Implantation av laminektomi och Ryggmärgs fönster i musen
Summary
Detta protokoll beskriver implantation av ett glas fönster på ryggmärgen av en mus för att underlätta visualisering av intravital mikroskopi.
Abstract
Detta protokoll beskriver en metod för ryggmärg laminektomi och glas fönster implantation för in vivo avbildning av mus ryggmärgen. En integrerad digital spridare utnyttjas för att uppnå ett stabilt plan av anestesi vid en låg flödeshastighet av isofluran. En enda kotryggrad avlägsnas, och en kommersiellt tillgänglig Cover-glas är överlagras på en tunn aguppstod säng. En 3D-tryckt plast bakplåt fästs sedan på intilliggande vertebrala Taggar med hjälp av vävnadslim och tandcement. En stabiliserings plattform används för att minska rörelse artefakten från andning och hjärtslag. Denna snabba och kläm fria metod lämpar sig väl för akut mikroskopi med multi-Photon fluorescens. Representativa data ingår för en tillämpning av denna teknik för att två-Photon mikroskopi av ryggmärgen vaskulatur i transgena möss uttrycker eGFP: Claudin-5-ett tätt knutpunkt protein.
Introduction
Transgena djurmodeller som uttrycker fluorescerande proteiner, i kombination med intravital mikroskopi, ger en kraftfull plattform för att hantera biologi och patofysiologi. För att tillämpa dessa tekniker till ryggmärgen, är specialiserade protokoll som krävs för att förbereda ryggmärgen för avbildning. En sådan strategi är att genomföra en laminektomi och ryggmärg fönster implantation. De viktigaste inslagen i en idealisk laminektomi protokoll för mikroskopi omfatta bevarande av inhemska vävnad struktur och funktion, stabilitet i imaging fältet, snabb handläggningstid, och reproducerbarhet av resultat. En särskild utmaning är att stabilisera bildområdet mot den rörelse som induceras av andning och hjärtslag. Flera ex vivo – och in vivo -strategier har rapporterats för att uppnå dessa mål1,2,3,4,5. De flesta in vivo metoder innebär fastspänning sidorna av ryggraden2,4 och följs ofta genom att implantera en styv metall apparat3,4 för stabilitet under kirurgi och nedströmsbildprogram. Fastspänning ryggraden kan potentiellt äventyra blodflödet och inducera blod-hjärnbarriären (BBB) protein remodeling.
Syftet med denna metod är att göra den intakt ryggmärgen tillgänglig för optisk avbildning i den levande musen samtidigt minimera invasivitet av protokollet och förbättra resultaten. Vi beskriver en enda laminektomi och täck-glas implantation förfarande i kombination med en minimalt invasiv oval plast 3D-tryckt bakplåt som fortfarande uppnår robust mekanisk stabilitet. Bakplattan är direkt anslutit sig till främre och bakre vertebrala Taggar med tandcement. Bakplattan är utrustad med laterala förlängningsarmar med skruv hål som stelt fäster mikroskopet scenen via en metall arm. Detta förankrar effektivt intakt främre och bakre Kota till mikroskopet skede, vilket ger mekanisk motståndskraft mot rörelse artefakten som annars skulle införas genom andning och hjärtslag. Metoden har optimerats för laminektomi av en enda kotan på bröst nivå 12, utelämna klämmorna utnyttjas i alternativa strategier för stabilitet under in vivo Imaging. Förfarandet är snabb, tar cirka 30 min per mus.
Detta protokoll kan användas för att studera sjukdomsmekanismer av BBB. BBB är en dynamisk mikrovaskulär system består av endotelceller, vaskulär glatt mus kula, pericyter, och astrocyt fot processer som ger en mycket selektiv miljö för centralanervsystemet (CNS). Representativa data skildrar tillämpningen av detta protokoll i transgena möss konstruerade för att uttrycka förstärkt grönt fluorescerande protein (eGFP): Claudin-5, ett BBB tight Junction protein. De medföljande bakplattan-filerna kan också anpassas för alternativa tillämpningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metod som beskrivs här möjliggör stabil avbildning av ryggmärgen i möss genom ett glas fönster. Denna metod har tillämpats för att bedöma BBB remodeling i transgena eGFP: Claudin5 +/-möss som uttrycker en fluorescerande BBB tight Junction protein, men det kan tillämpas lika bra för studier av alla fluorescerande proteiner eller celler i ryggmärgen.
Flera metoder för laminektomi och ryggmärgs stabilisering har utvecklats. Alla protokoll adress stabiliserande ryggmärgen under…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. Lutz stöds av National Center for framryckande translationella vetenskaper, National Institutes of Health, under Grant KL2TR002002 och University of Illinois Chicago College of Medicine start fonder. Simon Alford stöds av RO1 MH084874. Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis den officiella synen på NIH. Författarna tackar Dritan Agalliu på Institutionen för neurologi vid Columbia University Medical Center för TG eGFP: Claudin-5 möss, vetenskapliga diskussioner och insikter i utvecklingen av kirurgiska protokoll och Imaging applikationer. Författarna tackar Sunil P. Gandhi i Institutionen för neurobiologi och beteende vid University of California, Irvine för att utforma den första prototypen av stereotaktisk apparat och djur temperatur Controller, diskussion om det kirurgiska protokollet, och utbildning i två-Photon mikroskopi. Författarna tackar också Steve Pickens (W. Nuhsbaum, Inc.) för hjälp med att anpassa den kirurgiska stereomicroscope, och Ron Lipinski (val tillverkning) för bearbetning stereotaktiska delar.
Materials
| 3D printer | Raise3D | Pro2 | For printing backplates |
| PLA 3D printing filament | Inland | PLA+-175-B | Black plastic 3D printing material |
| 3D CAD software | Dassault Systemes | Solidworks software | used to design 3D shapes |
| 3D printer software | Raise3D | Ideamaker software | software used to interface with the 3D printer |
| 3D printed oval backplate | custom | Stabilizing imaging field | |
| Surgical dissecting microscope | Leica | M205 C | Equipped with Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series objective, and gliding stage |
| Microscope camera | Leica | MC170 | HD color camera for visualizing surgical field |
| Gliding stage | Leica | 10446301 | The gliding stage is constructed of two metal plates. The base plate is fixed. The upper plate slides on greased interface to allow rotational and linear movement. |
| Surgical station and stabilization fork | Whale Manufactoring | custom | Laminectomy |
| SomnoSuite low-flow isoflurane delivery unit | Kent Scientific | SS-01 | Surgical anesthesia administration with integrated digitial vaporizer |
| Stainless steel 1.5 inch mounting post | ThorLabs | P50/M | For mounting surgical station onto optical table for two-photon imaging |
| Counterbored Clamping Fork for 1.5" mounting Post | ThorLabs | PF175 | For stabilizing surgical station mount onto optical table for two-photon imaging |
| Ideal bone microdrill | Harvard apparatus | 72-6065 | Thinning bone for laminectomy |
| Water bath | Fisher Scientific | 15-462-10 | Warming saline |
| Cautery gun | FST | 18010-00 | Cauterizing minor bleeds |
| Heating pad | Benchmark | BF11222 | 1.9” x 4.5” silicone heater with 20” Teflon leads, 10W, 5V |
| K type thermocoupled rectal probe | Physitemp | RET3 | Measuring mouse body temperature |
| petroleum jelly | Sigma | 8009-03-8 | Lubricating rectal probe |
| Feedback-regulated thermal controller | custom | NA | Commercially available alternatives include the Physitemp TCAT series |
| PVA Surgical eye spears | Beaver-visitec international | 40400-8 | Absorbing blood |
| Electric trimmer | Wahl | 41590-0438 | Trimming mouse fur |
| Blade, #11 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Forceps, #5 | FST | 11254-20 | Surgical tool |
| Forceps, #4 | FST | 14002-14 | Surgical tool |
| Titatnium toothed forceps | WPI | 555047FT | Surgical tool |
| Titanium Iris scissors | WPI | 555562S | Surgical tool |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 084-1469SB | Preparing tissue surface for dental acrylic |
| Ceramic mixing tray | Jack Richeson | 420716 | Mixing dental acrylic agent with accelerant |
| Orthojet dental acrylic | Lang Dental | 1520BLK, 1503BLK | Permanently bonding backplate to tissue |
| Small round cover glass, #1 thickness, 3 mm | Harvard apparatus | 64-0720 | optical window |
| NaCl | Fisher Scientific | 7647-14-5 | For aCSF |
| KCl | Fisher Scientific | 7447-40-7 | For aCSF |
| Glucose | Fisher Scientific | 50-99-7 | For aCSF |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | For aCSF |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | 7791-18-6 | For aCSF |
| CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | 10035-04-8 | For aCSF |
| Carprofen | Rimadyl | QM01AE91 | Analgesia |
| Bacteriostatic water | Henry Schein | 2587428 | Diluent for carprofen |
| Isoflurane | Henry Schein | 11695-6776-2 | Anesthesia |
| Lactated ringer solution | Baxter | 0338-0117-04 | Hydration for mouse |
| Agarose High EEO | Sigma | A9793 | gel point 34-37 degrees C |
| Opthalmic lubricating ointment | Akwa Tears | 68788-0697 | Prevent corneal drying |
| MOM Two-Photon Microscope | Sutter |
References
- Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).
- Farrar, M. J., Schaffer, C. B. A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Visualized Experiments. (82), e50826 (2013).
- Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLOS ONE. 8 (3), e58081 (2013).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).
- Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state. Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).
- Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82, 1-15 (2014).
- Lutz, S. E., et al. Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation. Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).
- Harrison, M., et al. Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse. Neuroimage. 68, 22-29 (2013).
- Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F., Bakota, L., Brandt, R. . Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue. , 37-50 (2014).
- Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nature Communications. 7, 11450 (2016).
- Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo. Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).
- Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).
- Miyamoto, K., et al. Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway. Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).
- Muthian, G., et al. COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis. Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).
