une pureté de 97 à 99 %.

Introduction

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L’apoptose, une forme de mort cellulaire programmée, bien étudiée est nécessaire pour maintenir l’homéostasie physiologique et éliminer les cellules potentiellement nocifs dans le corps humain1. Après l’induction de l’apoptose, cellules apoptotiques (ApoCells) peuvent subir une série de changements morphologiques et démonter dans petites vésicules membranaires appelées ApoBDs. Dans l’ensemble, ce processus est connu comme le démontage de cellules apoptotiques et peut être divisé en 3 étapes distinctes, basées sur la morphologie2,3. Étape 1 (membrane plasmique blebbing) se caractérise par la formation de structures ressemblant à des ballons sur la surface des cellules appelées bulles4,5. Étape 2 (formation de protrusion apoptotiques) comprend la formation de protrusions membranaires longue comme apoptopodia, apoptopodia-perles et microtubules pointes6,7,8. Enfin, étape 3 (formation ApoBD) comprend la fragmentation des protubérances apoptotic et/ou ApoCells pour générer ApoBDs6,9. Résultats antérieurs ont suggéré un rôle de ApoBDs en facilitant le dégagement de cellules apoptotiques et médiation communication intercellulaire. Par exemple, il est proposé que la fragmentation d’un ApoCell en ApoBDs peut produire des petits morceaux de « petits » qui pourrait être facilement enlevés en entourant les phagocytes2,10,11. En outre, ApoBDs pourrait contenir une série de molécules comme l’ADN, l’ARN et des protéines qui peuvent être victimes de la traite aux cellules environnantes afin de faciliter la communication de cellule-cellule12,13,14. Pour fonctionnellement étudier ces processus, il est essentiel de confirmer trois paramètres clés, y compris (i) la validation d’induction de l’apoptose et de la formation de ApoBD, (ii) l’isolement du ApoBDs et (iii) la confirmation de la pureté de la ApoBD.

Auparavant, un certain nombre de méthodes, y compris cytométrie de flux et de microscopie électronique ont été utilisé pour étudier l’apoptose et ApoBDs15,16,17,18. Cependant, ApoBD détection et quantification sont souvent difficiles, voire négligé. Par exemple, l’apoptose plus couramment utilisé d’axée sur la cytométrie en flux dosage emploie annexine V (A5, une protéine qui se lie l’externalisés ' manger-me' signal phosphatidylsérine (PtdSer)) et l’acide nucléique stain (PI) de l’iodure de propidium19. Cependant, en utilisant cette combinaison universelle tache, analyse suppose qu’il y a seulement trois types de sous-ensembles de cellules (cellules viables, ApoCells et cellules nécrosées) dans l’échantillon. En outre, bien que considéré comme « un étalon-or » par de nombreux chercheurs de l’apoptose, des analyses de cytométrie en flux et l’analyse ultérieure des données exclut souvent ApoBDs par une première étape de blocage en sélectionnant les événementsintermédiaires-haute FSC/SSC. Par conséquent, nous avons récemment mis au point un essai de cytométrie en flux roman A5 et TO-PRO-3, une autre tache d’acides nucléique qui peut être sélectivement absorbé par la caspase 3/7-activé pannexine 1 (PANX1) canaux7,20. Comme les caspases induite par 3 PANX1 activation précède PtdSer exposition aux premiers stades de l’apoptose, TO-PRO-3 taches différentiellement apoptotiques et nécrotiques cellules. En outre, cette approche combinée avec notre roman gating stratégie inclut des événements tout acquis au cours de l’analyse des données et ainsi, six des sous-ensembles de cellule/particule sont identifiés, notamment : (i) des cellules viables (FSC/SSCintermédiaire/haut, A5faible , TO-PRO-3faible), (ii) A5 ApoCells précoce (FSC/SSCintermédiaire/haut, A5basse, TO-PRO-3intermédiaire), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCintermédiaire/haut, A5haute , TO-PRO-3intermédiaires), les cellules nécrotiques (iv) ou ApoCells fin (FSC/SSCintermédiaire/haut, A5haute, TO-PRO-3élevé), (v) ApoBDs (FSC/SSCfaible, A5intermédiaire, TO-PRO-3faible / intermédiaires) et (vi) débris (FSC/SSCfaible, A5basse, TO-PRO-3bas)20. Notre approche met l’accent sur l’importance d’analyser tous les sous-ensembles de cellules/particules et, plus important encore, la séparation des ApoBDs des cellules et des débris de20. Ainsi, cette approche montre une technique efficace pour valider l’induction de l’apoptose et ApoBD formation en même temps.

Traditionnellement, les ApoBDs ont été isolés par le biais de diverses méthodes de centrifugation différentielle par laquelle ApoBDs peut être séparé de cellules ou d’autres vésicules extracellulaires basés sur la densité. Cependant, ces méthodes de centrifugation sont souvent limités par la pureté de la ApoBD faible, absence d’une étape de quantification pour confirmer la pureté de l’échantillon, et/ou incapacité à séparer les cellules spécifiques au type ApoBDs17,21,22. Par conséquent, nous avons récemment développé deux approches, une base de FACS et une nouvelle approche axée sur la centrifugation différentielle peut être couplée à notre méthode de cytométrie en flux précédemment établie pour valider l’induction de l’apoptose et échantillon de pureté23. ApoBD isolation grâce à notre approche axée sur les FACS peut enrichir ApoBDs jusqu'à 99 % de pureté et peut être couplée avec une variété d’anticorps spécifiques à un type cellulaire à isoler ApoBDs des populations de cellules mixtes, les échantillons de tissus et les fluides corporels,23. En outre, notre approche révisée de centrifugation différentielle démontre une méthode efficace pour isoler ApoBDs à > 90 % pureté23.

Dans cet article, nous décrivons en détail notre procédure expérimentale afin de valider l’induction de l’apoptose et détecter et quantifier la formation ApoBD. Les flux de travail de ApoBD d’isolation à l’aide de méthodes centrifugation différentielles et axés sur les FACS est également élaborés et comparés. Les données représentatives démontrent que la méthodologie décrite fournit un outil de pointe efficace pour de futures études de ApoBD.

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Protocol

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1. l’induction de l’apoptose

  1. Centrifuger les échantillons de cellules à 300 g pendant 5 min et jeter le surnageant pour enlever les débris de cellules préexistantes.
    Remarque : Lorsque vous utilisez les cellules adhérentes, cellules des graines à l’avance et laver avec 1 x solution tamponnée au phosphate (PBS) avant l’induction de l’apoptose.
  2. Déterminer le nombre de cellules et de prélever des cellules.
    Remarque : Selon l’isolement après test, nous recommandons un numéro de cellulaire de départ d’au moins 1 x 107 cellules.
  3. Resuspendre dans les médias (respectif milieu contenant du sérum de veau foetal de 10 % (vol/vol), 50 UI/mL de pénicilline, 50 µg/mL de mélange de streptomycine) pour une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL.
  4. Aliquote ~ 2 x 106 cellules / puits d’une plaque 6 puits.
  5. Pour induire l’apoptose, retirez le couvercle de la plaque et irradier les cellules à 150 mJ/cm2 , à l’aide d’un irradiateur UV. Cela devrait prendre environ 30-60 s.
    Remarque : Avant l’irradiation, assurez-vous que ~0.5 x 106 cellules sont conservées pour le contrôle de cellule « Broussaille ».
    Remarque : L’apoptose peut également être induite via d’autres méthodes telles qu’anti-SAF ou sérum famine6.
  6. Incuber à 37° C, 5 % de CO2 pour 2 à 8 heures, selon la lignée cellulaire.
  7. À l’aide d’un microscope optique haut banc, visualiser les cellules afin de confirmer la présence d’apoptose morphologies, telles que blebbing et apoptopodia formation ApoBD formation.
    Remarque : 40 X grossissement est suffisant
  8. À l’aide d’une pipette P1000, pipette et prélever des échantillons de l’apoptose.
  9. Laver la plaque avec du PBS 1 x et se combinent avec l’échantillon restant afin d’assurer un rendement maximal.
  10. Frais virés ~1/10th pour « Tout Apoptotic l’échantillon » (de Windows WAS) contrôler.
  11. Recueillir l’échantillon « Non traitée ».
  12. Centrifuger les échantillons WAS tant broussaille à 3 000 x g pendant 6 min.
  13. Remettre en suspension dans 1 mL de PBS 1 x et mis de côté sur la glace.
  14. Pour ApoBD isolement, continuent à chaque étape 2 ou 3 avec l’échantillon restant d’apoptotic.

2. ApoBD Isolation via FACS

  1. Centrifuger l’ensemble de l’échantillon à 3 000 x g pendant 6 min.
  2. Enlever la majorité du liquide surnageant sans déranger le culot.
  3. Remettre en suspension dans une solution colorante contenant 1 mL de tampon de liaison x A5 1, 75 µL de A5-FITC et 2 µL de TO-PRO-3 par 1 x 107 cellules.
  4. Incuber les échantillons dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 min.
  5. Ajouter 1 à 2 mL de tampon de liaison 1 x A5 et centrifuger échantillon à 3 000 x g pendant 6 min enlever tache excédentaire.
    Remarque : Pour les populations de cellules mixtes ou des échantillons de tissus, effectuer un anticorps coloration étape en utilisant une combinaison de marqueurs spécifiques à un type de cellule dans 1 tampon de liaison x A5 et incuber sur la glace pendant 20 min (ou selon le protocole du fabricant) avant la centrifugation à 3 000 x g pendant 6 min.
  6. Resuspendre le culot d’échantillon dans 3 mL de tampon de FACS (PBS 1 x, 1 tampon de liaison x A5, 10 % FSC, 2 mM EDTA) par 1 x 107 cellules.
  7. Filtrer à travers un tamis de cellule 70 µm dans un fond rond, tube en polypropylène (cytométrie en flux) et conserver les échantillons sur la glace et dans l’obscurité.
  8. Allumez la machine FACS et effectuer standard mis en place à l’aide d’une buse de 100 µm, effectuer le délai de chute et assurer un flux stable.
  9. Charger l’échantillon, puis affectez-lui ~ 1000 événements/s de vitesse d’acquisition.
  10. Ajuster la FSC, SSC, APC (a-PRO-3) et des tensions FITC (A5) et positionner les événements dans les parcelles de FACS pour s’assurer que les populations peuvent être clairement séparées.
  11. Enregistre les 20 000 événements.
  12. Mettre en place une stratégie de blocage que dans la partie 4.
  13. Dans la disposition de la sorte, ajouter la dernière porte de ApoBD que la population de tri désirée.
  14. Commencer à acquérir de l’échantillon et effectuer une sorte de test en recueillant 5 000-10 000 ApoBDs dans un nouveau tube contenant ~ 250 µL de tampon de FACS.
  15. Effectuer un système de retour de chasse et charge tri ApoBDs.
  16. Acquérir et enregistrer test-tri ApoBDs.
  17. Vérifiez que la pureté de ApoBD est ~ 99 % en comparant FSC (axe y) vs A5 (événements de l’axe des abscisses).
    NOTE : A5 coloration peut réduire légèrement lors de ré-analyser les échantillons en raison de laser de blanchiment.
  18. Lorsqu’on atteint haute pureté, charger l’échantillon original et continuer jusqu'à ce que le nombre désiré de ApoBDs a été obtenu de tri.
    Remarque : Si nécessaire, double tri peut être effectuée afin d’isoler en même temps ApoCells et ApoBDs.
    Remarque : Lors du tri sur une longue période de temps, nous recommandons d’incubation le tube de prélèvement à 4 ° C.
  19. Une fois que le tri est terminé, recueillir une petite portion de post-tri ApoBDs, trier après ApoCells, broussaille et WAS pour valider l’apoptose et confirmer post-tri pureté.
    Remarque : Bien que le tri test et pureté post-tri ne devraient pas significativement, c’est basé sur les paramètres de flux et de la stabilité.

3. ApoBD Isolation par Centrifugation différentielle

  1. Centrifuger l’échantillon apoptotic restant à 300 x g pendant 10 min.
  2. Récupérer le surnageant, en laissant environ 500 µL pour ne pas perturber le culot cellulaire et ajouter dans un nouveau tube conique de 15 mL.
  3. Retirer le reste 500 µL et Resuspendre le culot dans 2 mL de PBS 1 x (ce qui représente la « fraction enrichie en ApoCell ».
  4. Centrifuger le liquide surnageant collecté pendant 20 min à 3 000 g.
  5. Recherchez une boulette et retirer délicatement le surnageant (le surnageant peut contenir de petites vésicules extracellulaires, y compris des microvésicules et exosomes).
  6. Resuspendre le culot dans 1 mL de PBS 1 x (ce qui représente la fraction enrichie « ApoBD »)
  7. Collecter 100 µL de chaque viabilisé, les WAS, enrichie en ApoCell et les échantillons enrichis ApoBD dans un nouveau fond rond, tube de polystyrène (cytométrie en flux).
  8. Ajouter 100 µL de tache contenant 2 x A5 tampon de liaison au 1/100 A5-FITC et 1 : 1 000 a-PRO-3
  9. Incuber à température ambiante pendant 10 min dans l’obscurité.
  10. Analyser des échantillons par cytométrie en flux, à l’aide de la stratégie de blocage comme décrit ci-dessus pour valider la succès induction de l’apoptose et la pureté de la fraction enrichie en ApoBD.

4. cytométrie Gating stratégie

  1. Plot TO-PRO-3 (axe y) contre FSC (axe x) pour séparer les cellules nécrotiques (a-PRO-3élevé) de tous les autres événements non-perméabilisées (a-PRO-3faible ou intermédiaire).
  2. Sélectionnez tous les événements non-perméabilisées et tracer les SSC contre A5. Porte deux populations dont la population (P1), SSCintermédiaire/haut, A5faible ou intermédiaire piles 1 et 2 (P2), tous les autres événements.
  3. Dans P2, plot TO-PRO-3 contre A5 et sélectionnez événementsintermédiaires/haut A5 d’exclure tous les débris cellulaires.
  4. Sélectionnez tous les événements positifs de l’A5 et tracer FSC contre A5. Séparer (FSCfaible) ApoBDs de ApoCells (moyen/hautFSC).
    Remarque : Lors de l’ouverture de porte ApoBDs pour ApoBD d’isolation via l’approche axée sur les FACS, nous recommandons une dernière étape en sélectionnant ApoBDs et comparant a-PRO-3 en A5, tous les événements. Cela garantit que la porte de tri finale utilise fluorescence plutôt que des paramètres FSC/SSC.
  5. Pour l’analyse des cellules viables, sélectionnez P1, puis effectuez l’une des deux stratégies de blocage. Pour une analyse générale de cellules viables, intrigue FSC contre A5 et sélectionner toutes les cellules demoyen/haut FSC, donc enlever les débris de cellules restants. Sinon, pour une analyse approfondie, des cellules viables peuvent être séparés du A5 ApoCells précoce et en a-PRO-3 contre FSC. Select TO-PRO-3faible, cellules viables de la FSCintermédiaire/haut et TO-PRO-3intermédiaire, FSCintermédiaire/haut A5 ApoCells précoce.

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Representative Results

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En utilisant la procédure décrite ici, apoptose des monocytes THP-1 a été induite et ApoBDs ont été détectés et isolés via une base de FACS ou une approche de centrifugation différentielle (Figure 1). Tout d’abord, l’apoptose a été induite par l’irradiation UV et échantillons ont été prélevés après 2-3 h d’incubation quand exposé de cellules apoptotiques morphologies, incluant blebbing, formation de protrusion membranaire apoptotic et la génération de ApoBDs6. Une méthode de cytométrie de flux axées sur l’A5 et de TO-PRO-3 a été utilisée pour confirmer l’induction de l’apoptose des monocytes et ApoBD formation en séparant les cellules viables, les cellules nécrotiques, début ApoCells, ApoCells, ApoBDs et débris (Figure 2). Pris ensemble, analyse en cytométrie en flux a indiqué que le traitement UV entraîne environ 20 % ApoCells (Figure 3).

ApoBDs de monocyte THP-1 ont ensuite été isolées de la WAS via deux approches. Tout d’abord, les échantillons ont été préparés pour une approche axée sur les FACS où seulement une étape de centrifugation simple est nécessaire pour l’échantillon entier apoptotic de granule avant la coloration de grande pureté et FACS. Cette méthode consiste pour les tests fonctionnels quand significativement échantillon haute pureté est requise (par exemple, pour l’analyse de qPCR), quand un certain nombre de ApoBDs est requis, ou lorsque l’acquisition de cellules spécifiques au type ApoBDs auprès d’un échantillon complex. En utilisant cette méthode, ApoBDs ont été isolés à ~ 99 % de pureté (Figure 4).

Ensuite, monocyte THP-1 ApoBDs ont aussi été isolés par une approche de centrifugation différentielle en deux étapes. La première étape comprend l’isolement des cellules viables, les ApoCells et les cellules nécrotiques. La deuxième étape comprend la séparation de grandes ApoBDs de petites vésicules extracellulaires comme microvésicules et exosomes, qui ne peuvent pas être granulées à 3 000 x g. cytométrie s’est déroulée ensuite pour confirmer l’induction de l’apoptose et la pureté d’échantillon ApoBD et démontré un échantillon ApoBD enrichi contenant ~ 97 % ApoBDs (Figure 4). Ceci présente une technique rapide et efficace pour isoler ApoBD à relativement haute pureté et est approprié lorsque la purification ApoBDs partir d’échantillons contenant des cellules du même type.

Figure 1
Figure 1 . Schéma de principe d’isolement ApoBD via soit une approche axée sur les FACS ou différentielle centrifugation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Flow cytometry gating stratégie. Six des sous-ensembles de cellule/particules (y compris les cellules viables, A5ApoCells début, A5+ ApoCells, ApoBDs, les cellules nécrotiques et les débris) ont été identifiés et servant à sélectionner ApoBD d’isolement selon le FACS. a membrane permeabilised cellules nécrotiques sont séparées du non-permeabilised événements. (b) A5basse-intermédiaire, SSC,bas-haut cellules sont séparées du A5basse-haute événements. (b.i) pour une analyse approfondie, TO-POR-3faible des cellules viables peuvent être séparés du TO-PRO-3intermédiaire A5 ApoCells précoce. (b.ii) ou bien, simplement le calcul ApoBD pureté, cellules viables se distingues des événementsbasse FSC. (c) A5faibles débris sont exclus. (d) FSCintermédiaire/haut ApoCells sont séparés des FSCfaible ApoBDs. e toutes les A5-PRO-3intermédiaire/haut ApoBDs sont sélectionnés pour le tri. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 

Figure 3
Figure 3 . Validation de l’apoptose des monocytes THP-1. Écoulement cytometry analyse des monocytes THP-1 non traitées ou irradiation UV a été réalisée pour déterminer les niveaux de cellules viables, A5 ApoCells début, A5+ ApoCells et les cellules nécrotiques.

Figure 4
Figure 4 . Purification du THP-1 dérivées de monocytes ApoBDs. Analyse en cytométrie en flux a été réalisée sur isolé THP-1 dérivées de monocytes ApoBDs via soit une approche axée sur les FACS ou différentielle centrifugation basée, montrant l’enrichissement des ApoBDs de cellules viables, les ApoCells et les cellules nécrotiques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Depuis sa première description dans les années 1950, le domaine de l’apoptose a progressé nettement, devenir un domaine de recherche important. Malgré l’intérêt général et des efforts considérables, certains aspects de l’apoptose, en particulier la formation d’ApoBDs, n’ont pas été bien étudiés en raison de l’absence de méthodologies appropriées. Citons notamment la limitation dans le suivi de la progression de l’apoptose et de la formation de ApoBD simultanément à l’aide de la cytométrie en flux traditionnels analyse A5/PI et les impuretés d’isolement ApoBD. Nous avons récemment développé des approches pour combler ces lacunes méthodologiques.

Notre nouvelle analytique approche axée sur la cytométrie en flux permet de ApoBDs, qui sont souvent ignorés à l’aide de méthodes d’analyse traditionnelles, à détecter et quantifier le20. En outre, cette règle modifiée écoulement cytometry méthode, avec l’utilisation de la tache a-PRO-3, révèle un A5 supplémentaires apoptotic tôt, rendant par conséquent mieux délimiter l’apoptose progression20. Classiquement, ApoBD détection ont reposait largement sur l’imageur de techniques telles que la microscopie confocale et histologie, alors que notre méthode de cytométrie de flux fournit une approche de haut débit afin de quantifier la formation ApoBD. Bien qu’apparemment complexe, la procédure est relativement simple et ne nécessite que des réactifs disponibles dans le commerce et un cytomètre de flux de base. La logique détection et la quantification précise de ApoBDs permettraient de faire progresser la connaissance du microenvironnement cellulaire apoptotique que dicte cellulaire de dégagement et les réactions immunologiques. En fait, en couplant méthode de cytométrie de flux décrit avec des taches de l’organite spécifique, nous avons récemment rapporté la distribution hétérogène des matières cellulaires en ApoBDs24. Ces résultats suggèrent que les ApoBDs peuvent être classés en différents sous-ensembles et chaque sous-ensemble de ApoBD peut-être présenter différentes fonctions.

Nos techniques d’isolation ApoBD récemment développés contribuerait également à des avancées dans le domaine des vésicules extracellulaires. Traditionnellement, les méthodes de centrifugation différentielle utilisés pour isoler les ApoBD peuvent inclure une quantité importante de cellules plus petites, ce qui peut affecter les essais fonctionnels en aval. Cependant, notre approche de la centrifugation différentielle mis à jour le permet d’isoler le ApoBDs à 97 % de pureté. Bien que la grande pureté peut être réalisée par centrifugation différentielle, cette méthode peut ne pas convenir pour isoler l’ApoBDs d’échantillons complexes. En revanche, notre méthode axée sur les FACS peut enrichir ApoBDs à 99 % de pureté et se fonde sur les caractéristiques biologiques uniques de ApoBDs dont la taille des particules, granularité et l’exposition de PtdSer, au lieu de compter uniquement sur la densité de particules. Cette approche a également le potentiel d’identifier et de les isoler des ApoBDs d’origines cellulaires à l’aide de marqueurs spécifiques à un type de cellule24simultanément. Malgré une longue procédure de FACS qui pourrait prendre de 1 à 8 heures selon la quantité de ApoBDs requis, précis ApoBD isolement et leur analyse en aval permettrait l’attribution directe des caractéristiques moléculaires et rôles fonctionnels de ApoBDs. Pour ces méthodes, il est essentiel qu’approches d’isolation ApoBD sont couplées avec des techniques telles que la cytométrie en flux (tel que décrit ici) pour valider les deux l’induction de l’apoptose et la pureté de l’échantillon enrichi en ApoBD. En outre, FACS adéquat mis en place est essentiel pour isolation ApoBD via l’approche axée sur les FACS, comme un flux instable ou incorrectement interprété goutte retard peut entraîner faible pureté.

Collectivement, nous avons défini des méthodes de pointe pour quantifier l’induction de l’apoptose, ApoBD détection et isolement des ApoBDs très pur. Notre approche peut offrir un nouvel outil pour étudier le processus de démontage des cellules apoptotiques et élucider le rôle de ce processus dans les établissements de la maladie.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cela a fonctionné a été pris en charge par des subventions de santé nationale et Conseil de recherches médicales (GNT1125033 et GNT1140187) et Australian Research Council (DP170103790) à I.K.H.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) ATCC -
RPMI 1640 medium Life Technologies 22400-089
Penicillin-streptomycin mixture Life Technologies 15140122
FSC Gibco 10099-141
1x PBS - -
Annexin V FITC BD Bioscience -
TO-PRO-3 iodide Life Technologies T3605 TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact.
10x Annexin V binding buffer BD Bioscience 556454
EDTA Sigma-Aldrich 1001710526
Centrifuge tube (15 mL) Cellstar 188271
Microcentrifuge tube (1.5 mL) Sarstedt 72.690.001
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) - -
Centrifuge Beckman Coulter 392932
FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection BD Bioscience -
FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection BD Bioscience -
FACS Diva 6.1.1 software BD Bioscience -
FlowJo 8.8.6 software - -
 UV Stratalinker 1800 Stratagene -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Détection et isolement des corps apoptotiques de haute pureté
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Phan, T. K., Poon, I. K., Atkin-Smith, G. K. Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity. J. Vis. Exp. (138), e58317, doi:10.3791/58317 (2018).More

Phan, T. K., Poon, I. K., Atkin-Smith, G. K. Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity. J. Vis. Exp. (138), e58317, doi:10.3791/58317 (2018).

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