Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الثقافات "الكبد على رقاقة" خلايا الكبد الأولية وخلايا كوبفر للعدوى بفيروس التهاب الكبد B

Published: February 19, 2019 doi: 10.3791/58333
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Section of Virology, Department of Medicine, Imperial College

Summary

والهدف من هذا البروتوكول توفير دليل خطوة بخطوة القيام بتجارب ثلاثي الأبعاد "الكبد على رقاقة" العدوى بفيروس التهاب الكبد البائي.

Abstract

وعلى الرغم من العدوى استثنائية فيروس التهاب الكبد B (HBV) الحية، حيث يمكن أن ينتج سوى ثلاثة الجينوم الفيروسي الأزمان الشمبانزي المصابة تجريبيا، تتطلب معظم النماذج في المختبر عدة مئات آلاف جينوم الفيروسي كل خلية في من أجل البدء عدوى عابرة. بالإضافة إلى ذلك، تسمح الثقافات 2D ثابت من خلايا الكبد البشري الأساسي (PHH) فقط من الدراسات القصيرة الأجل نظراً لما ديديفيرينتييشن السريع. وهنا يصف لنا 3D ثقافات الكبد على رقاقة PHH، أما في الزراعات الأحادية أو في كوكولتوريس مع الخلايا الأخرى المقيمة في الكبد نونبارينتشيمال. وهذه توفر تحسنا كبيرا لدراسة التهابات HBV طويلة الأجل مع استجابات الخلية المضيفة الفسيولوجية. وبالإضافة إلى تيسير المخدرات فعالية الدراسات والتحليلات السمية، والتحقيقات المرضية، تمكين هذه النظم الثقافة موائع جزيئية تقييم العلاجات العلاجية لعدوى التهاب تهدف إلى القضاء على تساهمي مغلقة، التعميم (ccc) الحمض النووي. هذا عرض الأسلوب يصف تركيب PHH الزراعات الأحادية وخلية كوبفر PHH/الثقافات المشارك، والعدوى مع HBV المنقي وتحليل استجابات المضيف. هذا الأسلوب ينطبق بخاصة على تقييم الآثار الطويلة الأجل للعدوى وتركيبات العلاج المرضية HBV.

Introduction

دراسة HBV تعقدت قابلية الفقراء لأنظمة الثقافة، التي تتطلب عدة مئات آلاف نسخ الجينوم HBV كل خلية لبدء الإصابة1. وعلاوة على ذلك، خلايا الكبد البشرية الأولية عادة ما تكون هشة للغاية وسرعة ديديفيرينتياتي خلال الثقافات التقليدية2. وهذا أساسا إلى أن تقليد السطوح البلاستيكية المسطحة والثابت في بيئات خارج الخلية الطبيعية الموجودة في الكبد ونقص الأوكسجين للثقافات في غياب التداول موائع جزيئية عامة. سرعة الثقافات التقليدية ثابتة تتمثل في لوحات المغلفة بالكولاجين ديديفيرينتياتي وتفقد تعرضها ل الإصابة بالتهاب3. هنا، يمكننا وصف الهيكل والعدوى من PHH نمت في 3D الكبد على رقاقة الثقافات، التي تعتبر مفيدة إلى حد كبير عبر الثقافات PHH الثابتة 2D التقليدية في لوحات المغلفة بالكولاجين بسبب كفاءتهم الأيضية والفنية الموسعة، تيسير ثقافات على الأقل 40 يوما4طويلة الأجل. وفي هذا النظام هي المصنف PHH على السقالات المغلفة بالكولاجين، التي هي perfused باستمرار مع نمو متوسطة لتوفير الأوكسجين والمغذيات إلى الخلايا. حتى ولو استناداً إلى نظم الثقافة البديلة ل PHH كوكولتوريس معقدة مورين الليفية أو النمو 3D في الماغنيسيوم قد تم التحقق من صحتها وهم عرضه للإصابة بالتهاب استخدام التعدديات العدوى من 500 الجينوم مكافئات (شركة جنرال الكتريك) HBV كل خلية، 3D الثقافات الكبد على رقاقة يظل النظام النموذجي في المختبر الوحيد عرضه إلى 0.05 جنرال الكتريك HBV كل خلية4. هذا بالإضافة إلى ذلك يقوم على ضرورة استخدام تركيزات عالية من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) والبولي إيثيلين غليكول (شماعة) لإثبات الإصابة بالتهاب في هذه الثقافات، وهو يمكن الاستغناء عنها لعدوى نظم 3D الكبد على رقاقة الثقافة 4-من بين السمات المميزة الرئيسية لالتهاب العدوى هي تجمع كككدنا، الذي يعمل كقالب النسخي لجميع دي نوفو–تنتج فيريونس5،6. على الرغم من أن يمكن الكشف عن كككدنا في الثقافات التقليدية تتمثل7،8، أنه لا يزال غير واضح فيما يتعلق بما إذا كان تنظيم كككدنا وأي النهج العلاجية تهدف إلى القضاء عليه يرد موجز لها في جزئيا أو خلايا الكبد ديديفيرينتياتيد تماما. وقد أظهرنا أن كككدنا يتكون وظيفيا في 3D الكبد على رقاقة الثقافات، ويستجيب للمنبهات الفسيولوجية، ويمكن أن تكون مستهدفة بالتدخل مع إمكانية الوصول إليه النسخي ل الجينوم كككدنا4.

استجابات المضيف للإصابة بالتهاب في تقليد الكبد على رقاقة 3D تلك التي لوحظت في المرضى المصابين بالتهاب، مما يتيح تحديد المؤشرات الحيوية للإصابة، فضلا عن النجاح العلاجي. من بين السمات الفريدة للثقافات الكبد على رقاقة هو القدرة على تقييم استجابات المضيف طويلة الأجل بين PHH وغيرها من الخلايا نونبارينتشيمال في الكبد، بما في ذلك4من الخلايا والخلايا النجمية9الكبد جيبية كوبفر خلايا بطانية10،11. وهذا يوفر فرصة فريدة لتقييم التفاعلات/خلية في المكروية ثلاثية الأبعاد معقدة.

بالإضافة إلى ذلك، فترة ممتدة من الثقافة من هذا المنبر يسهل تقييم العلاج بالعقاقير متسلسلة وأثرها على استمرار HBV، التي لا يمكن استخدام نظم الثقافة التقليدية تتمثل.

هذا البروتوكول ويصف كيف 3D الكبد في--رقيقة تتولد الثقافات، الزراعات الأحادية PHH أو كوكولتوريس PHH مع خلايا كوبفر. وعلاوة على ذلك، يصف لنا إنتاج HBV المنقي للدراسات تعدد منخفضة للإصابة، فضلا عن التحليل اللاحق للمضيف والاستجابة الفيروسية.

Protocol

1-الجمعية والموازنة للوحات

  1. ضمان أن يتم تشغيل الضاغط والمضخة الفراغ المرتبطة بمنهاج ليفيرتشيب. أداء الجمعية والموازنة من اللوحات في فئة الثانية مجلس الوزراء.
  2. أسيبتيكالي تجميع لوحات موائع جزيئية بوضع غشاء عقيمة بين قاعدة اللوحة وإضافة جيدة تحتوي على أعلى لوحة (الشكل 1a).
  3. التأكد من أن الغشاء العقيمة بسلاسة تقع على دبابيس اثنين من الصفيحة القاعدية، منذ التنازلات موضع غشاء غير متكافئ على تداول موائع جزيئية.
  4. إضافة إلى غطاء لوحة عقيمة وتضييق الخناق على القاعدة لوحة عزم دقة تلقائية إلى 33 رطل استخدام دوامة تشديد التسلسل باستخدام. التأكد من أن جميع المسامير شددت إلى 35 رطل من عزم دوران يدوي باستخدام. أثناء هذه الخطوة، ضمان يتم تشديد الخناق شكل متناظر (الشكل 1a).
  5. بريوارم تتمثل بذر المتوسطة المحتوية على "ه ويليامز" المتوسطة، تتمثل الأولى ذوبان الجليد، وتصفيح ملاحق و 5% مصل بقرى الجنين (FBS) 1 ميكرومتر الديكساميتازون إلى 37 درجة مئوية قبل فتيلة.
  6. رئيس الوزراء لوحة مجمعة تماما بوضعه داخل قفص الاتهام الغسيل وإضافة 400 ميليلتر من تتمثل البذر المتوسطة إلى جانب خزان لكل بئر. تأمين اللوحة يستقر في قفص الاتهام الغسيل تماما.
  7. بدء تدفق في الاتجاه التصاعدي لمدة 3.5 دقيقة في 1 ميليلتر/s. وظيفة ناجحة في التداول موائع جزيئية يمكن التحقق من خلال مؤشرات حمراء بجانب اللوحة (الشكل 1a).
  8. حالما يتم ضخها في المتوسط إلى جانب نمو الخلية من اللوحة، ضمان التجميع الصحيح قناة تدفق، إضافة مل 1.2 إضافية من تتمثل البذر المتوسطة.
  9. نقل اللوحة في محطة الإرساء داخل حاضنة هوميديفيد في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2 وبدء تدفق في الاتجاه التصاعدي بمعدل تدفق من 1 ميليلتر/s ح 16 (الشكل 1 ج) بعناية.
  10. نقل اللوحة إلى حوض الغسيل والقضاء على فقاعات في البئر بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  11. قم بإضافة أحد العقيمة، جولة ورق الترشيح، تليها سقالة مرفق الخليوي وخاتم الاحتفاظ، لكل بئر باستخدام الملقط العقيمة. اضغط لأسفل كل بئر بالمكبس عقيمة لتأمين الاحتفاظ خواتم والسقالات في مكانة (الشكل 1b).
  12. نضح جميع المتوسطة وإضافة 400 ميليلتر من المتوسطة بذر تتمثل بريوارميد برفق فوق السقالة وبدء تدفق في الاتجاه النزولي لمدة 3.5 دقيقة في 1 ميليلتر/s.
  13. أسبيراتي المتوسطة جميع ضخ خارج الجانب خزان اللوحة. هذه الخطوة ضروري ليحل محل المتوسط الوارد في قناة التدفق.
  14. إضافة 1.4 مل تتمثل البذر المتوسطة لكل بئر قبل أن تعود اللوحة إلى قفص الاتهام لإكمال الحجم الإجمالي للبئر الواحد. وحدة التخزين في البئر الآن 1.6 مل (1.4 مل في البئر ومل 0.2 في قناة تدفق).

2-ذوبان الجليد والبذر لخلايا الكبد للزراعات الأحادية

  1. بريوارم تتمثل في ذوبان الجليد المتوسطة والمتوسطة تتمثل البذر إلى 37 درجة مئوية قبل ذوبان الجليد قنينة واحدة من PHH وفقا لتعليمات الموردين. استخدم أجهزة الطرد مركزي في درجة حرارة الغرفة خلال هذه الخطوة لتجنب التغييرات المفاجئة في درجة الحرارة. تؤدي ذوبان الجليد والبذر لخلايا الكبد في فئة الثانية مجلس الوزراء.
  2. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل متوسطة تتمثل البذر وعد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق. تأكد من صلاحية الخلايا أكثر من 90 في المائة.
  3. تبقى الخلايا على الجليد حتى يتم إضافتها إلى الآبار.
  4. نقل لوحة مجمع بشكل كامل ومتوازن لحوض الغسيل ونضح المتوسطة كل من الآبار.
  5. إضافة خلايا الكبد 600,000 لكل بئر في حجم 500 ميليلتر تتمثل بذر المتوسطة.
  6. بدء تدفق في الاتجاه نحو الانخفاض في معدل تدفق من 1 ميليلتر/s وجلب الحجم الإجمالي في البئر إلى 1.6 مل بإضافة 900 ميليلتر من تتمثل البذر المتوسطة.
  7. نقل اللوحة إلى محطة الإرساء داخل حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية ومع أول أكسيد الكربون 5%2.
  8. بدء تدفق في الاتجاه نحو الانخفاض في معدل تدفق من 1 ميليلتر/s ح 8، تليها عكس تدفق إلى الاتجاه الصعودي بمعدل تدفق من 1 ميليلتر/s ح 8.
  9. نقل اللوحة إلى حوض الغسيل ونضح المتوسطة كل من الآبار.
  10. إضافة 400 ميليلتر من تتمثل الصيانة المتوسطة (المتوسطة "ه ويليامز" وتستكمل مع ملاحق صيانة تتمثل و 100 نانومتر الديكساميتازون) لكل تدفق جيدا والشروع في الاتجاه نحو الانخفاض بمعدل تدفق من 1 ميليلتر/s لمدة 3.5 دقيقة.
  11. نضح المتوسطة كل من الخزان وإضافة 1.4 مل من تتمثل الصيانة المتوسطة (الشكل 1 د).
  12. استبدال المتوسطة تتمثل الصيانة المتوسطة كل 48 ساعة. للتأكد من يتم استبدال جميع المتوسطة في البئر، القيام بخطوة غسيل قبل إضافة جديدة تتمثل الصيانة المتوسطة.
  13. لخطوة الغسيل، نقل اللوحة إلى حوض الغسيل ونضح المتوسطة كل من الآبار، وإضافة 400 ميليلتر للصيانة المتوسطة.
  14. بدء تدفق في اتجاه نزولي في 1 ميليلتر/s لأدنى 3.5 Aspirate جميع المتوسطة التي تظهر على الجانب الخزان من الآبار.
  15. إضافة 1.4 مل تتمثل الصيانة المتوسطة، وفي إطار من حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية ومع 5% CO2ونقل اللوحة في محطة الإرساء وبدء تدفق في الاتجاه التصاعدي بمعدل تدفق من 1 ميليلتر/s ح 48 (الشكل 1f).
    ملاحظة: تتمثل الزراعات الأحادية المستخدمة كعناصر تحكم كوكولتوريس، من أجل ضمان ظروف خاضعة للرقابة، يتم استخدام نوع ثاني من الصيانة المتوسطة، التي هي محددة لاستخدامها في كوكولتوريس مع خلايا كوبفر البشرية الأساسية. 48 ساعة بعد استبدال تتمثل البذر المتوسطة مع تتمثل الصيانة المتوسطة (يوم 3 بعد البذر)، سيتم استبدال المتوسطة الصيانة العادية تتمثل كوكولتوري الصيانة المتوسطة الثانية، خاصة في الزراعات الأحادية PHH عند مقارنة كوكولتوريس PHH وكوبفر الخلايا، كمكونات متوسطة تختلف بشكل طفيف.

3-ذوبان الجليد وبذر خلايا كوبفر وخلايا الكبد للثقافات المشتركة

  1. من أجل ضمان إجراء مقارنة دقيقة للنتائج، قارن دائماً كوكولتوريس خلية كوبفر PHH/للزراعات الأحادية PHH
  2. للذوبان كوكولتوريس خلايا كوبفر و PHH، قنينة واحدة خلايا كوبفر متقدمة دولبيكو لتعديل المتوسطة النسر (أدميم) دون الديكساميتازون ولكن تستكمل مع ذوبان تتمثل الأولى ويكمل الطلاء (كوكولتوري البذر المتوسطة) وفقا لتعليمات الموردين. تؤدي ذوبان الجليد وبذر خلايا كوبفر وخلايا الكبد في فئة الثانية مجلس الوزراء.
  3. ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل كوكولتوري البذر المتوسطة وعد الخلايا باستخدام تريبان الأزرق. تأكد من صلاحية الخلايا أكثر من 90 في المائة.
  4. تبقى الخلايا على الجليد قبل إضافتها إلى الآبار لتفادي التصاق الخلية.
  5. اتبع الإرشادات في الخطوات 2.1-2.3 لذوبان خلايا الكبد البشرية الأساسية.
  6. نقل لوحة مجمع بشكل كامل ومتوازن لحوض الغسيل ونضح المتوسطة كل من الآبار.
  7. إضافة خلايا كوبفر 60,000 و/أو خلايا الكبد 600,000 لكل بئر في إجمالي حجم 250 ميليلتر من كل من كوكولتوري البذر المتوسطة.
  8. بدء تدفق في الاتجاه نحو الانخفاض في معدل تدفق من 1 ميليلتر/s وإضافة 900 ميليلتر من كوكولتوري البذر المتوسطة لكل بئر.
  9. نقل اللوحة في محطة الإرساء داخل حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية ومع أول أكسيد الكربون 5%2.
  10. بدء تدفق في الاتجاه نحو الانخفاض في معدل تدفق من 1 ميليلتر/s ح 8، تليها عكس تدفق إلى الاتجاه الصعودي بمعدل تدفق من 1 ميليلتر/s ح 8.
  11. نقل اللوحة إلى حوض الغسيل ونضح المتوسطة كل من الآبار.
  12. إضافة 400 ميليلتر من كوكولتوري الصيانة المتوسطة الأول (أدميم دون الديكساميتازون لكن تستكمل مع ملاحق صيانة تتمثل) لكل تدفق جيدا والشروع في الاتجاه نحو الانخفاض بمعدل تدفق من 1 ميليلتر/s لمدة 3.5 دقيقة.
  13. نضح المتوسطة كل من جانب الخزان وإضافة 1.4 مل من كوكولتوري الصيانة المتوسطة الأول لكل بئر.
  14. نقل اللوحة في محطة الإرساء داخل حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية ومع 5% CO2 وبدء تدفق في الاتجاه التصاعدي بمعدل تدفق من 1 ميليلتر/s ح 48.
  15. نقل اللوحة إلى حوض الغسيل ونضح المتوسطة كل من الآبار. إضافة 400 ميليلتر من كوكولتوري الصيانة المتوسطة الثانية (متوسط "ه ويليامز" دون الديكساميتازون لكن تستكمل مع شمال البحر الأبيض المتوسط 100 الهيدروكورتيزون وتتمثل المكملات الصيانة) وبدء تدفق في اتجاه نزولي في 1 ميليلتر/s لمدة 3.5 دقيقة.
  16. نضح جميع المتوسطة التي تظهر على الجانب الخزان من الآبار.
  17. إضافة 1.4 مل من كوكولتوري الصيانة المتوسطة الثانية ونقل اللوحة إلى محطة الإرساء داخل حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية ومع أول أكسيد الكربون 5%2.
  18. بدء تدفق في الاتجاه التصاعدي بمعدل تدفق من 1 ميليلتر/s ح 48 (الشكل 1e).
  19. استبدال المتوسطة كل 48 ساعة مع كوكولتوري الصيانة المتوسطة الثانية. لضمان يتم استبدال جميع المتوسطة في البئر، نفذ خطوة غسيل قبل إضافة متوسطة جديدة.
  20. ليغسل، نقل اللوحة إلى حوض الغسيل ونضح المتوسطة كل من الآبار، وإضافة 400 ميليلتر من كوكولتوري الصيانة المتوسطة الثانية.
  21. بدء تدفق في اتجاه نزولي في 1 ميليلتر/s لأدنى 3.5 Aspirate جميع المتوسطة التي تظهر على الجانب الخزان من الآبار.
  22. إضافة 1.4 مل من كوكولتوري الصيانة المتوسطة الثانية ونقل اللوحة إلى محطة الإرساء داخل حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية ومع 5% CO2وبدء تدفق في الاتجاه التصاعدي بمعدل تدفق من 1 ميليلتر/s ح 48 (الشكل 1f).

4-إنتاج فيروس المعدية التهاب الكبد ب للدراسات الإصابة

  1. أداء هذا الجزء من البروتوكول في مستوى احتواء المعمل الثالث. هل البذر، والتغيرات المتوسطة، والمتوسطة جمع وتركيز الفيروس في فئة الثانية مجلس الوزراء.
  2. الثقافة المنتجة HBV الخلايا (على سبيل المثال، HepDE19، HepAD38) في قوارير 5-طبقة T1000 المغلفة بالكولاجين في 120 مل من DMEM/F12 كاملة (10% FBS، البنسلين/ستيبتوميسين، والأحماض الأمينية غير الأساسية، 500 ميكروغرام/مل G418، والتتراسيكلين 1 ميكروغرام/مل) حتى تصل إلى 90% كونفلوينسي.
  3. تغيير المتوسطة إلى المتوسطة التعريفي (دميم كاملة دون التتراسيكلين) للحث على إنتاج HBV.
  4. جمع متوسطة الحجم الكامل من كل 48 ساعة للانسحاب بعد 12 يوما من التتراسيكلين وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  5. تصفية المتوسطة التي تم جمعها من خلال عامل تصفية أعلى زجاجة 0.45 ميكرومتر.
  6. إضافة 8000 ربط العقيمة في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) إلى المتوسطة التي تم جمعها إلى تركيز 4% w/w نهائي ومزج بعكس 8 x-10 x واحتضان عند 4 درجة مئوية حاء 16 أجهزة الطرد المركزي في س 10,000 ز ح 1 في 4 درجات مئوية على جمع الفيروس عجلت شماعة ريسوسبيند بيليه في برنامج تلفزيوني يحتوي على 10% FBS.
  7. الجمع بين الفيروس شماعة عجلت من جميع النقاط وقت الحصاد، وطبقة من فوق وسادة سكروز 20%. الطرد المركزي في 140,000 س ز ح 16 عند 4 درجة مئوية باستخدام دوار SW28.
  8. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في برنامج تلفزيوني وتستكمل مع 10% FBS، وقاسمه وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  9. تحديد عدد نسخ الحمض النووي HBV موجودة في المادة طافية بالحمض النووي HBV qPCR (الخطوة 6).

5-الإصابة بالثقافات 3D مع HBV

  1. تؤدي الإصابات في فئة الثانية مجلس الوزراء ضمن مستوى احتواء المعمل الثالث.
  2. ذوبان الجليد على العدد المطلوب من مختبرين المحتوية على HBV في درجة حرارة الغرفة 3 أيام بعد البذر الزراعات الأحادية أو كوكولتوريس، وإضعاف الجرعة المطلوبة الفيروس في 1.8 مل تتمثل الصيانة المتوسطة أو كوكولتوري الصيانة المتوسطة الثانية الواحدة كذلك، على التوالي.
  3. هذا الفيروس المخفف 1.8 مل يكفي لخطوة الغسيل (400 ميليلتر) والاستعاضة عن المتوسط في البئر (1.4 مل). بيد أن تعدد المطلوب من الإصابة يحتاج إلى تكون معدلة لحجم الثقافة النهائية 1.6 مل.
  4. نقل اللوحة إلى حوض الغسيل ونضح المتوسطة كل من الآبار. إضافة 400 ميليلتر من المتوسطة المحتوية على HBV وبدء تدفق في اتجاه نزولي في 1 ميليلتر/s لأدنى 3.5 Aspirate الظهور المتوسطة جميع الجانب الخزان من الآبار.
  5. إضافة 1.4 مل المحتوية على HBV من الصيانة المتوسطة/كوكولتوري الصيانة المتوسطة الثانية الواحدة جيدا ونقل اللوحة إلى محطة الإرساء داخل حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية ومع أول أكسيد الكربون 5%2. بدء تدفق في الاتجاه نحو الانخفاض في معدل تدفق من 1 ميليلتر/s ح 8، تليها انعكاس للاتجاه الصعودي في معدل تدفق من 1 ميليلتر/s.
  6. 24 ساعة بعد إضافة HBV، نقل اللوحة إلى حوض الغسيل ونضح المتوسطة كل من الآبار.
  7. تغسل كل جيدا في اللوحة x 3 مع المتوسط المقابلة، وفقا لنوع الثقافة كما هو موضح في الخطوات 2.12 – 2.14، للقضاء على بقايا الفيروس من البئر. على النقيض من الخطوات 2.12 – 2.14، إضافة 1.6 مل متوسط في كل بئر لحساب حجم إضافي أخذ عينات لاستبعاد العدوى المرحل (الشكل 1 ز).
  8. وبعد هذه الخطوات الغسيل، جمع 200 ميليلتر من المتوسطة من كل بئر لتأكيد الإزالة الكاملة للعدوى HBV بالتحديد الكمي للحمض النووي HBV خارج الخلية.
  9. نقل اللوحة إلى محطة الإرساء داخل حاضنة هوميديفيد عند 37 درجة مئوية ومع أول أكسيد الكربون 5%2، والشروع في التدفق في الاتجاه التصاعدي بمعدل تدفق من 1 ميليلتر/s ح 48.
  10. في وقت لاحق، جمع ح 48 وحدة التخزين جيدا كاملة لتحليل المتلقين للمعلومات، تليها يغسل الثلاثة مع تتمثل الصيانة المتوسطة كما هو موضح في الخطوات 2.12 – 2.14. استبدال المتوسطة وتغسل كل 3 جيدا x كل 48 ساعة حتى إنهاء الخدمة التجريبية.

6-التحديد الكمي للحمض النووي HBV خارج الخلية

  1. عزل الحمض النووي المجموع من supernatants ثقافة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة بالإضافة إلى 1 ميكروغرام من الناقل الجيش الملكي النيبالي في مستوى احتواء المعمل الثالث التأكد من المنظمة الفيروس في العينات قبل نقلها إلى منطقة مختلفة.
  2. إعداد مزيج رئيسي الذي يحتوي على مزيج الرئيسي PCR الكمي، 600 نانومتر التمهيدي إلى الأمام، 600 نانومتر عكس التمهيدي، و 300 نانومتر للتحقيق.
  3. إضافة 7 ميليلتر من مزيج الرئيسي في كل بئر من صفيحة 384-جيدا.
  4. إضافة 5 ميليلتر من عينات الحمض النووي في التكرارات وعنصر تحكم القالب لا التكرارات متسلسل المخفف HBV المحتوية على الجينوم المستندة إلى بلازميد المعيار (مثلاً، بكمف-HBV) تتراوح بين 109 نسخ لكل رد فعل على 102 نسخة من كل رد فعل لكل بئر من لوحة قبكر.
  5. ضع غلاف لاصق على اللوحة والتأكد من أن كل جيدا مختومة بشكل صحيح.
  6. الطرد المركزي لوحة لمدة 1 دقيقة على 300 x ز.
  7. بدء تشغيل قبكر تشغيل وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. شروط دورة PCR الوقت الحقيقي 95 درجة مئوية لمدة دقيقة 10، تليها دورات 40 من 95 درجة مئوية عن 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
  8. قياس عدد نسخ الحمض النووي HBV داخل العينات غير معروف طبقاً للمنحنى المعياري.

7-التحديد الكمي "داخل الخلايا HBV بريجينوميك" (pg) الجيش الملكي النيبالي

  1. عزل الحمض النووي الريبي مجموع من السقالات وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. من أجل ضمان تحلل الخلية كاملة، سقالة دوامة كل x 3 ل 30 s متبوعاً بالطرد المركزي في 300 x ز 1 دقيقة بين كل فورتيكسينج. إجراء تحلل الخلية في مستوى الاحتواء المعمل الثالث التأكد من المنظمة الفيروس في العينات قبل نقلها إلى منطقة مختلفة.
  2. نسخ كدنا من الجيش الملكي النيبالي معزولة طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة.
  3. شروط دورة ريتروترانسكريبشن 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 37 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة، و 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  4. الاحتفاظ بعينات كدنا في 4 درجات مئوية للمدى القصير أو في-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  5. إعداد يمزج الرئيسي بجرنا و RPS11 التي تحتوي على كمية PCR الرئيسية ميكس والإشعال إلى الأمام وعكس بجرنا و RPS11 (تستخدم كالجينات التدبير المنزلي) بتركيز نهائي من 0.2 ميكرون.
  6. إضافة ميليلتر 7.5 من مزيج الرئيسي و 2.5 ميليلتر من كدنا كل بئر على طبق من 384-جيدا. قياس RPS11 وبجرنا لكل عينة في التكرارات وتضمين عنصر تحكم لا--القالب جيدا لكلا الجينات.
  7. ضع غلاف لاصق على اللوحة والتأكد من أن كل كذلك أغلقت تماما.
  8. الطرد المركزي لوحة لمدة 1 دقيقة على 300 x ز.
  9. إدراج اللوحة qPCR cycler وبدء qPCR تشغيل باستخدام بروتوكول PCR الكمي القياسية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. شروط دورة PCR الوقت الحقيقي 50 درجة مئوية ل 2 دقيقة، 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، تليها دورات 40 من 95 درجة مئوية عن 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
  10. حساب التعبير عن بجرنا بالنسبة RPS11.

8-الفلورة تلطيخ من مستضد الفيروسية

  1. قم بإزالة الحلقة من الاحتفاظ من البئر والسقالة مع الملقط في فئة مجلس الوزراء الثاني في مختبر الاحتواء المستوى الثالث.
  2. إصلاح السقالات التي تحتوي على الخلايا مع بارافورمالدهيد 4% في 1 مل من برنامج تلفزيوني مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في مستوى الاحتواء المعمل الثالث. ويمكن تنفيذ الخطوات التالية في منطقة مختلفة.
  3. أغسل السقالات 3 x مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  4. بيرميبيليزي الخلايا باستخدام 0.1% 100 تريتون العاشر في 1 مل من برنامج تلفزيوني عن ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  5. أغسل السقالات 3 x مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  6. كتلة غير محددة ملزمة بالحضانة للسقالات مع جيش صرب البوسنة 1% في 1 مل من برنامج تلفزيوني عن ح 16 عند 4 درجة مئوية.
  7. أغسل السقالات 3 x مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  8. أداء تلطيخ جسم الأولية باستخدام الأرنب المضادة التهاب الكبد الوبائي ب الفيروس مستضد الأساسية في إضعاف 1: 200 في جيش صرب البوسنة 1% في 1 مل من برنامج تلفزيوني ح 16 عند 4 درجة مئوية.
  9. أغسل السقالات 1 x مع 0.1% توين في 1 مل من برنامج تلفزيوني (برنامج تلفزيوني-توين) والعاشر 3 مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  10. أداء تلطيخ جسم الثانوية استخدام الماعز الأرنب المضادة مفتش (H + L) تمتز الصليب مترافق أليكسا فلور 594 الثانوية جسم في إضعاف 1:2,000 في جيش صرب البوسنة 1% في 1 مل من برنامج تلفزيوني عن ح 16 عند 4 درجة مئوية.
  11. أغسل السقالات 1 x مع 1 مل من 0.1% توين PBS و x 3 مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  12. كونتيرستين السقالات استخدام DAPI في 1 مل من برنامج تلفزيوني بتركيز 2 ميكروغرام/مل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  13. أغسل السقالات 1 x مع 1 مل من 0.1% توين PBS و x 3 مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  14. نقل السقالات على شريحة مجهر وجبل للتصوير.
  15. صورة السقالات استخدام مجهر الأسفار.

9-الإنسان الزلال أليسا

  1. أداء هذا الجزء من البروتوكول في فئة الثانية مجلس الوزراء المخصصة في مستوى الاحتواء المعمل الثالث إذا كان يعمل مع المواد المعدية.
  2. لتقييم جدوى والايض وظيفة PHH، تقييم إنتاج الزلال البشري قبل أليسا.
  3. لوحات معطف 96-جيدا مع 50 ميليلتر الواحدة جيدا جسم الإنسان المضادة الماعز المخفف 1:800 في المخزن المؤقت لطلاء (100 ملم بيكربونات/كربونات، pH 9.6). تغطي اللوحات، واحتضان ح 2 في 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  4. نضح جسم طلاء من اللوحة وغسله x 4 مع 200 ميليلتر من 0.05% توين PBS.
  5. إضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت حظر (1% جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني)، تغطي اللوحات، واحتضان لهم ح 1 في 37 درجة مئوية أو تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة 3 أشهر. للتخزين طويل الأجل، إضافة أزيد الصوديوم 0.05% إلى المخزن المؤقت حظر.
  6. نضح المخزن المؤقت حظر وتغسل س 1 مع 200 ميليلتر من 0.05% توين PBS.
  7. إضافة 50 ميليلتر العينات السابق المخفف كل بئر (1: 100). مخفف نموذج يحتوي على 1% جيش صرب البوسنة في 0.05% توين PBS. احتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: احتضان المعايير في نفس الوقت العينات. تركيز يتراوح من 500 – 0.488 ينصح نانوغرام/مليلتر (تخفيف المسلسل 1:2). أداء جميع تخفيف المسلسل الزلال البشري في عينة مخفف.
  8. نضح العينات المأخوذة من اللوحة وغسله x 4 مع 200 ميليلتر من 0.05% توين PBS.
  9. إضافة 50 ميليلتر من جسم الإنسان المضادة الزلال مترافق HRP الماعز المخفف سابقا المضيفين في عينة مخفف. احتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  10. نضح الضد من اللوحة وغسله x 6 مع 200 ميليلتر من 0.05% توين PBS.
  11. إضافة 100 ميليلتر من كاشف TMB، وحالما تماما وضع أعلى المعايير، إضافة 100 ميليلتر م 1 ح2حتى4 التوقف عن رد فعل اللونية.
  12. قراءة امتصاص 450 نانومتر على قارئ لوحة 96-جيدا للتحليل.

10-انترلوكين (إيل) 6 وعوامل نخر الورم (تنف) α الإنتاج في الثقافات المشارك 3D

  1. أداء هذا الجزء من البروتوكول في فئة الثانية مجلس الوزراء المخصصة في مستوى الاحتواء المعمل الثالث إذا كان يعمل مع المواد المعدية.
  2. تحديد حجم إنتاج IL6 و TNFα لتقييم الأداء الوظيفي وبقاء خلايا كوبفر الأولية. للحث على إنتاج هذه السيتوكينات بخلايا كوبفر، تعامل كوكولتوريس مع 1 ميكروغرام/مل lipopolysaccharide (LPS) 9 د بعد البذر في متوسطة الصيانة كوكولتوري الثاني لمدة 48 ساعة.
  3. في اليوم 11 بعد البذر، حصاد المتوسطة من كل بئر وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  4. قياس تركيز IL6 و TNFα على المديين المتوسط والثقافة قبل فحص مناسبة وطبقا لإرشادات الشركة المصنعة.

Representative Results

يصف لنا منصة بسيطة ومرنة لثقافة طويلة الأجل خلايا كوبفر البشرية الأولية و/أو خلايا الكبد والعدوى مع HBV. خلايا الإنسان الأولية هي المصنف على السقالات البوليسترين المغلفة بالكولاجين داخل تجميع لوحة موائع جزيئية، التي بيرفوسيس باستمرار الخلايا مع النمو المتوسط (الشكل 1a).

يمكن الحفاظ على PHH، التي عادة ما تكون فقط مستقرة لفترة محدودة من الزمن في نظم الثقافة التقليدية، وظيفيا لفترات طويلة من الزمن. الزلال البشري، الذي يفرز بواسطة خلايا الكبد الوظيفية ويعتبر علامة أفضل لتقييم الأيض الكبدي، ستابلي والغاية أعرب عن الثقافات 3D حتى اليوم 40 بعد البذر (الشكل 2). كوكولتوريس، يمكن تقييم وظائف خلية كوبفر والجدوى من إفراز السيتوكينات محددة (مثلاً، IL6 و TNFα). لقياس إنتاج سيتوكين، من المستحسن استخدام وسائل الكشف على أساس الاستيلاء على لبس-الحث على كوكولتوريس (الشكل 3).

وتشكل الخلايا الكبدية ميكروتيسويس، عادة في غضون 3 أيام من البذر من PHH، مما يدل على كاناليكولي الصفراء الوظيفية واستقطاب الخلية كاملة (الشكل 2). بالإضافة إلى الإبقاء على الأيض الخلوية الفسيولوجية، تصبح هذه الثقافات استثنائية عرضه للإصابة بالتهاب. الحمض النووي HBV وأخرى علامات الفيروسية، خلافا لأنظمة الثقافة الأخرى، تصبح سهولة الاكتشاف من اليوم الثاني بعد الإصابة (الشكل 4). بالإضافة إلى علامات يفرز العدوى الفيروسية، يمكن استردادها من الثقافات المحتوية على تتمثل السقالات والمستخدمة للكشف عن المستضدات الفيروسية الفلورة (مثلاً، HBsAg، HBcAg) (الشكل 4). حيث تتطلب الثقافات التقليدية تتمثل التطعيم مع جنرال الكتريك HBV 500 على الأقل كل خلية، وإضافة 2% [دمس] و 4% شماعة، عدد قليل من HBV 0.05 جنرال الكتريك قادرين على بدء الإصابة في الثقافات ثلاثي الأبعاد دون الاشتراط [دمس] أو شماعة (الشكل 4).

Figure 1
رقم 1: التشكيل ثلاثي الأبعاد الكبد على رقاقة الثقافات. () هذا تخطيط تخطيطي للجمعية العامة لوحة الثقافة بغية ضمان إنشاء تداول موائع جزيئية. (ب) عرض عن قرب آبار الثقافة، بما في ذلك يظهر هذا الفريق ورق الترشيح والسقالة وحلقة من الاحتفاظ. (ج) يظهر هذا الفريق عملية الموازنة لوحة قبل البذر في الثقافات. وتظهر القادم فريقي عملية البذر للزراعات الأحادية تتمثل (د) و (ه) خلية كوبفر تتمثل/كوكولتوريس. (و) هذا الفريق يوضح خطوات الغسيل المتورطين في التغييرات متوسطة. (ز) يظهر هذا الفريق إنشاء HBV العدوى، بما في ذلك إزالة العدوى. س. م. = بذر المتوسطة، م. م. = متوسط الصيانة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: صلاحية تشكيل وتتمثل وظائف الكبد ميكروتيسوي. () يظهر هذا الفريق صور برايتفيلد طولية للزراعات الأحادية تتمثل ثلاثية الأبعاد مما يدل على تشكيل ميكروتيسوي بعد البذر. (ب) يظهر هذا الفريق تصوير الفلورة الثقافات لنوى (أزرق) والزلال البشري (أخضر). (ج) هذا الفريق يظهر الزلال مجموع طولية، كذلك كل خلية يعدل إنتاج الزلال، خلال 40 يوما من الزراعات الأحادية تتمثل، كما يحدده أليسا. البيانات المعروضة هي يعني ± التنمية المستدامة. وهذا الرقم هو مقتبس من أورتيغا-برييتو et al.4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: وظائف خلية كوبفر في كوكولتوريس ثلاثي الأبعاد- وتظهر هذه اللوحات إفراز () IL6 و (ب) TNFα في الزراعات الأحادية تتمثل وخلية كوبفر تتمثل/كوكولتوريس 11 يوما بعد البذر ردا على لبس مناشئ المضافة في يوم 9 وظيفة البذر، كما تحدد باستخدام "المغناطيسية البشرية" لوميناكس المقايسة. وهذا الرقم هو مقتبس من أورتيغا-برييتو et al.4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: العدوى التهاب في الكبد على رقاقة الثقافات. () هذا الفريق يظهر الكشف المجهري الفلورة هبكاج (أحمر)، HBsAg (الأخضر)، ونوى (أزرق) 10 أيام بعد عدوى الثقافات مع HBV. (ب) يظهر هذا الفريق قابلية الثقافات لعدوى التهاب استخدام التعدديات المختلفة من العدوى، كما يحدده إجراء تقييم كمي للحمض النووي HBV في supernatants ثقافة. (ج) يظهر هذا الفريق التحديد الكمي لتراكم HBV بجرنا بالنسبة إلى التدبير المنزلي الجين RPS11 طولية. البيانات المعروضة هي يعني ± التنمية المستدامة. وهذا الرقم هو مقتبس من أورتيغا-برييتو et al.4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

التحديات في الحفاظ على الثقافات طويلة الأجل من PHH دفعت تطوير عدة نماذج الثقافة مع زيادة وظائف وطول العمر، كل العارضة التفاضلية مزاياه وعيوبه. هو الآن على نطاق واسع أن الثقافات 2D ثابت من PHH هي محاكاة بعض جوانب البيولوجيا تتمثل لكميات محدودة جداً من الوقت. وهكذا، ميكروباتيرنيد كوكولتوريس12،13،14،كروي الثقافات15، و 3D الكبد على رقاقة الثقافات16،17 سرعة استبدال هذه الأنظمة الأساسية. خاصة عند دراسة الأمراض المعدية، التي قد coevolved مع المضيفة لهم الاستفادة من ميكرونفيرونمينتس محددة، الحاجة إلى توفير بيئات فسيولوجية يرتكز على طبيعة غالباً ما تحد من استزراع الإنسان-تروبيك الأمراض المعدية، بما في ذلك فيروس التهاب الكبد الوبائي HBV والملاريا.

أن الخطوة الأكثر أهمية في أداء 3D الكبد على رقاقة الثقافات هو نوعية أنواع الخلايا الأولية المصدر في البداية. وينبغي اختبار هذه الخلايا لقدرتها على الالتزام وينبغي أن تستخدم فقط بلاتيابل PHH الكثير بغية ضمان تشكيل الأنسجة ناجحة وتوليد ثقافة. على الرغم من أن يمكن استخدامها PHH طازجة معزولة، على تجميد عادة ما تكون معقدة وتتطلب المجمدات الخاصة تسيطر على معدل.

خلافا للثقافات 2D التقليدية الثابتة، لا يكاد الخلفية الوراثية المضيفة فيما يتعلق بالقابلية للإصابة بالتهاب، وجميع الجهات المانحة تتمثل اختبارها حتى الآن قادراً على تأسيس HBV العدوى4.

حتى ولو HBV المستمدة من المريض يحدد الإصابات الثقافات 3D، لا بد من الاستفادة من عجل شماعة والسكروز وسادة-تنقية HBV كلما HBV إيندوسيبلي منتج للخلية باستخدام خطوط لإنتاج لقاح الفيروسي. لا تؤدي الإصابة بسهولة supernatants ثقافة الخلية مباشرة تطبيق 3D الكبد على رقاقة الثقافات، أما من خلال وجود عوامل مثبطة أو بسبب عدم توافق من عوامل النمو الحالي مع خلايا الكبد،. بالإضافة إلى ذلك، عند اختيار لقاح فيروسي المستمدة من المريض، مصل فقط ينبغي أن تستخدم، منذ البلازما حتما يتخثر ويسد تداول موائع جزيئية منهاج الثقافة.

بغض النظر عن العدوى الفيروسية المستخدمة، ضمان استمرارية الخلوي والتمايز، فضلا عن ضمان الإزالة الكاملة للعدوى HBV الأولية، هو المفتاح لنجاح دراسات عدوى طويلة الأجل. يتم أخذ العينات الطريقة الأكثر ملاءمة للقيام بذلك الثقافات بعد الإطاحة بالعدوى الفيروسية، فضلا عن قياس مستويات ألبومين المصل البشري طوال فترة الثقافة. من المذكرة، وبالمثل لجميع منصات وصف أخرى، الإصابة بالتهاب، متى تم إنشاؤه، لا يسهل ينتشر إلى الخلايا مصابة. الآلية الأساسية لهذا لا يزال بعيد المنال نظراً للإصابة HBV المجراة في سهولة يصيب غالبية خلايا الكبد داخل الكبد.

فيما يتعلق كوكولتوريس خلايا كوبفر و PHH، فمن المستحسن إجراء اختبارات الكثير من خلايا كوبفر تقييم إفراز IL6 و TNFα استجابة للتحفيز لبس، منذ ليس كل الجهات المانحة خلية كوبفر متوفرة تجارياً استجابة متساوية.

الأهم من ذلك، لجميع من العلاج بالعقاقير أو الإصابة الأولى للثقافات مع HBV، الحجم الإجمالي للبئر (1.4 مل)، كذلك اعتبارا من القناة موائع جزيئية (0.2 مل)، يجب أن تؤخذ في الاعتبار في حساب تركيزات العقاقير أو العدوى. ضمانا لجرعات دقيقة، يتم تنفيذ خطوة الغسيل مع المتوسطة التي تتضمن HBV أو المخدرات بغية رئيس القناة موائع جزيئية.

ويستخدم منصة تستخدم PHH 600,000 الواحد جيدا، مما يضمن خلايا الكبد متعدد الطبقات داخل السقالات. على الرغم من أن عدد الخلايا يمكن أن تختلف، تركيز خلية المختار يضمن تحقيق أفضل النتائج. تنسيق لوحة تحمل مجموعة سقالات 12، التي يمكن ترقيتها إلى السقالات 36. ومع ذلك، نظراً لمتطلبات موائع جزيئية، الارتقاء إلى أعلى الأرقام جيدا لا يمكن حتى الآن.

باستخدام هذه النهج، يمكن الحفاظ الثقافات مع الأداء الأمثل الخلية لمدة 40 يوما على الأقل، التي، حتى الآن، ويوفر فرصاً غير مسبوقة تقييم المرشحين المخدرات الرواية، فضلا عن دراسة التفاعل المعقد بين الخلية الكبدية المختلفة السكان أثناء الإصابة بالتهاب.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل بمنحه بداية من "مجلس البحوث الأوروبية" (637304)، على ويلكوم ترست المحقق جائزة (104771/Z/14/Z)، والابتكارات الحيوية CN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
William's E Medium, no phenol red GIBCO A12176-01
Hepatocyte Thaw Medium GIBCO CM7500
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements GIBCO CM3000
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements GIBCO CM4000
DMEM/F-12 GIBCO 11320-033
Advanced DMEM GIBCO 12491023
DPBS, no calcium, no magnesium GIBCO 14190-144
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x GIBCO 11140050
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) GIBCO 15140-122
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture SIGMA 12106C
Hydrocortisone SIGMA H0888
Trypan blue Merck T8154
Collagen from calf skin Merck C9791
G418 SIGMA G418-RO
Tetracycline SIGMA T3258
Polyethylene glycol 8000 SIGMA P2139
Sucrose SIGMA SO389
Sodium carbonate anhydrous SIGMA 451614-25G
Sodium bicarbonate SIGMA S5761
Sodium azide SIGMA S2002-5G
Sulfuric acid, 99.999% SIGMA 339741
4% Paraformaldehyde SIGMA 252549
Triton-X 100 SIGMA X100
Tween 20 SIGMA P1379
DAPI SIGMA D9564
Albumin (human) SIGMA A9731
Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated Fisher Scientific BP9701-100
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen P36930
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG Applied Biosystems 4440040
SYBR Select Master Mix Applied Biosystems 4472903
Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 InvivoGen tlrl-eklps
Name Company Catalog Number Comments
Kits/Consumables
Sterile membrane CN Bio innovations LC-SC
LiverChip Perfusion cell culture plate CN Bio innovations LC12
LiverChip culture plate lid CN Bio innovations LC-SC
Sterile round filter paper CN Bio innovations LC-SC
Cell attachment scaffold CN Bio innovations LC-SC
Retaining ring CN Bio innovations LC-SC
Sterile plunger CN Bio innovations LC-ST
Dneasy blood & tissue kit Qiagen 69506
Rneasy mini kit Qiagen 74106
Human Magnetic Luminex assay R&D Systems
1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution ThermoFisher Scientific 34028
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit ThermoFisher Scientific 4368814
QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set Qiagen 1048147 Containing RNA carrier
Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile Millipore (Merck) PFHYS1008
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Life technologies 4309849
MicroAmp Optical Adhesive Film Life technologies 4311971
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates ThermoFisher Scientific 442404
Sealing Tape for 96-Well Plates ThermoFisher Scientific 15036
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane ThermoFisher Scientific 295-3345
Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost Fisher Scientific FB58628
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm Beckman Coulter 344058
Name Company Catalog Number Comments
Primary cells / Cell lines
Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified Thermo Fisher Scientific HMCPTS
Cryopreserved Human Kupffer Cells Thermo Fisher Scientific HUKCCS
HepDE19 cell line Haitao Guo (Indiana University, IN, USA)
Name Company Catalog Number Comments
Primers/Probes/Standards
HBV DNA forward primer Invitrogen 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'
HBV DNA reverse primer Invitrogen 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'
HBV DNA probe Invitrogen 5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA
pgRNA forward primer Invitrogen 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'
pgRNA reverse primer Invitrogen 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'
RPS11 forward primer Invitrogen 5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'
RPS11 reverse primer Invitrogen 5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'
pCMV-HBV Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA)
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal) DAKO discontinued Lot 10102505
Human Albumin Antibody, A80-129A Bethyl Laboratories. inc A80-129A
Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P Bethyl Laboratories. inc A80-229P
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific # A-11072 Lot 1431810
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
LiverChip Vacuum pump CN Bio innovations LC-PN
LiverChip Pneumatic Hookup CN Bio innovations LC-PN
LiverChip platform CN Bio innovations LC-PN
LiverChip plate washing dock CN Bio innovations
Autoclavable metal forceps VWR 232-0106
Vortex Genie 2 Scientific industries SKU: SI-0236
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge Thermo Scientific 75004500
SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow MGE worldwide  SAM12/01010101
NUAIRE 5800 SERIES incubator NUAIRE NU-5841
Automated precision torgue CN Bio innovations
Manual torque CN Bio innovations
LiverChip compressor CN Bio innovations
Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1 Luminex
Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block ThermoFisher Scientific Millipore™ 40-285
FluoStar Optima Plate Reader BMG Labtech
KOLVER Precision electric screwdrivers VTECH ltd FAB10RE/FR
KOLVER Power supply VTECH ltd EDU1FR
BAMBI VTS75D Air Equipment Discontinued
Integra Vacuboy INTEGRA
ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block ThermoFisher Scientific 4453536

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verrier, E. R., Colpitts, C. C., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. F. Cell Culture Models for the Investigation of Hepatitis B and D Virus Infection. Viruses. 8 (9), (2016).
  2. Elaut, G., et al. Molecular mechanisms underlying the dedifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures. Current Drug Metabolism. 7 (6), 629-660 (2006).
  3. Konig, A., et al. Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes. Journal of Hepatology. 61 (4), 867-875 (2014).
  4. Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682 (2018).
  5. Allweiss, L., Dandri, M. The Role of cccDNA in HBV Maintenance. Viruses. 9 (6), (2017).
  6. Guo, J. T., Guo, H. Metabolism and function of hepatitis B virus cccDNA: Implications for the development of cccDNA-targeting antiviral therapeutics. Antiviral Research. 122, 91-100 (2015).
  7. Lucifora, J., et al. Direct antiviral properties of TLR ligands against HBV replication in immune-competent hepatocytes. Scientific Reports. 8 (1), 5390 (2018).
  8. Hosel, M., et al. Hepatitis B Virus Activates Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Supporting Hepatocyte Survival and Virus Replication. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (3), 339-363 (2017).
  9. Mazza, G., et al. Rapid production of human liver scaffolds for functional tissue engineering by high shear stress oscillation-decellularization. Scientific Reports. 7 (1), 5534 (2017).
  10. Hang, T. C., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G., Stolz, D. B. Lipids promote survival, proliferation, and maintenance of differentiation of rat liver sinusoidal endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (3), G375-G388 (2012).
  11. Hwa, A. J., et al. Rat liver sinusoidal endothelial cells survive without exogenous VEGF in 3D perfused co-cultures with hepatocytes. The FASEB Journal. 21 (10), 2564-2579 (2007).
  12. Khetani, S. R., Bhatia, S. N. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).
  13. March, S., et al. Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens. Nature Protocols. 10 (12), 2027-2053 (2015).
  14. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
  15. Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
  16. Griffith, L. G., Wells, A., Stolz, D. B. Engineering liver. Hepatology. 60 (4), 1426-1434 (2014).
  17. Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).

Tags

الجهاز موائع جزيئية علم المناعة والعدوى، العدد 144، فيروس التهاب الكبد ب،، زراعة الأنسجة، الجهاز على شريحة، والهندسة الحيوية، وخلايا الكبد، وخلايا كوبفر
الثقافات "الكبد على رقاقة" خلايا الكبد الأولية وخلايا كوبفر للعدوى بفيروس التهاب الكبد B
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ortega-Prieto, A. M., Skelton, J.… More

Ortega-Prieto, A. M., Skelton, J. K., Cherry, C., Briones-Orta, M. A., Hateley, C. A., Dorner, M. "Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection. J. Vis. Exp. (144), e58333, doi:10.3791/58333 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter