Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Upptäckt och isolering av apoptotiska kroppar till hög renhet

doi: 10.3791/58317 Published: August 12, 2018

Summary

Ett arbetsflöde som använder flöde flödescytometri eller differentialdelad centrifugering är utvecklat för att identifiera, kvantifiera och isolera apoptotiska kroppar från ett apoptotiska prov till hög renhet.

Abstract

Apoptotiska kroppar (ApoBDs), microvesicles och exosomes är medlemmarna av familjen extracellulära vesikler, med ApoBDs att vara en av de största typ. Det har föreslagits att ApoBDs kan stöd cell clearance samt kommunikationen genom människohandel biomolekyler. Konventionella metoder som används för identifiering och isolering av ApoBDs begränsas ofta av bristen på korrekt kvantifiering och låg prov renhet. Här beskriver vi ett arbetsflöde för att bekräfta induktion av apoptos, validera ApoBD bildning och isolera ApoBDs till hög renhet. Vi kommer också beskriva och jämföra fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) och differentiell centrifugering baserade metoder att isolera ApoBDs. Dessutom kan renheten av isolerade ApoBDs bekräftas genom att använda en tidigare upprätta flöde flödescytometri-baserade färgning och analysmetod. Sammantaget med den beskrivna metoden, var THP-1 monocyt apoptos och apoptotiska celler demontering inducerad validerade och ApoBD genereras från THP-1 monocyter var isolerade till en renhet av 97-99%.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Apoptos, en väl studerat form av programmerad celldöd, krävs för att upprätthålla fysiologiska homeostas och ta bort skadliga celler inom den mänskliga kropp1. Efter induktion av apoptos, kan apoptotiska celler (ApoCells) genomgå en rad morfologiska förändringar och demontera till små membran-bundna blåsor kallas ApoBDs. Sammantaget denna process kallas apoptotiska celler demontering och kan delas in i 3 olika steg baserat på Morfologi2,3. Steg 1 (plasmamembran blebbing) kännetecknas av bildandet av ballong-liknande strukturer på cellytan kallas blebs4,5. Steg 2 (apoptotiska utstick bildande) innefattar bildandet av långa membran utskjutande delar såsom apoptopodia, pärlstav-apoptopodia och mikrotubuli spikar6,7,8. Slutligen, steg 3 (ApoBD bildande) innehåller fragmenteringen av den apoptotiska utbuktningar eller ApoCells att generera ApoBDs6,9. Tidigare fynd har föreslagit en roll av ApoBDs i medhjälp apoptotiska cell clearance och medla kommunikationen. Till exempel föreslås att splittringen av en ApoCell in i ApoBDs kan generera små 'bita-stora' bitar som lätt kunde avlägsnas genom att omge fagocyter2,10,11. ApoBDs kan dessutom hysa en serie av biomolekyler som DNA, RNA och proteiner, som kan vara människohandel till omgivande celler att underlätta cell-cell kommunikation12,13,14. För att funktionellt undersöka dessa processer, är det viktigt att bekräfta tre viktiga parametrar inklusive a validering av apoptos induktion och ApoBD bildning, (ii) isolering av ApoBDs, och (iii) bekräftelse av ApoBD renhet.

Ett antal metoder inklusive flödescytometri och elektronmikroskopi har tidigare använts för att studera apoptos och ApoBDs15,16,17,18. ApoBD identifiering och kvantifiering är dock ofta svårt eller förbisedda. Till exempel rutinmässigt-används mest flöde flödescytometri-baserade apoptos assay sysselsätter annexin V (A5, ett protein som binder den externalized ' äta-mig ' signal Fosfatidylserin (PtdSer)) och nukleinsyra fläck propidium jodid (PI)19. Dock med hjälp av denna universella fläcken kombination, förutsätter analys att det finns endast tre typer av cell undergrupper (viabla celler, ApoCells och nekrotiska celler) i provet. Dessutom även anses som ”gold standard” av många forskare för apoptos, flödescytometri analyser och efterföljande dataanalys utesluter ofta ApoBDs genom ett första Usenets steg att välja FSC/SSCintermediär-hög händelser. Därför har vi nyligen utvecklat en roman flöde flödescytometri analysen använder A5 och TO-PRO-3, en annan nucleic fläck som selektivt kan tas upp av kaspas 3/7-aktiverat pannexin 1 (PANX1) kanaler7,20. Som kaspas 3-inducerad PANX1 aktiveringen föregår PtdSer exponering i tidigt skede av apoptos, fläckar till-PRO-3 differentially apoptotiska och nekrotiska celler. Detta tillvägagångssätt i kombination med vår roman gating strategi innehåller dessutom alla förvärvade händelser under dataanalys och därmed sex cell/partikel delmängder identifieras, inklusive: (i) viabla celler (FSC/SSCintermediate/high, A5låg , TO-PRO-3låg), (ii) A5 tidig ApoCells (FSC/SSCintermediate/high, A5låg, TO-PRO-3mellanliggande), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCintermediate/high, A5hög , TO-PRO-3mellanliggande), (iv) nekrotiska celler eller sent ApoCells (FSC/SSCintermediate/high, A5hög, TO-PRO-3hög), (v) ApoBDs (FSC/SSClåg, A5mellanliggande, TO-PRO-3låg / intermediär), och (vi) skräp (FSC/SSClåg, A5låg, TO-PRO-3låg)20. Vårt synsätt betonar vikten av att analysera alla celler/partikel grupper och, viktigare, separation av ApoBDs från celler och skräp20. Detta tillvägagångssätt visar således en effektiv teknik för att validera induktion av apoptos och ApoBD formation samtidigt.

Traditionellt har ApoBDs isolerad genom en mängd differentiell centrifugering metoder varigenom ApoBDs kan skiljas från celler eller andra extracellulära blåsor baserat på densitet. Dock begränsas sådana centrifugering metoder ofta av låg ApoBD renhet, avsaknaden av en kvantifiering steg att bekräfta urvalet renhet och/eller oförmåga att skilja cell typspecifika ApoBDs17,21,22. Därför utvecklade vi nyligen två metoder, en FACS-baserad och en ny differentiell centrifugering-baserade strategi som kan kopplas till vår tidigare etablerade flöde flödescytometri metod att validera induktion av apoptos och prov renhet23. ApoBD isolering via vår FACS-baserat tillvägagångssätt kan berika ApoBDs till upp till 99% renhet och kan kopplas till en mängd cell typspecifika antikroppar att isolera ApoBDs från blandad cellpopulationer, vävnadsprover och kroppsvätskor23. Dessutom vår reviderade differentiell centrifugering strategi visar en effektiv metod för att isolera ApoBDs att > 90% renhet23.

I detta papper beskriver vi i detalj vår experimentella förfarandet att validera apoptos induktion, och för att påvisa och kvantifiera ApoBD bildning. ApoBD isolering arbetsflöden med FACS-baserade och differentierad centrifugering-baserade metoder är också utarbetade och jämfört. De representativa data visar att den beskrivna metoden ger ett effektivt banbrytande verktyg för framtida ApoBD studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. induktion av apoptos

  1. Centrifugera cell provet vid 300 x g i 5 min och Kassera supernatanten för att ta bort eventuella befintliga cellfragment.
    Obs: När du använder vidhäftande celler, utsäde celler i förväg och tvätta med 1 x fosfatbuffrad lösning (PBS) före induktion av apoptos.
  2. Bestämma antalet celler och samla celler.
    Obs: Beroende på analysen efter isolering, vi rekommenderar en cell startnumret på minst 1 x 107 celler.
  3. Återsuspendera i komplett media (respektive medium innehållande 10% (vol/vol) fetalt kalvserum, 50 IE/mL penicillin, 50 µg/mL streptomycin blandning) för en slutlig koncentration på 1 x 106 celler/mL.
  4. Alikvotens ~ 2 x 106 celler per brunn 6 väl platta.
  5. För att inducera apoptos, ta bort locket från plattan och bestråla cellerna på 150 mJ/cm2 använda en UV irradiator. Detta bör ta cirka 30-60 s.
    Obs: Före bestrålning, säkerställa att ~0.5 x 106 celler lagras för 'Obehandlat' cell kontroll.
    Obs: Apoptos kan också induceras via andra metoder såsom anti Fas eller serum svält6.
  6. Inkubera vid 37° C, 5% CO2 för 2-8 timmar, beroende på cellinje.
  7. Med hjälp av en bänk topp ljusmikroskop, visualisera cellerna för att bekräfta närvaron av apoptotiska morfologier, såsom blebbing, apoptopodia bildning och ApoBD bildning.
    Obs: 40 X förstoring är tillräcklig
  8. Med P1000 pipett pipett och samla apoptotiska prover.
  9. Tvätta plattan med 1 x PBS och kombinera med resterande prov för att säkerställa maximal avkastning.
  10. Samla ~1/10th för 'Hela apoptotiska provet' (WAS) styra.
  11. Samla 'Obehandlat' provet.
  12. Centrifugera både WAS och obehandlat prov vid 3 000 x g i 6 min.
  13. Återsuspendera i 1 mL 1 x PBS och ställ åt sidan på is.
  14. För ApoBD isolering, fortsätta att antingen steg 2 eller 3 med återstående apoptotiska provet.

2. ApoBD isolering via FACS

  1. Centrifugera hela provet vid 3 000 x g i 6 min.
  2. Ta bort majoriteten av supernatanten utan att störa pelleten.
  3. Återsuspendera i en färglösningen innehållande 1 mL 1 x A5 bindande buffert, 75 µL av A5-FITC och 2 µL till-PRO-3 per 1 x 107 celler.
  4. Inkubera provet mörkt vid rumstemperatur i 10 min.
  5. Tillsätt 1-2 mL 1 x A5 bindande buffert och centrifugera provet vid 3 000 x g i 6 min att ta bort överflödig bets.
    Obs: För blandad cellpopulationer eller vävnadsprover, utföra en antikropp färgning steg med hjälp av en kombination av cell typspecifika markörer i 1 x A5 bindande buffert och inkubera på is för 20 min (eller enligt tillverkarens protokoll) innan centrifugering vid 3 000 x g för 6 min.
  6. Återsuspendera prov pelleten i 3 mL FACS buffert (1 x PBS, 1 x A5 bindande buffert, 10% FSC, 2 mM EDTA) per 1 x 107 celler.
  7. Filtrera genom en 70 µm cell SIL till en runda-botten, polypropen (flödescytometri) röret och hålla prover på is och i mörker.
  8. Slå på FACS maskinen och utföra standarduppsättning med ett 100 µm munstycke, utföra droppe förseningen och säkerställa en stabil ström.
  9. Fyll på provet och inställd förvärv hastighet på ~ 1000 evenemang/s.
  10. Justera FSC, SSC, APC (TO-PRO-3) och FITC (A5) spänningar och placera händelser inom FACS tomterna att säkerställa populationer kan vara klart åtskilda.
  11. Spela in 20.000 evenemang.
  12. Ställa in en Usenets strategi som i del 4.
  13. I sortera layout, lägga till den slutliga ApoBD gaten som önskad sorterings befolkningen.
  14. Påbörja förvärva provet och utför ett test sortera genom att samla 5,000-10,000 ApoBDs in i en ny tub som innehåller ~ 250 µL FACS buffert.
  15. Utför ett system tillbaka spola och belastning sorterade ApoBDs.
  16. Förvärva och spela in test-sortera ApoBDs.
  17. Kontrollera att ApoBD renhet är ~ 99% genom att jämföra FSC (y-axeln) vs A5 (x-axeln händelser).
    Obs: A5 färgning kan minska något när åter analysera prover på grund av laser blekning.
  18. När hög renhet uppnås, lasta ursprungliga provet och fortsätta sortera tills önskat antal ApoBDs har erhållits.
    Obs: Om det behövs dubbla sortering kan utföras för att samtidigt isolera ApoCells och ApoBDs.
    Obs: När sortering under en lång tid, vi rekommenderar ruva samling röret vid 4 ° C.
  19. När sorteringen är klar, samla en liten del av efter sortera ApoBDs, sortera efter ApoCells, obehandlad och var att validera apoptos och bekräfta efter sortera renhet.
    Obs: Även om den test-sortera och efter sortera renhet inte bör skiljer sig avsevärt, detta är baserat på stream inställningar och stabilitet.

3. ApoBD isolering via differentiell centrifugering

  1. Centrifugera återstående apoptotiska provet vid 300 x g i 10 min.
  2. Samla in supernatanten, lämnar ~ 500 µL för att inte störa cellpelleten, och lägga till en ny 15 mL koniska rör.
  3. Ta bort de återstående 500 µL och resuspendera cellpelleten i 2 mL 1 x PBS (Detta motsvarar den 'ApoCell-berikad fraktionen'.
  4. Centrifugera insamlade supernatanten i 20 min vid 3000 g.
  5. Kontrollera om en pellet och ta försiktigt bort supernatanten (supernatanten kan innehålla små extracellulära blåsor inklusive microvesicles och exosomes).
  6. Återsuspendera pelleten i 1 mL 1 x PBS (Detta motsvarar andelen 'ApoBD-berikad')
  7. Samla 100 µL av varje Viable, WAS, berikade med ApoCell, och ApoBD-berikad prover i en ny runda-botten, polystyren (flödescytometri) tube.
  8. Tillsätt 100 µL av fläcken som innehåller 2 x A5 bindande buffert, 1: 100 A5-FITC och 1:1,000 TO-PRO-3
  9. Odla i rumstemperatur i 10 min i mörker.
  10. Analysera prover av flödescytometri, användning av Usenets strategi som beskrivs ovan för att validera framgångsrika induktion av apoptos och renhet i det ApoBD-berikad bråket.

4. flödescytometri Gating strategi

  1. Tomt till-PRO-3 (y-axeln) mot FSC (x-axeln) att skilja nekrotiska celler (TO-PRO-3hög) från alla andra icke-permeabilized händelser (TO-PRO-3låg/intermediär).
  2. Markera alla icke-permeabilized händelser och rita SSC mot A5. Utfärda utegångsförbud för två populationer inklusive befolkningen 1 (P1), SSCintermediate/high, A5låg/mellanliggande celler och befolkningen 2 (P2), alla andra händelser.
  3. Från P2, rita TO-PRO-3 mot A5 och välj A5intermediate/high händelser att utesluta alla cellfragment.
  4. Markera alla A5 positiva händelser och rita FSC mot A5. Separat ApoBDs (FSClåg) från ApoCells (FSCintermediate/high).
    När gating ApoBDs för ApoBD isolering via FACS-baserade strategi, rekommenderar vi ett sista steg genom att välja ApoBDs och jämföra TO-PRO-3 till A5 och alla händelser. Detta säkerställer att den slutliga sortering gaten använder fluorescens i stället för FSC/SSC parametrar.
  5. För livskraftiga cell analys, väljer du P1 och utför en av två Usenets strategier. För allmänna livskraftig cell analys, rita FSC mot A5 och välj alla FSCintermediate/high celler, därför att ta bort återstående cellfragment. Alternativt för djupgående analys, viabla celler kan skiljas från A5 tidig ApoCells av plottning TO-PRO-3 mot FSC. Välj TO-PRO-3låga, FSCintermediate/high viabla celler och TO-PRO-3mellanliggande, FSCintermediate/high A5 tidiga ApoCells.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Med hjälp av proceduren som beskrivs här, THP-1 monocyt apoptos förmåddes och ApoBDs upptäcktes och isolerades via antingen en FACS-baserad eller en differentiell centrifugering strategi (figur 1). För det första, apoptos var framkallas av UV-bestrålning och prover samlades efter 2-3 h för inkubation när celler ställde ut apoptotiska morfologier, inklusive blebbing, apoptotiska membran utstick bildandet och generering av ApoBDs6. En TO-PRO-3 och A5-baserade flöde flödescytometri metod användes för att bekräfta induktion av monocyt apoptos och ApoBD bildas genom att separera viabla celler, nekrotiska celler, tidig ApoCells, ApoCells, ApoBDs och skräp (figur 2). Sammantaget flödescytometri Flödesanalys anges att UV behandling resulterar i ~ 20% ApoCells (figur 3).

THP-1 monocyt ApoBDs var då isolerat från att WAS via två metoder. För det första prover var förberedda för en hög renhet FACS-baserat tillvägagångssätt där bara en enda centrifugeringssteget är skyldig till pellet hela apoptotiska provet innan färgning och FACS. Denna metod är lämplig för funktionella analyser när betydligt höga samplingsfrekvenser renhet krävs (till exempel för qPCR-analys), när det krävs ett visst antal ApoBDs eller när förvärva cell typspecifika ApoBDs från en komplex provet. Användningen av denna metod, var ApoBDs isolerade till ~ 99% renhet (figur 4).

Nästa, THP-1 monocyt ApoBDs isolerades också via en två-stegs, differentiell centrifugering strategi. Det första steget omfattar isolering av viabla celler, ApoCells och nekrotiska celler. Det andra steget omfattar separation av större ApoBDs från lilla extracellulära vesicles såsom microvesicles och exosomes, som inte kan vara pelleterat 3 000 x g. flödescytometri utfördes sedan bekräfta apoptos induktion och ApoBD prov renhet och visade en ApoBD-berikad prov innehållande ~ 97% ApoBDs (figur 4). Detta ger en snabb och effektiv teknik för att isolera ApoBD till relativt hög renhet och är lämplig när renande ApoBDs från prover som innehåller en enda celltyp.

Figure 1
Figur 1 . Schematisk bild av ApoBD isolering via antingen en FACS-baserade eller differentiell centrifugering strategi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Flödescytometri gating strategi. Sex cell/partikel undergrupper (inklusive viabla celler, A5tidiga ApoCells, A5+ ApoCells, nekrotiska celler, ApoBDs och skräp) identifierades och används för att välja ApoBD för FACS-baserade isolering. (a) membran permeabilised nekrotiska celler separeras från icke-permeabilised händelser. (b) A5låg-intermediate, SSClåg-hög celler separeras från A5låg-hög händelser. (b.i) för fördjupad analys, TO-POR-3låg viabla celler kan skiljas från TO-PRO-3mellanliggande A5 tidiga ApoCells. (b.ii) alternativt när man helt enkelt beräknar ApoBD renhet, viabla celler kan skiljas från FSClåg händelser. (c) A5låg skräp är undantagna. (d) FSCintermediate/high ApoCells separeras från FSClåg ApoBDs. (e) alla A5-till-PRO-3intermediate/high ApoBDs väljs för sortering. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 3
Figur 3 . Validering av THP-1 monocyt apoptos. Flödesanalys flödescytometri av obehandlad eller UV-bestrålas THP-1 monocyter utfördes för att bestämma nivåerna av viabla celler, A5 tidiga ApoCells, A5+ ApoCells, och nekrotiska celler.

Figure 4
Figur 4 . Rening av THP-1 monocyt-derived ApoBDs. Flödescytometri Flödesanalys utfördes på isolerade THP-1 monocyt-derived ApoBDs via antingen en FACS-baserade eller differentiell centrifugering baserat strategi, visar anrikningen av ApoBDs från viabla celler, ApoCells och nekrotiska celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Sedan dess tidiga beskrivning på 1950-talet, har fältet av apoptos avancerade markant, att bli ett framstående forskningsområde. Trots brett intresse och omfattande insatser, har vissa aspekter av apoptos, särskilt bildandet av ApoBDs, inte varit väl studerat på grund av avsaknaden av lämpliga metoder. Dessa omfattar särskilt begränsning i spårning apoptos progression och ApoBD formation samtidigt med den traditionella flödescytometri A5/PI analys och föroreningar i ApoBD isolering. Vi har nyligen utvecklat metoder för att åtgärda dessa metodologiska brister.

Vår nya flöde flödescytometri-baserade analytisk metod tillåter ApoBDs, som ofta ignoreras med traditionella analytiska metoder, ska identifieras och kvantifieras20. Dessutom modified detta flöde flödescytometri metod, med användning av fläcken till-PRO-3, avslöjar en ytterligare A5 apoptotiska tidigt, därav rendering bättre avgränsning av apoptos progression20. Konventionellt, ApoBD upptäckt har åberopat tungt bild-baserade tekniker såsom konfokalmikroskopi och histologi, medan vår flöde flödescytometri metod ger en hög genomströmning metod för att kvantifiera ApoBD bildning. Även om till synes komplex, förfarandet är relativt enkelt och kräver endast kommersiellt tillgängliga reagenser och en grundläggande flödescytometer. Logiska detektering och exakt kvantifiering av ApoBDs skulle ytterligare kunskap om apoptotiska celler närmiljön att diktat cell clearance och immunologiska svar. I själva verket av koppling häri beskrivna flöde flödescytometri metod med organell-specifika fläckar, har vi nyligen rapporterat en heterogen fördelning av cellulära innehållet i ApoBDs24. Dessa fynd tyder på att ApoBDs kan delas in i olika undergrupper och varje ApoBD delmängd kan uppvisa olika funktioner.

Vår nyutvecklade ApoBD isolering tekniker skulle också bidra till framsteg inom området för extracellulära blåsor. Traditionellt, kan differentiell centrifugering metoder som används för ApoBD isolering innehålla en betydande mängd mindre celler, som kan påverka nedströms funktionella analyser. Vår modifierade differentiell centrifugering strategi kan dock användas för att isolera ApoBDs till 97% renhet. Även om hög renhet kan uppnås genom differential centrifugering, kanske sådan metod inte passar för att isolera ApoBDs från komplexa prover. Däremot vår FACS-baserade metod kan berika ApoBDs till 99% renhet och är baserad på ApoBDs inklusive partikelstorlek, kornighet och PtdSer exponering, i stället för att förlita sig enbart på partikel densitet unika biologiska egenskaper. Detta synsätt har också potential att samtidigt identifiera och isolera ApoBDs av annan cell ursprung använder cell typspecifika markörer24. Trots en långdragen FACS procedur som kan ta 1-8 h beroende på kvantiteten av ApoBDs krävs, skulle korrekt ApoBD isolering och efterföljande nedströms analys tillåta direkt tilldelning av molekylära egenskaper och funktionella roller för ApoBDs. För sådana metoder är det viktigt att ApoBD isolering metoder är tillsammans med tekniker såsom flödescytometri (som beskrivs här) för att validera både induktion av apoptos och renhet av ApoBD-berikad provet. Dessutom är korrekt FACS ställa in nödvändigt för ApoBD isolering via FACS-baserade strategi, eftersom en instabil stream eller felaktigt utförda droppe försening kan resultera i låg renhet.

Sammantaget har vi sammanställt banbrytande metoder för att kvantifiera apoptos induktion, ApoBD upptäckt och isolering av högt rent ApoBDs. Vår inställning kan ge ett nytt verktyg för att studera processen apoptotiska celler demontering och belysa rollen i denna process i sjukdom inställningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta fungerade stöddes av bidrag från nationella hälsa och medicinska forskningsrådet (GNT1125033 och GNT1140187) och australiska forskningsrådet (DP170103790) till I.K.H.P.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) ATCC -
RPMI 1640 medium Life Technologies 22400-089
Penicillin-streptomycin mixture Life Technologies 15140122
FSC Gibco 10099-141
1x PBS - -
Annexin V FITC BD Bioscience -
TO-PRO-3 iodide Life Technologies T3605 TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact.
10x Annexin V binding buffer BD Bioscience 556454
EDTA Sigma-Aldrich 1001710526
Centrifuge tube (15 mL) Cellstar 188271
Microcentrifuge tube (1.5 mL) Sarstedt 72.690.001
Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) - -
Centrifuge Beckman Coulter 392932
FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection BD Bioscience -
FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection BD Bioscience -
FACS Diva 6.1.1 software BD Bioscience -
FlowJo 8.8.6 software - -
 UV Stratalinker 1800 Stratagene -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
  2. Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
  3. Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
  4. Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
  5. Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
  6. Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
  7. Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
  8. Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
  9. Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
  10. Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
  11. Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
  12. Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
  13. Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
  14. Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
  15. Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
  16. Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
  17. Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  18. Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
  19. Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
  20. Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
  21. Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
  22. Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
  23. Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
  24. Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).
Upptäckt och isolering av apoptotiska kroppar till hög renhet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Phan, T. K., Poon, I. K., Atkin-Smith, G. K. Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity. J. Vis. Exp. (138), e58317, doi:10.3791/58317 (2018).More

Phan, T. K., Poon, I. K., Atkin-Smith, G. K. Detection and Isolation of Apoptotic Bodies to High Purity. J. Vis. Exp. (138), e58317, doi:10.3791/58317 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter