Upptäckt och isolering av apoptotiska kroppar till hög renhet
Summary
Ett arbetsflöde som använder flöde flödescytometri eller differentialdelad centrifugering är utvecklat för att identifiera, kvantifiera och isolera apoptotiska kroppar från ett apoptotiska prov till hög renhet.
Abstract
Apoptotiska kroppar (ApoBDs), microvesicles och exosomes är medlemmarna av familjen extracellulära vesikler, med ApoBDs att vara en av de största typ. Det har föreslagits att ApoBDs kan stöd cell clearance samt kommunikationen genom människohandel biomolekyler. Konventionella metoder som används för identifiering och isolering av ApoBDs begränsas ofta av bristen på korrekt kvantifiering och låg prov renhet. Här beskriver vi ett arbetsflöde för att bekräfta induktion av apoptos, validera ApoBD bildning och isolera ApoBDs till hög renhet. Vi kommer också beskriva och jämföra fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) och differentiell centrifugering baserade metoder att isolera ApoBDs. Dessutom kan renheten av isolerade ApoBDs bekräftas genom att använda en tidigare upprätta flöde flödescytometri-baserade färgning och analysmetod. Sammantaget med den beskrivna metoden, var THP-1 monocyt apoptos och apoptotiska celler demontering inducerad validerade och ApoBD genereras från THP-1 monocyter var isolerade till en renhet av 97-99%.
Introduction
Apoptos, en väl studerat form av programmerad celldöd, krävs för att upprätthålla fysiologiska homeostas och ta bort skadliga celler inom den mänskliga kropp1. Efter induktion av apoptos, kan apoptotiska celler (ApoCells) genomgå en rad morfologiska förändringar och demontera till små membran-bundna blåsor kallas ApoBDs. Sammantaget denna process kallas apoptotiska celler demontering och kan delas in i 3 olika steg baserat på Morfologi2,3. Steg 1 (plasmamembran blebbing) kännetecknas av bildandet av ballong-liknande strukturer på cellytan kallas blebs4,5. Steg 2 (apoptotiska utstick bildande) innefattar bildandet av långa membran utskjutande delar såsom apoptopodia, pärlstav-apoptopodia och mikrotubuli spikar6,7,8. Slutligen, steg 3 (ApoBD bildande) innehåller fragmenteringen av den apoptotiska utbuktningar eller ApoCells att generera ApoBDs6,9. Tidigare fynd har föreslagit en roll av ApoBDs i medhjälp apoptotiska cell clearance och medla kommunikationen. Till exempel föreslås att splittringen av en ApoCell in i ApoBDs kan generera små ‘bita-stora’ bitar som lätt kunde avlägsnas genom att omge fagocyter2,10,11. ApoBDs kan dessutom hysa en serie av biomolekyler som DNA, RNA och proteiner, som kan vara människohandel till omgivande celler att underlätta cell-cell kommunikation12,13,14. För att funktionellt undersöka dessa processer, är det viktigt att bekräfta tre viktiga parametrar inklusive a validering av apoptos induktion och ApoBD bildning, (ii) isolering av ApoBDs, och (iii) bekräftelse av ApoBD renhet.
Ett antal metoder inklusive flödescytometri och elektronmikroskopi har tidigare använts för att studera apoptos och ApoBDs15,16,17,18. ApoBD identifiering och kvantifiering är dock ofta svårt eller förbisedda. Till exempel rutinmässigt-används mest flöde flödescytometri-baserade apoptos assay sysselsätter annexin V (A5, ett protein som binder den externalized ‘ äta-mig ‘ signal Fosfatidylserin (PtdSer)) och nukleinsyra fläck propidium jodid (PI)19. Dock med hjälp av denna universella fläcken kombination, förutsätter analys att det finns endast tre typer av cell undergrupper (viabla celler, ApoCells och nekrotiska celler) i provet. Dessutom även anses som ”gold standard” av många forskare för apoptos, flödescytometri analyser och efterföljande dataanalys utesluter ofta ApoBDs genom ett första Usenets steg att välja FSC/SSCintermediär-hög händelser. Därför har vi nyligen utvecklat en roman flöde flödescytometri analysen använder A5 och TO-PRO-3, en annan nucleic fläck som selektivt kan tas upp av kaspas 3/7-aktiverat pannexin 1 (PANX1) kanaler7,20. Som kaspas 3-inducerad PANX1 aktiveringen föregår PtdSer exponering i tidigt skede av apoptos, fläckar till-PRO-3 differentially apoptotiska och nekrotiska celler. Detta tillvägagångssätt i kombination med vår roman gating strategi innehåller dessutom alla förvärvade händelser under dataanalys och därmed sex cell/partikel delmängder identifieras, inklusive: (i) viabla celler (FSC/SSCintermediate/high, A5låg , TO-PRO-3låg), (ii) A5– tidig ApoCells (FSC/SSCintermediate/high, A5låg, TO-PRO-3mellanliggande), (iii) A5+ ApoCells (FSC/SSCintermediate/high, A5hög , TO-PRO-3mellanliggande), (iv) nekrotiska celler eller sent ApoCells (FSC/SSCintermediate/high, A5hög, TO-PRO-3hög), (v) ApoBDs (FSC/SSClåg, A5mellanliggande, TO-PRO-3låg / intermediär), och (vi) skräp (FSC/SSClåg, A5låg, TO-PRO-3låg)20. Vårt synsätt betonar vikten av att analysera alla celler/partikel grupper och, viktigare, separation av ApoBDs från celler och skräp20. Detta tillvägagångssätt visar således en effektiv teknik för att validera induktion av apoptos och ApoBD formation samtidigt.
Traditionellt har ApoBDs isolerad genom en mängd differentiell centrifugering metoder varigenom ApoBDs kan skiljas från celler eller andra extracellulära blåsor baserat på densitet. Dock begränsas sådana centrifugering metoder ofta av låg ApoBD renhet, avsaknaden av en kvantifiering steg att bekräfta urvalet renhet och/eller oförmåga att skilja cell typspecifika ApoBDs17,21,22. Därför utvecklade vi nyligen två metoder, en FACS-baserad och en ny differentiell centrifugering-baserade strategi som kan kopplas till vår tidigare etablerade flöde flödescytometri metod att validera induktion av apoptos och prov renhet23. ApoBD isolering via vår FACS-baserat tillvägagångssätt kan berika ApoBDs till upp till 99% renhet och kan kopplas till en mängd cell typspecifika antikroppar att isolera ApoBDs från blandad cellpopulationer, vävnadsprover och kroppsvätskor23. Dessutom vår reviderade differentiell centrifugering strategi visar en effektiv metod för att isolera ApoBDs att > 90% renhet23.
I detta papper beskriver vi i detalj vår experimentella förfarandet att validera apoptos induktion, och för att påvisa och kvantifiera ApoBD bildning. ApoBD isolering arbetsflöden med FACS-baserade och differentierad centrifugering-baserade metoder är också utarbetade och jämfört. De representativa data visar att den beskrivna metoden ger ett effektivt banbrytande verktyg för framtida ApoBD studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sedan dess tidiga beskrivning på 1950-talet, har fältet av apoptos avancerade markant, att bli ett framstående forskningsområde. Trots brett intresse och omfattande insatser, har vissa aspekter av apoptos, särskilt bildandet av ApoBDs, inte varit väl studerat på grund av avsaknaden av lämpliga metoder. Dessa omfattar särskilt begränsning i spårning apoptos progression och ApoBD formation samtidigt med den traditionella flödescytometri A5/PI analys och föroreningar i ApoBD isolering. Vi har nyligen utvecklat …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta fungerade stöddes av bidrag från nationella hälsa och medicinska forskningsrådet (GNT1125033 och GNT1140187) och australiska forskningsrådet (DP170103790) till I.K.H.P.
Materials
| Cells e.g. cultured human THP-1 monocytes (clone number: TIB-202) | ATCC | – | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Penicillin-streptomycin mixture | Life Technologies | 15140122 | |
| FSC | Gibco | 10099-141 | |
| 1x PBS | – | – | |
| Annexin V FITC | BD Bioscience | – | |
| TO-PRO-3 iodide | Life Technologies | T3605 | TO-PRO-3 may cause skin, eye and respiratory irration. Avoid direct contact. |
| 10x Annexin V binding buffer | BD Bioscience | 556454 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1001710526 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | Cellstar | 188271 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2) | – | – | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| FACS ARIA III Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Canto II Flow cytometer, configured with two lasers for FITC and APC detection | BD Bioscience | – | |
| FACS Diva 6.1.1 software | BD Bioscience | – | |
| FlowJo 8.8.6 software | – | – | |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | – |
References
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews. Immunology. 14, 166-180 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. Disassembly of the Dying: Mechanisms and Functions. Trends in Cell Biology. 27, 151-162 (2017).
- Tixeira, R., et al. Defining the morphologic features and products of cell disassembly during apoptosis. Apoptosis: An International Journal on Programmed Cell Death. 22, 475-477 (2017).
- Sebbagh, M., et al. Caspase-3-mediated cleavage of ROCK I induces MLC phosphorylation and apoptotic membrane blebbing. Nature Cell Biology. 3, 346-352 (2001).
- Coleman, M. L., et al. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature Cell Biology. 3, 339-345 (2001).
- Atkin-Smith, G. K., et al. A novel mechanism of generating extracellular vesicles during apoptosis via a beads-on-a-string membrane structure. Nature Communications. 6, 7439 (2015).
- Poon, I. K., et al. Unexpected link between an antibiotic, pannexin channels and apoptosis. Nature. 507, 329-334 (2014).
- Moss, D. K., Betin, V. M., Malesinski, S. D., Lane, J. D. A novel role for microtubules in apoptotic chromatin dynamics and cellular fragmentation. Journal of Cell Science. 119, 2362-2374 (2006).
- Kerr, J. F., Wyllie, A. H., Currie, A. R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. British journal of cancer. 26, 239-257 (1972).
- Witasp, E., et al. Bridge over troubled water: milk fat globule epidermal growth factor 8 promotes human monocyte-derived macrophage clearance of non-blebbing phosphatidylserine-positive target cells. Cell Death and Differentiation. 14, 1063-1065 (2007).
- Orlando, K. A., Stone, N. L., Pittman, R. N. Rho kinase regulates fragmentation and phagocytosis of apoptotic cells. Experimental Cell Research. 312, 5-15 (2006).
- Holmgren, L., et al. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies. Blood. 93, 3956-3963 (1999).
- Zernecke, A., et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Science Signaling. 2, ra81 (2009).
- Schiller, M., et al. Autoantigens are translocated into small apoptotic bodies during early stages of apoptosis. Cell Death and Differentiation. 15, 183-191 (2008).
- Elamin, M. H., et al. Curcumin inhibits the Sonic Hedgehog signaling pathway and triggers apoptosis in medulloblastoma cells. Molecular Carcinogenesis. 49, 302-314 (2010).
- Sagulenko, V., et al. AIM2 and NLRP3 inflammasomes activate both apoptotic and pyroptotic death pathways via ASC. Cell Death and Differentiation. 20, 1149-1160 (2013).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Turiak, L., et al. Proteomic characterization of thymocyte-derived microvesicles and apoptotic bodies in BALB/c mice. Journal of Proteomics. 74, 2025-2033 (2011).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Jiang, L., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nature Protocols. 11, 655-663 (2016).
- Berda-Haddad, Y., et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1alpha. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 20684-20689 (2011).
- Lleo, A., et al. Shotgun proteomics: identification of unique protein profiles of apoptotic bodies from biliary epithelial cells. Hepatology. 60, 1314-1323 (2014).
- Atkin-Smith, G. K., et al. Isolation of cell type-specific apoptotic bodies by fluorescence-activated cell sorting. Scientific Reports. 7, 39846 (2017).
- Jiang, L., et al. Determining the contents and cell origins of apoptotic bodies by flow cytometry. Scientific Reports. 7, 14444 (2017).
