高純度にアポトーシス小体の検出と分離
Summary
検出、定量化およびアポトーシス サンプルから高純度にアポトーシス小体を分離する流れの cytometry または差動遠心分離を使用してワークフローを開発しました。
Abstract
アポトーシス小体 (ApoBDs) 機構の解明、エクソソーム細胞小胞族最大の型の一つである ApoBDs の主要メンバーであります。ApoBDs が細胞除去として人身売買生体分子を介して細胞間のコミュニケーションを助けることができることが提案されています。使用の識別と ApoBDs の分離従来多くの場合、正確な定量化と低いサンプル純度の欠如によって制限されます。ここでは、アポトーシスの誘導の確認、ApoBD 形成を検証および ApoBDs を高純度に分離するワークフローについて述べる。またアウトライン、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えと ApoBDs を分離に基づく差動遠心分離アプローチを比較します。使用して孤立した ApoBDs の純度を確認、さらに、以前の流れ cytometry による染色と分析法を確立します。まとめると、記述されているアプローチを使用して THP 1 単球のアポトーシスとアポトーシス細胞の分解は誘発され、検証と THP 1 球から生成された ApoBD は 97-99% の純度に分離されました。
Introduction
アポトーシス、プログラム細胞死のよく研究フォームは、生理的恒常性を維持し、人体1内で潜在的有害な細胞を除去する必要があります。アポトーシスの誘導後、アポトーシス細胞 (ApoCells) は一連の形態学的変化を受けるし、ApoBDs と呼ばれる小さな膜小胞に分解できます。全体的にみて、このプロセスはアポトーシス細胞分解として知られている、形態2,3に基づいて 3 段階に分けることができます。ステップ 1 (膜ブレブ) は、鉱物4,5として知られている細胞の表面に風船のような構造の形成によって特徴付けられます。ステップ 2 (アポトーシス突起形成) には、apoptopodia、apoptopodia ビーズと微小管結合スパイク6,7,8などの長い膜突起部の形成が含まれています。最後に、ステップ 3 (ApoBD 編成) にはアポトーシス突起および/または ApoBDs6,9を生成する ApoCells の断片化が含まれています。前の調査結果は、アポトーシス細胞のクリアランスを支援し、細胞間のコミュニケーションを仲介することで ApoBDs の役割を示唆しています。たとえば、ApoBDs に、ApoCell の断片化が小さい ” 作品を一口食2,10,11を囲むことによって簡単に削除することができますを生成可能性があります提案します。さらに、ApoBDs は、DNA、RNA および蛋白質は、細胞間コミュニケーション12,13,14を容易にする周囲の細胞に取り引きされる可能性がありますなどの生体分子のシリーズを抱く可能性があります。これらのプロセスを調べる機能的、アポトーシス誘導および ApoBD の形成の検証 (i)、ApoBDs の分離 (ii) と (iii) ApoBD 純度の確認を含む 3 つの重要なパラメーターを確認する重要です。
以前は、アポトーシスと ApoBDs15,16,17,18の勉強をフローサイトメトリーと電子顕微鏡を含むメソッドの数が使用されています。しかし、ApoBD の検出と定量、しばしば困難または見落とさ。例えば、最も日常的に使用される流れのフローサイトメトリーによるアポトーシス アッセイ アネキシン V を採用 (A5、外部結合タンパク質 ‘を食べる-私’ 信号ホスファチジルセリン (PtdSer)) 核酸染色 propidium ヨウ化 (PI)19。しかし、この普遍的な染色の組み合わせを使用して、解析では、のみ 3 種類のサンプルで (実行可能なセル、ApoCells と壊死細胞) 細胞のサブセットがあること想定しています。さらに、cytometry 流れの試金の apoptosis のため多くの研究者によって「ゴールド スタンダード」として考慮される、しかし、以降のデータ解析はしばしば FSC/SSC中間高イベントの選択最初のゲーティング ステップを通じて ApoBDs を除外します。したがって、A5 とする PRO 3 を使用して新規流れ cytometry 試金を最近開発した、7、20チャンネルは別の核酸染色カスパーゼ 3/7 活性化パネキシン 1 (PANX1) によって選択的に取ることができます。カスパーゼ 3 による PANX1 活性化はアポトーシスの早い段階での PtdSer 露出を前に、ようにプロ 3 は特異的アポトーシスとネクローシス細胞を汚れ。このアプローチ戦略をゲートの小説と組み合わせてさらに、データ分析中に取得しているすべてのイベントが含まれています、6 セル/パーティクルのサブセットの識別結果としてを含む: (i) 実行可能なセル (FSC/SSC中級/高、A5低にプロ 3低)、(ii) A5–初期の ApoCells (FSC/SSC中級/高A5低、中間にプロ 3)、(iii) A5+ ApoCells (FSC/SSC中級/高、A5高にプロ 3 の中間)、(iv) 壊死細胞または後期 ApoCells (FSC/SSC中級/高A5高にプロ 3高)、(v) ApoBDs (FSC/SSC低、A5中間に-プロ-3低中間/)、および (vi) 破片 (FSC/SSC低A5低、低にプロ 3)20。我々 のアプローチでは、すべてのセル/パーティクルのサブセットと、もっと重要なは、細胞および破片20からの ApoBDs の分離分析の重要性を強調しています。したがって、このアプローチは、アポトーシスおよび ApoBD の形成の誘導を同時に検証する効率的な方法を示します。
伝統的に、ApoBDs は、さまざまな細胞や密度に基づく他の細胞小胞から ApoBDs を分離できるという差動遠心分離アプローチを通じて分離されています。しかし、このようなの遠心分離法はしばしば低 ApoBD 純度、定量ステップ サンプル純度および/または細胞型特異 ApoBDs17,21,22を分離することができないことを確認するための不足によって制限されます。そこで、最近 2 つのアプローチ、FACS に基づいた新しい差動遠心分離に基づくアプローチをアポトーシスとサンプルの純度のための23の誘導を検証する私たち以前に確立された流れフローサイトメトリー法と結合することができますを開発しました。FACS 手法による ApoBD 分離を最大 99% 純度 ApoBDs を豊かにすることができます、さまざまな混合細胞集団、組織サンプルと体液23から ApoBDs を分離する細胞型特異抗体と組み合わせて利用できます。さらに、我々 の改訂された差動遠心分離アプローチを示しますに ApoBDs を分離するための効率的な方法 > 90% 純度23。
本稿で我々 はアポトーシス誘導を検証し検出し、定量化の ApoBD 形成私たちの実験の詳細について説明します。FACS ベースおよび差動遠心分離ベースのメソッドを使用して ApoBD 分離ワークフローはまた詳述し、比較しました。代表的なデータ記述の方法論では、将来の ApoBD 研究の効果的な最先端のツールをデモンストレーションします。
Protocol
Representative Results
Discussion
1950 年代の初期、説明文からアポトーシスのフィールドは著しく、進んでいる、著名な研究領域になります。広範な努力および広範な関心にもかかわらず特定の ApoBDs の形成におけるアポトーシスの特定の側面がよく研究されていない適切な方法論の不足のため。特にアポトーシスの進行と同時に従来のフローサイトメトリー A5/PI 解析、ApoBD 分離の不純物を使用して ApoBD 形成を追跡の制限が?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I.K.H.P. に国立保健医学研究評議会 (GNT1125033 ・ GNT1140187) とオーストラリアの研究評議会 (DP170103790) からの助成金によって支えられた仕事
Materials
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | – | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | – | – | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | – | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | – | – | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | – | |
| FlowJo 8.8.6 software | – | – | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | – |
References
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
- Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
- Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
- Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
- Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
- Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
- Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
- Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
- Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
- Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
- Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
- Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
- Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
- Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
- Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
- Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).
