Summary
Målet med detta protokoll är att ge en steg för steg guide för att utföra 3-D ”lever-på-ett-chip” infektion experiment med hepatit B-virus.
Abstract
Trots den enastående smitta av hepatit B virus (HBV) in vivo där endast tre virala arvsmassan kan resultera i en kronicitet av experimentellt infekterade schimpanser, kräver mest in vitro-modeller flera hundratals till tusentals virala genomer per cell i för att initiera en övergående infektion. Dessutom tillåter statisk 2D kulturer av primära humana hepatocyter (PHH) endast korttidsstudier på grund av deras snabba Dedifferentiering. Här beskriver vi 3D lever-på-ett-chip kulturer av PHH, antingen i monokulturer eller i cocultures med andra nonparenchymal levern-bosatt celler. Dessa erbjuder en betydande förbättring att studera långsiktiga HBV-infektioner med fysiologiska värden cell svaren. Förutom att underlätta drog effektstudier, toxikologisk analys och utredningar om patogenes, möjliggör dessa mikroflödessystem kultur system utvärdering av läkande terapier för HBV-infektion som syftar till att eliminera kovalent stängd, cirkulär (ccc) DNA. Presenterade metoden beskriver utformningen av PHH monokulturer och PHH/Kupffers samtidig cellkulturer, deras infektion med renat HBV och analysen av värd svar. Denna metod är särskilt lämpligt att utvärderingen av långsiktiga effekter av HBV-infektion, behandling kombinationer och patogenes.
Introduction
Studien av HBV har komplicerats av dålig känslighet av kultur system, som kräver flera hundratals till tusentals HBV genomet kopior per cell att initiera infektion1. Dessutom primära humana hepatocyter generellt är exceptionellt bräcklig och dedifferentiate snabbt under konventionella kulturer2. Detta är främst på grund av att de platt och hård plast ytorna inte efterlikna naturliga extracellulära miljöer finns i levern och den allmänna avsaknaden av syresättning av kulturerna i avsaknad av mikrofabricerade cirkulation. Konventionell statisk hepatocyte kulturer på kollagen-belagda plattor snabbt dedifferentiate och förlorar sin känslighet för HBV-infektion3. Här, vi beskriver set-up och infektion i PHH odlas i 3D lever-på-ett-chip kulturer, vilket är väldigt fördelaktigt över konventionella 2D statisk PHH kulturer på kollagen-belagda plattor på grund av deras utökade metabola och funktionell kompetens, underlätta långsiktiga kulturer av minst 40 dagar4. I det här systemet är PHH seedade på kollagen-belagd ställningar, som är ständigt perfusion med odlingsmedium att leverera syre och näringsämnen till cellerna. Även om alternativa kultur system för PHH baserade på komplexa cocultures av murina fibroblaster eller 3D tillväxt i spheroids har validerats och är mottagliga för HBV-infektion med multiplicities av infektion av 500 genomet motsvarigheter (GE) av HBV per cell, 3D lever-på-ett-chip kulturer förbli den enda in vitro-modellsystem mottagliga till 0,05 GE av HBV per cell4. Detta underbyggs dessutom av nödvändigheten av att använda höga koncentrationer av dimetyl sulfoxid (DMSO) och polyetylenglykol (PEG) för att upprätta HBV-infektion i dessa kulturer, vilket är onödigt för infektion av 3D lever-på-ett-chip kultur system 4. bland de stora kännetecknen av HBV infektion är cccDNA poolen, som fungerar som transkriptionell mallen för alla de novo–producerade virioner5,6. Även om cccDNA kan upptäckas i konventionella hepatocyte kulturer7,8, det är fortfarande oklart huruvida regleringen av cccDNA och några behandlingsmetoder som syftar till dess eliminering är återgetts i delvis eller helt dedifferentiated hepatocyter. Vi har visat att cccDNA bildas funktionellt i 3D lever-på-ett-chip kulturer svarar på fysiologiska stimuli och kan riktas genom att störa tillgängligheten av transkriptionell maskiner till cccDNA genomet4.
Värd för Svaren till HBV-infektion i 3D lever-på-ett-chip härma de observerats hos HBV-infekterade patienter, möjliggör identifiering av biomarkörer för infektion, samt terapeutisk framgång. Bland de unika funktionerna i levern-på-ett-chip kulturer är förmågan att utvärdera långsiktiga värd Svaren mellan PHH och andra nonparenchymal celler i levern, inklusive Kupffers celler4, stjärnformade celler9och levern sinusformad endotelceller10,11. Detta ger en unik möjlighet att utvärdera cell/cell interaktioner i en komplex 3D mikromiljö.
Dessutom underlättar perioden utökade kultur av denna plattform utvärderingen av sekventiell läkemedelsbehandlingar och deras inverkan på HBV uthållighet, som inte är möjliga med konventionella hepatocyte kultur system.
Det här protokollet beskriver hur 3D lever-på-ett-chip kulturer genereras, antingen för monokulturer av PHH eller för cocultures av PHH med Kupffers celler. Dessutom beskriver vi produktionen av renat HBV för låg-mångfald-av-infektion studier, samt den efterföljande analysen av värd- och virala svar.
Protocol
1. montering och Jämviktstiden av plattor
- Se till att både kompressorn och vakuumpumpen är associerad med den LiverChip plattformen är påslagna. Utför montering och Jämviktstiden av plattorna i en klass II skåp.
- Montera aseptiskt mikroflödessystem plattorna genom att placera ett sterilt membran mellan basen plattan och lägga till den väl som innehåller övre plattan (figur 1a).
- Se till att den sterila membranen smidigt vilar på de två stiften på bottenplattan, sedan ojämn membran placering kompromisser mikroflödessystem cirkulationen.
- Lägg en steril platta lock och dra åt skruvarna vid basen av plattan med en automatiserad precision vridmoment till 33 lb med en spiral åtdragning sekvens. Se till att alla skruvar är åtdragna till 35 lb med hjälp av en manuell vridmoment. Under detta steg, se till att skruvarna är åtdragna symmetriskt (figur 1a).
- Prewarm hepatocyte sådd medel innehållande Williams E medel, primära hepatocyte upptining och plätering kosttillskott, 5% fetalt bovint serum (FBS) och 1 µM dexametason till 37 ° C innan grundningen.
- Prime den helt monterade plattan genom att placera den i tvätt dock och lägga 400 µL av hepatocyte sådd medium till reservoaren sida av varje brunn. Se till att plattan snäpper tvätt dock helt.
- Initiera flöde i uppåtgående riktning för 3,5 min på 1 µL/s. Lyckad funktion mikroflödessystem cirkulationen kan fastställas genom de röda indikatorerna vid sidan av plattan (figur 1a).
- När mediet pumpas till cell tillväxt sida av plattan, säkerställa rätt montering av flöde kanalen, lägga till ytterligare 1,2 mL av hepatocyte sådd medium.
- Noggrant överföra plattan i dockningsstationen inom en befuktade inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 och initiera flöde i riktning uppåt med en flödeshastighet av 1 µL/s för 16 h (figur 1 c).
- Överföra plattan till tvätt dock och eliminera bubblorna i brunnen genom pipettering försiktigt upp och ner.
- Lägga till en steril, runda filterpapper, följt av en cell fastsättning byggnadsställning och en låsringen, till varje brunn med hjälp av steril pincett. Tryck ner varje brunn med en steril kolven för att behålla ringen och ställningar låses på plats (figur 1b).
- Aspirera alla medium och tillsätt 400 µL av förvärmd hepatocyte sådd medium försiktigt över schavotten och initiera flöde i nedåtgående riktning för 3,5 min på 1 µL/s.
- Aspirera alla medium pumpas ur reservoaren sidan av plattan. Detta steg är nödvändigt att ersätta mediet som ingår i kanalen flöde.
- Tillsätt 1,4 mL hepatocyte sådd medium till varje brunn innan han återvände plattan till dockan att slutföra den totala volymen per brunn. Volymen per brunn är nu 1,6 mL (1,4 mL i brunnen och 0,2 mL i kanalen flöde).
2. upptining och seedning av hepatocyter för monokulturer
- Prewarm hepatocyte upptining medium och hepatocyte sådd medium till 37 ° C innan upptining en injektionsflaska med PHH enligt leverantörernas anvisningar. Använd en centrifug i rumstemperatur under detta steg för att undvika plötsliga temperaturförändringar. Utföra upptining och sådd av hepatocyter som en klass II-skåp.
- Att resuspendera cellerna i 1 mL av hepatocyte sådd medium och räkna cellerna använder trypan blå. Säkerställa att livskraften i cellerna är över 90%.
- Hålla cellerna på is tills de läggs till brunnarna.
- Överföra skakad och färdigmonterad plattan till tvätt dock och aspirera alla medium från brunnarna.
- Lägg till 600.000 hepatocyter till varje brunn i en 500 µL volym av hepatocyte sådd medium.
- Initiera flöde i nedåtgående riktning med en flödeshastighet av 1 µL/s och föra den totala volymen i brunnen till 1,6 mL genom att lägga till 900 µL av hepatocyte sådd medium.
- Överföra plattan till dockningsstationen inom en befuktade inkubator vid 37 ° C och med 5% CO2.
- Initiera flöde i nedåtgående riktning med en flödeshastighet av 1 µL/s för 8 h, följt av ett flöde återföring i uppåtgående riktning med en flödeshastighet av 1 µL/s för 8 h.
- Överföra plattan till tvätt dock och aspirera alla medium från brunnarna.
- Tillsätt 400 µL av hepatocyte underhåll medium (Williams E medium kompletteras med hepatocyte underhåll kosttillskott och 100 nM dexametason) till varje brunn och initiera flöde i nedåtgående riktning med en flödeshastighet av 1 µL/s för 3,5 min.
- Sug ut alla medium från reservoaren och lägga till 1,4 mL hepatocyte underhåll medium (figur 1 d).
- Ersätta mediet med hepatocyte underhåll medium varje 48 h. För att säkerställa alla medium i brunnen ska ersättas, utföra en tvätt steg före tillsats av färska hepatocyte underhåll medium.
- För tvätt steg, överföra plattan till tvätt dock, aspirera alla medium från brunnarna och tillsätt 400 µL av underhåll medium.
- Initiera flöde i nedåtgående riktning med 1 µL/s för 3,5 min. Aspirera alla medium som förekommer på reservoaren sida av brunnarna.
- Lägga till 1,4 mL av hepatocyte underhåll medium och, inom en befuktade inkubator vid 37 ° C och med 5% CO2, överföra plattan i dockningsstationen och initiera flöde i riktning uppåt med en flödeshastighet av 1 µL/s för 48 h (figur 1f).
Obs: För hepatocyte monokulturer används som kontroller för cocultures, för att säkerställa kontrollerade förhållanden, används en annan typ av underhåll medium, som är specifik för användning i cocultures med primära mänskliga Kupffers celler. 48 h efter ersättande den hepatocyte sådd medium med hepatocyte underhåll medium (dag 3 efter sådd), regelbunden hepatocyte underhåll mediet kommer att ersättas med coculture underhåll medium II, särskilt i monokulturer av PHH när jämförande till cocultures av både PHH och Kupffers celler, som medium komponenterna skiljer sig något.
3. upptining och seedning Kupffers celler och hepatocyter för samtidig kulturer
- För att säkerställa en korrekt jämförelse av resultat, jämför alltid PHH/Kupffers celler cocultures till PHH monokulturer
- För cocultures av PHH och Kupffers celler, Tina en injektionsflaska av Kupffers celler i avancerade Dulbeccos ändrade örnens medium (AdDMEM) utan dexametason men kompletteras med primära hepatocyte upptining och plätering kosttillskott (coculture sådd medium) enligt leverantörernas instruktioner. Utföra upptining och sådd av Kupffers celler och hepatocyter som en klass II-skåp.
- Att resuspendera cellerna i 1 mL av coculture sådd medium och räkna cellerna använder trypan blå. Säkerställa att livskraften i cellerna är över 90%.
- Hålla cellerna på is innan du lägger till dem till brunnarna att undvika celladhesion.
- Följ instruktionerna i steg 2.1 – 2.3 för upptining av primära humana hepatocyter.
- Överföra skakad och färdigmonterad plattan till tvätt dock och aspirera alla medium från brunnarna.
- Lägg till 60.000 Kupffers celler och 600.000 hepatocyter till varje brunn i en total volym på 250 µL varje coculture sådd medium.
- Initiera flöde i nedåtgående riktning med en flödeshastighet av 1 µL/s och tillsätt 900 µL av coculture sådd medium till varje brunn.
- Överföra plattan i dockningsstationen inom en befuktade inkubator vid 37 ° C och med 5% CO2.
- Initiera flöde i nedåtgående riktning med en flödeshastighet av 1 µL/s för 8 h, följt av flödet återföring i uppåtgående riktning med en flödeshastighet av 1 µL/s för 8 h.
- Överföra plattan till tvätt dock och aspirera alla medium från brunnarna.
- Tillsätt 400 µL av coculture underhåll medium I (AdDMEM utan dexametason men kompletterade med hepatocyte underhåll kosttillskott) till varje brunn och initiera flöde i nedåtgående riktning med en flödeshastighet av 1 µL/s för 3,5 min.
- Aspirera alla medium från reservoaren sida och lägga till 1,4 mL coculture underhåll medium I till varje brunn.
- Överföra plattan i dockningsstationen inom en befuktade inkubator vid 37 ° C och med 5% CO2 och initiera flöde i riktning uppåt med en flödeshastighet av 1 µL/s för 48 h.
- Överföra plattan till tvätt dock och aspirera alla medium från brunnarna. Tillsätt 400 µL av coculture underhåll medium II (Williams E medium utan dexametason men kompletterade med 100 nM hydrokortison och hepatocyte underhåll kosttillskott) och initiera flöde i nedåtgående riktning med 1 µL/s för 3,5 min.
- Aspirera alla medium som förekommer på reservoaren sida av brunnarna.
- Lägga till 1,4 mL coculture underhåll medium II och överföra plattan i dockningsstationen inom en befuktade inkubator vid 37 ° C och med 5% CO2.
- Initiera flöde i riktning uppåt med en flödeshastighet av 1 µL/s för 48 h (figur 1e).
- Ersätta mediet varje 48 h med coculture underhåll medium II. För att säkerställa alla medium i brunnen ska ersättas, utföra en tvätt steg före tillsats av färskt medium.
- Att tvätta, överföra plattan till tvätt dock, aspirera alla medium från brunnarna och tillsätt 400 µL av coculture underhåll medium II.
- Initiera flöde i nedåtgående riktning med 1 µL/s för 3,5 min. Aspirera alla medium som förekommer på reservoaren sida av brunnarna.
- Lägg till 1,4 mL coculture underhåll medium II och överföra plattan i dockningsstationen inom en befuktade inkubator vid 37 ° C och med 5% CO2, och initiera flöde i riktning uppåt med en flödeshastighet av 1 µL/s för 48 h (figur 1f).
4. produktion av en infektiös hepatit B Virus infektion studier
- Utföra denna del av protokollet i en inneslutningsnivå III lab. Gör sådd, medelstora förändringar, medellång insamling och virus koncentration i en klass II-skåp.
- Kultur HBV-producerande celler (t.ex. HepDE19, HepAD38) i kollagen-belagd T1000 5-lager kolvar i 120 mL komplett DMEM/F12 (10% FBS, penicillin/steptomycin, onödiga aminosyror, 500 μg/mL G418 och 1 μg/mL tetracyklin) tills de når 90% konfluens.
- Ändra på medellång till induktion medium (komplett DMEM utan tetracyklin) för att inducera HBV produktion.
- Samla in komplett medium volym varje 48 h för 12 dagar efter uttag av tetracyklin och lagra det vid 4 ° C.
- Filtrera det insamlade mediet genom ett 0,45 µm flaska övre filter.
- Lägga till sterila PEG 8000 i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) insamlade medellång till en slutlig koncentration på 4% w/w, blanda genom att vända 8 x-10 x och inkubera vid 4 ° C för 16 h. Centrifugera vid 10 000 x g för 1 h vid 4 ° C att samla in PEG-fällt viruset och resuspendera pelleten i PBS som innehåller 10% FBS.
- Kombinera PEG-fällt viruset från alla skörd tidpunkter och lager det ovanpå en 20% sackaros kudde. Centrifugera 140 000 x g under 16 timmar vid 4 ° C med en SW28 rotor.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i PBS kompletteras med 10% FBS och delprov och förvara den vid-80 ° C.
- Avgöra hur HBV DNA kopia många närvarande i supernatanten av HBV-DNA qPCR (steg 6).
5. infektion av 3D kulturer med HBV
- Utföra infektioner i en klass II skåp inom en inneslutningsnivå III lab.
- 3 dagar efter sådd av monokulturer eller cocultures, Tina antalet krävs för HBV-innehållande alikvoter vid rumstemperatur och späd krävs virus dosen i 1.8 mL hepatocyte underhåll medium eller coculture underhåll medium II per brunn, respektive.
- Detta 1,8 mL utspädd virus räcker för steget tvätt (400 µL) och byte av medium i brunnen (1,4 mL). Dock måste krävs multiplicityen av infektion anpassas till kontot för den slutliga kultur volymen 1,6 ml.
- Överföra plattan till tvätt dock och aspirera alla medium från brunnarna. Tillsätt 400 µL av HBV-innehållande medium och initiera flöde i nedåtgående riktning med 1 µL/s för 3,5 min. Aspirera alla medium som förekommer på reservoaren sida av brunnarna.
- Tillsätt 1,4 mL HBV-innehållande underhåll medium/coculture underhåll medium II per brunn och överföra plattan i dockningsstationen inom en befuktade inkubator vid 37 ° C och med 5% CO2. Initiera flöde i nedåtgående riktning med en flödeshastighet av 1 µL/s för 8 h, följt av en omsvängning i uppåtgående riktning med en flödeshastighet av 1 µL/s.
- 24 h efter tillägg av HBV, överföra plattan till tvätt dock och aspirera alla medium från brunnarna.
- Tvätta vart bra i plattan 3 x med motsvarande medium, beroende på vilken typ av kultur som beskrivs i steg 2.12 – 2.14, för att eliminera leftover virus från brunnen. I motsats till steg 2.12 – 2.14, till 1,6 mL medium i varje brunn konto för den extra volymen som skall provtas för att utesluta inokulum överföring (figur 1 g).
- Efter dessa tvätt steg, samla 200 µL av medium från varje brunn för att bekräfta fullständig borttagning av det HBV inokulatet genom kvantifiering av extracellulära HBV-DNA.
- Överföra plattan till dockningsstationen inom en befuktade inkubator vid 37 ° C och med 5% CO2, och initiera flöde i riktning uppåt med en flödeshastighet av 1 µL/s för 48 h.
- 48 h senare, samla komplett väl volymen för efterföljande analys, följt av tre tvättar med hepatocyte underhåll medium som beskrivs i steg 2.12 – 2,14. Ersätta mediet och tvätta varje väl 3 x varje 48 h till experimentella uppsägning.
6. kvantifiering av extracellulära HBV-DNA
- Isolera totala DNA från cellkulturer enligt tillverkarens anvisningar med tillägg av 1 µg Carrier RNA i en inneslutningsnivå III lab för att säkerställa den virus inaktiveringen i proverna före flytta dem till ett annat område.
- Förbereda en master mix som innehåller kvantitativa PCR master mix, 600 nM framåt primer, 600 nM reverse primer, och 300 nM i sonden.
- Tillsätt 7 µL master mix i varje brunn av en plattan med 384 brunnar.
- Tillsätt 5 µL av DNA-prover i dubblett, en no-mall kontroll och dubbletter av seriellt utspädda HBV genomet-innehållande plasmid-baserade standard (t.ex. pCMV-HBV) alltifrån 109 kopior per reaktion på 102 exemplar per reaktion till varje brunn den qPCR plattan.
- Placera en självhäftande täcker över plattan och se till att varje väl är förseglad korrekt.
- Centrifugera plattan för 1 min på 300 x g.
- Starta den qPCR körs enligt tillverkarens anvisningar. Cykel villkoren för realtids-PCR är 95 ° C i 10 min, följt av 40 cykler av 95 ° C för 15 s och 60 ° C i 1 min.
- Kvantifiera antalet HBV DNA kopior inom de okända proverna enligt standardkurvan.
7. kvantifiering av intracellulära HBV pregenomiskt (pg) RNA
- Isolera total-RNA från ställningar enligt tillverkarens instruktioner. För att säkerställa fullständig cellys, vortex varje schavotten 3 x 30 s följt av centrifugering vid 300 x g för 1 min mellan varje vortexa. Utföra cellys i inneslutningsnivå III lab för att säkerställa den virus inaktiveringen i proverna före flytta dem till ett annat område.
- Transkribera cDNA från isolerade RNA enligt tillverkarens anvisningar.
- Cykel villkoren för retrotranscription är 25 ° C i 10 min, 37 ° C i 120 minuter och 85 ° C i 5 min.
- Hålla cDNA proverna vid 4 ° C för kortsiktiga eller vid-20 ° C för långsiktig lagring.
- Förbereda master mixar för pgRNA och RPS11 som innehåller kvantitativa PCR master mix och framåt och bakåt primers för pgRNA och RPS11 (används som städning-genen) med en slutlig koncentration på 0,2 µM.
- Lägga till 7,5 µL huvudmixen och 2,5 µL av cDNA per brunn på en plattan med 384 brunnar. Mäta RPS11 och pgRNA av varje prov i två exemplar och innehålla en no-mall kontroll bra för båda gener.
- Placera en självhäftande täcker över plattan och se till att varje väl förseglas helt.
- Centrifugera plattan för 1 min på 300 x g.
- Sätt in plattan i den qPCR-apparat och börja den qPCR köras med kvantitativ PCR-standardprotokollet enligt tillverkarens anvisningar. Cykel villkoren för realtids-PCR är 50 ° C för 2 min, 95 ° C i 2 min, följt av 40 cykler av 95 ° C för 15 s och 60 ° C i 1 min.
- Beräkna uttrycket av pgRNA i förhållande till RPS11.
8. immunofluorescens färgning av virusantigen
- Ta bort låsringen från brunnen och ställningen med pincett i en klass II skåp i inneslutning nivå III labbet.
- Fixa de cell som innehåller ställningar med 4% PARAFORMALDEHYD i 1 mL PBS i 30 min i rumstemperatur i inneslutningsnivå III lab. Följande steg kan utföras i ett annat område.
- Tvätta ställningar 3 x med 1 mL PBS.
- Permeabilize cellerna med 0,1% Triton-X 100 i 1 mL PBS för 1 h i rumstemperatur.
- Tvätta ställningar 3 x med 1 mL PBS.
- Blockera icke-specifik bindning av inkubering av ställningar med 1% BSA i 1 mL PBS för 16 h vid 4 ° C.
- Tvätta ställningar 3 x med 1 mL PBS.
- Utföra primär antikropp färgning med kanin mot hepatit B-virus core antigen vid en spädning på 1: 200 i 1% BSA i 1 mL PBS för 16 h vid 4 ° C.
- Tvätta ställningar 1 x med 0,1% Tween i 1 mL PBS (PBS-Tween) och 3 x med 1 mL PBS.
- Utföra sekundär antikropp färgning använda get anti-kanin IgG (H + L) kors-adsorberat Alexa Fluor 594-konjugerad sekundär antikropp vid en spädning på 1:2,000 i 1% BSA i 1 mL PBS för 16 h vid 4 ° C.
- Tvätta ställningar 1 x med 1 mL 0,1% PBS-Tween och 3 x med 1 mL PBS.
- Counterstain de ställningar som använder DAPI i 1 mL PBS vid en koncentration av 2 mikrog/ml i 10 min i rumstemperatur.
- Tvätta ställningar 1 x med 1 mL 0,1% PBS-Tween och 3 x med 1 mL PBS.
- Överföra ställningar till ett objektglas och montera den för avbildning.
- Bild av ställningar med fluorescens Mikroskop.
9. humant Albumin ELISA
- Utföra detta avsnitt av protokollet i en klass II skåp fördelas i inneslutningsnivå III lab om arbetar med smittsamt material.
- För att utvärdera genomförbarheten och metabola funktioner i PHH, utvärdera humant albumin produktion av ELISA.
- Coat 96 brunnar med 50 µL per brunn av get-anti-humana-antikropp utspädd 1:800 i coatingbuffert (100 mM bikarbonat/karbonat, pH 9,6). Täck plattorna och inkubera i 2 h vid 37 ° C eller över natten vid 4 ° C.
- Aspirera beläggning antikroppen från plattan och tvätta det 4 x med 200 µL 0,05% PBS-Tween.
- Tillsätt 200 µL blockerande buffert (1% BSA i PBS), täcka pläterar, och inkubera dem för 1 h vid 37 ° C eller lagra dem vid 4 ° C i 3 månader. För långsiktig lagring, lägga till 0,05% natriumazid i blockerande buffert.
- Aspirera i blockerande buffert och tvätta 1 x med 200 µL 0,05% PBS-Tween.
- Tillsätt 50 µL av tidigare utspädda prover per brunn (1: 100). Prov Spädningsvätskan innehåller 1% BSA i 0,05% PBS-Tween. Inkubera i 1 timme vid 37 ° C eller över natten vid 4 ° C.
Obs: Inkubera standarder samtidigt som proverna. Ett koncentrationsintervall av 500 – 0,488 ng/mL (1:2 seriella utspädningar) rekommenderas. Utföra alla seriespädningar av albumin av människa i provet spädningsvätska. - Sug ut proverna från plattan och tvätta det 4 x med 200 µL 0,05% PBS-Tween.
- Tillsätt 50 µL av HRP-konjugerad get-anti-humant albumin-antikropp tidigare utspädd 1:10,000 i provet spädningsvätska. Inkubera i 2 h vid 37 ° C eller över natten vid 4 ° C.
- Sug ut antikroppen från plattan och tvätta det 6 x med 200 µL 0,05% PBS-Tween.
- Tillsätt 100 µL av TMB reagens och, så snart de högsta standarderna är fullt utvecklade, 100 µL 1 M H2så4 att stoppa kolorimetrisk reaktion.
- Läs absorbansen vid 450 nm på en plattan med 96 brunnar läsare för analys.
10. Interleukin (IL) 6 och produktion av tumör nekros faktorer (TNF)-α i 3D samtidig kulturer
- Utföra detta avsnitt av protokollet i en klass II skåp fördelas i inneslutningsnivå III lab om arbetar med smittsamt material.
- Kvantifiera IL6 och TNFα produktionen för att utvärdera funktionaliteten och lönsamheten för de primära Kupffers cellerna. För att inducera produktion av dessa cytokiner av Kupffers celler, behandla cocultures med 1 µg/mL lipopolysackarid (LPS) 9 d efter sådd i coculture underhåll medium II för 48 h.
- På dag 11 efter-sådd, skörd mediet från varje brunn och förvara den vid-80 ° C.
- Mätning av IL6 och TNFα koncentrationen i odlingsmediet genom en lämplig analys och enligt tillverkarens anvisningar.
Representative Results
Vi beskriver en enkel och mångsidig plattform för långsiktig kulturen av primära mänskliga Kupffers celler eller hepatocyter och deras infektion med HBV. Primära mänskliga celler är seedade på kollagen-belagd polystyren ställningar inom en mikroflödessystem plattan församling, som kontinuerligt perfuses cellerna med odlingsmedium (figur 1a).
PHH, som vanligtvis bara stabil för en begränsad tid i konventionella kultur system, kan upprätthållas funktionellt för längre tidsperioder. Humant albumin, som utsöndras av funktionella hepatocyter och anses vara den bästa markören för utvärdering av levermetabolism, är stabilt och starkt uttryckt av 3D kulturer fram till dag 40 efter sådd (figur 2). För cocultures, kan Kupffers celler funktionalitet och lönsamhet utvärderas genom utsöndring av specifika cytokiner (t.ex. IL6 och TNFα). För att mäta cytokin produktion, rekommenderas att fånga-baserad detektion medel vid LPS-stimulering av cocultures (figur 3).
Cellerna bildar nedsatt microtissues, vanligtvis inom 3 dagar efter sådd av PHH, visar funktionella galla canaliculi och komplett cell polarisering (figur 2). Förutom att behålla deras fysiologiska cellmetabolismen, blivit dessa kulturer utomordentligt mottagliga för HBV-infektion. HBV-DNA och andra virusmarkörer, i motsats till andra kultur system, blir lätt upptäckas från dag 2 efter infektion (figur 4). Utöver utsöndrade markörer för virusinfektion, hepatocyte-innehållande ställningar kan vara Hämtad från kulturer och används för immunofluorescens detektion av virala antigener (t.ex. HBsAg, HBcAg) (figur 4). Där konventionella hepatocyte kulturer kräver inympning med minst 500 HBV GE per cell och tillägg av 2% DMSO och 4% PEG, så få som 0,05 HBV GE kunna initiera infektion i 3D-kulturer utan kravet av DMSO eller PEG (figur 4).
Figur 1: installation av 3D-lever-på-ett-chip kulturer. (en) Detta är en Schematisk layout för montering av kultur plattan för att säkerställa upprättandet av mikrofabricerade cirkulation. (b) i denna panel visas en närbild av kultur brunnar, inklusive den filterpapper, byggnadsställning och låsringen. (c) denna panel visar processen för plattan Jämviktstiden före sådd kulturerna. De nästa två panelerna visar processen för seedning för (d) hepatocyte monokulturer och (e) hepatocyte/Kupffers celler cocultures. (f) panelen visar tvätt steg involverade i medelstora förändringar. (g) i denna panel visas HBV infektion set-up, inklusive borttagning av inokulatet. S.M. = sådd medium, M.M. = underhåll medium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: nedsatt microtissue bildning och hepatocyte livskraft. (en) i denna panel visas längsgående brightfield bilder av 3D hepatocyte monokulturer visar microtissue bildande efter sådd. (b) i denna panel visas immunofluorescens avbildning av kulturer för kärnor (blå) och humant albumin (grön). (c) denna panel visar längsgående totala albumin samt per cell justerat albumin produktion, under 40 dagar av hepatocyte monokulturer, som bestäms av ELISA. De data som visas är medelvärde ± SD. Denna siffra är anpassad från Ortega-Prieto et al.4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kupffers celler funktionalitet i 3D-cocultures. Dessa paneler visar utsöndringen av (en) IL6 och (b) TNFα i hepatocyte monokulturer och hepatocyte/Kupffers celler cocultures 11 dagar efter sådd svar på exogent extra LPS på dag 9 efter sådd, som fastställs med hjälp av mänskliga magnetiska Luminex assay. Denna siffra är anpassad från Ortega-Prieto et al.4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: HBV-infektion i levern-på-ett-chip kulturer. (en) i denna panel visas immunofluorescens mikroskopi detektion av HBcAg (röd), HBsAg (grön) och atomkärnor (blå) 10 dagar efter infektion av kulturerna med HBV. (b) i denna panel visas mottagligheten av kulturerna för HBV-infektion med olika multiplicities av infektion, som bestäms av en kvantifiering av HBV-DNA i cellkulturer. (c) i denna panel visas kvantifiering av längsgående ansamling av HBV pgRNA i förhållande till städning genen RPS11. De data som visas är medelvärde ± SD. Denna siffra är anpassad från Ortega-Prieto et al.4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Utmaningarna att upprätthålla långsiktiga kulturer av PHH har drivit utvecklingen av flera kultur modeller med ökad funktionalitet och livslängd, varje ställer ut differential fördelar och nackdelar. Det är nu allmänt erkänt att statiska 2D kulturer av PHH imitera vissa aspekter av hepatocyte biologi för mycket begränsade mängder av tid. Således micropatterned cocultures12,13, sfäroid kulturer14,15, och 3D lever-på-ett-chip kulturer16,17 ersätter snabbt dessa mer grundläggande system. Särskilt när man studerar infektionssjukdomar, som har coevolved med sin värd att utnyttja särskilda mikromiljö, underbyggs kravet på att tillhandahålla fysiologiska miljöer av odla mänskliga-tropic ofta utmanande natur smittsamma sjukdomar, inklusive hepatit C-virus, HBV och malaria.
Det mest kritiska steget i utför 3D lever-på-ett-chip kulturer är kvaliteten på de först inköpta primära celltyper. Dessa celler ska testas för sin följsamhet kapacitet och endast plateable PHH massor bör användas för att säkerställa framgångsrika vävnad bildning och kultur generation. Även om färska isolerade PHH kan användas, deras frysförvaring är vanligtvis komplicerade och kräver särskild kurs-kontrollerade frysar.
I motsats till konventionella statiska 2D kulturer, värd genetiska bakgrunden är försumbar när det gäller känslighet för HBV-infektion, och alla-hittills testade hepatocyte givare kunna upprätta HBV infektion4.
Även om patientderiverade HBV fastställer infektioner av 3D kulturer, det är absolut nödvändigt att utnyttja PEG-fällt och sackaros kudde-renat HBV när använda inducerbara HBV producent cell linjer för generering av viral inokulat. Cell cellkulturer direkt tillämpas på 3D lever-på-ett-chip kulturer, antingen genom närvaron av hämmande faktorer eller på grund av inkompatibilitet av nuvarande tillväxtfaktorer med hepatocyter, leder inte lätt till infektion. Dessutom, när du väljer patientderiverade viral inokulat, bör endast serum användas, eftersom plasma oundvikligen koagulerar och träskor mikroflödessystem cirkulationen av kultur plattformen.
Oavsett den virala inokulum används, är cellulära livskraft och differentiering, liksom att säkerställa fullständig borttagning av den inledande HBV inokulatet, nyckeln till framgångsrik långtidsstudier av infektion. Det mest bekväma sättet att göra detta är provtagning kulturer efter avlägsnande av det virala inokulatet, samt mäta humant serumalbumin nivåer under hela kulturen. Notera, på samma sätt som alla andra beskrivna plattformar, HBV-infektion när etablerad, sprids lätt inte till oinfekterade celler. Den underliggande mekanismen för detta är fortfarande gäckande eftersom HBV-infektion i vivo smittar lätt majoriteten av hepatocyter inom levern.
När det gäller cocultures av PHH och Kupffers celler är det lämpligt att utföra mycket tester av Kupffers celler att utvärdera IL6 och TNFα sekretion i LPS stimulering eftersom inte alla kommersiellt tillgängliga Kupffers celler givare har en lika lyhördhet.
Viktigast av allt, för alla läkemedelsbehandlingar eller initial infektion av kulturer med HBV, måste den totala volymen av brunnen (1,4 mL), samt per mikroflödessystem kanalen (0,2 mL), beaktas för beräkning av drog- eller inokulum koncentrationer. För att säkerställa korrekt dosering, utförs ett tvätt steg med medium innehållande HBV eller droger för att prime mikroflödessystem kanalen.
Den plattform som används använder tredjeparts 600.000 PHH per brunn, vilket garanterar multilayered hepatocyter inom ställningar. Även om antalet cell kan varieras, garanterar valt cellkoncentrationen optimala resultat. Det platta formatet rymmer totalt 12 ställningar, som kan uppgraderas till 36 ställningar. Dock på grund av mikrofabricerade krav går skala upp till högre väl siffror inte hittills.
Med hjälp av dessa metoder, kan kulturer upprätthållas med optimal cell prestanda för minst 40 dagar, som, hittills, erbjuder oöverträffade möjligheter att utvärdera nya läkemedelskandidater, samt studera det komplexa samspelet mellan olika nedsatt cell populationer under HBV-infektion.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades genom en Starter bidrag från European Research Council (637304), en Wellcome Trust Investigator Award (104771/Z/14/Z), och CN Bio innovationer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| William's E Medium, no phenol red | GIBCO | A12176-01 | |
| Hepatocyte Thaw Medium | GIBCO | CM7500 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | GIBCO | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | GIBCO | CM4000 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Advanced DMEM | GIBCO | 12491023 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-144 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | GIBCO | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture | SIGMA | 12106C | |
| Hydrocortisone | SIGMA | H0888 | |
| Trypan blue | Merck | T8154 | |
| Collagen from calf skin | Merck | C9791 | |
| G418 | SIGMA | G418-RO | |
| Tetracycline | SIGMA | T3258 | |
| Polyethylene glycol 8000 | SIGMA | P2139 | |
| Sucrose | SIGMA | SO389 | |
| Sodium carbonate anhydrous | SIGMA | 451614-25G | |
| Sodium bicarbonate | SIGMA | S5761 | |
| Sodium azide | SIGMA | S2002-5G | |
| Sulfuric acid, 99.999% | SIGMA | 339741 | |
| 4% Paraformaldehyde | SIGMA | 252549 | |
| Triton-X 100 | SIGMA | X100 | |
| Tween 20 | SIGMA | P1379 | |
| DAPI | SIGMA | D9564 | |
| Albumin (human) | SIGMA | A9731 | |
| Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP9701-100 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | |
| SYBR Select Master Mix | Applied Biosystems | 4472903 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits/Consumables | |||
| Sterile membrane | CN Bio innovations | LC-SC | |
| LiverChip Perfusion cell culture plate | CN Bio innovations | LC12 | |
| LiverChip culture plate lid | CN Bio innovations | LC-SC | |
| Sterile round filter paper | CN Bio innovations | LC-SC | |
| Cell attachment scaffold | CN Bio innovations | LC-SC | |
| Retaining ring | CN Bio innovations | LC-SC | |
| Sterile plunger | CN Bio innovations | LC-ST | |
| Dneasy blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| Human Magnetic Luminex assay | R&D Systems | ||
| 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 4368814 | |
| QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set | Qiagen | 1048147 | Containing RNA carrier |
| Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile | Millipore (Merck) | PFHYS1008 | |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Life technologies | 4309849 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Life technologies | 4311971 | |
| Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 442404 | |
| Sealing Tape for 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane | ThermoFisher Scientific | 295-3345 | |
| Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost | Fisher Scientific | FB58628 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 344058 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells / Cell lines | |||
| Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified | Thermo Fisher Scientific | HMCPTS | |
| Cryopreserved Human Kupffer Cells | Thermo Fisher Scientific | HUKCCS | |
| HepDE19 cell line | Haitao Guo (Indiana University, IN, USA) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers/Probes/Standards | |||
| HBV DNA forward primer | Invitrogen | 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3' | |
| HBV DNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3' | |
| HBV DNA probe | Invitrogen | 5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA | |
| pgRNA forward primer | Invitrogen | 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3' | |
| pgRNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3' | |
| RPS11 forward primer | Invitrogen | 5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3' | |
| RPS11 reverse primer | Invitrogen | 5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3' | |
| pCMV-HBV | Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal) | DAKO | discontinued | Lot 10102505 |
| Human Albumin Antibody, A80-129A | Bethyl Laboratories. inc | A80-129A | |
| Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P | Bethyl Laboratories. inc | A80-229P | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | # A-11072 | Lot 1431810 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| LiverChip Vacuum pump | CN Bio innovations | LC-PN | |
| LiverChip Pneumatic Hookup | CN Bio innovations | LC-PN | |
| LiverChip platform | CN Bio innovations | LC-PN | |
| LiverChip plate washing dock | CN Bio innovations | ||
| Autoclavable metal forceps | VWR | 232-0106 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries | SKU: SI-0236 | |
| Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004500 | |
| SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow | MGE worldwide | SAM12/01010101 | |
| NUAIRE 5800 SERIES incubator | NUAIRE | NU-5841 | |
| Automated precision torgue | CN Bio innovations | ||
| Manual torque | CN Bio innovations | ||
| LiverChip compressor | CN Bio innovations | ||
| Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1 | Luminex | ||
| Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block | ThermoFisher Scientific | Millipore™ 40-285 | |
| FluoStar Optima Plate Reader | BMG Labtech | ||
| KOLVER Precision electric screwdrivers | VTECH ltd | FAB10RE/FR | |
| KOLVER Power supply | VTECH ltd | EDU1FR | |
| BAMBI VTS75D | Air Equipment | Discontinued | |
| Integra Vacuboy | INTEGRA | ||
| ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453536 |
References
- Verrier, E. R., Colpitts, C. C., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. F. Cell Culture Models for the Investigation of Hepatitis B and D Virus Infection. Viruses. 8 (9), (2016).
- Elaut, G., et al. Molecular mechanisms underlying the dedifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures. Current Drug Metabolism. 7 (6), 629-660 (2006).
- Konig, A., et al. Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes. Journal of Hepatology. 61 (4), 867-875 (2014).
- Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682 (2018).
- Allweiss, L., Dandri, M. The Role of cccDNA in HBV Maintenance. Viruses. 9 (6), (2017).
- Guo, J. T., Guo, H. Metabolism and function of hepatitis B virus cccDNA: Implications for the development of cccDNA-targeting antiviral therapeutics. Antiviral Research. 122, 91-100 (2015).
- Lucifora, J., et al. Direct antiviral properties of TLR ligands against HBV replication in immune-competent hepatocytes. Scientific Reports. 8 (1), 5390 (2018).
- Hosel, M., et al. Hepatitis B Virus Activates Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Supporting Hepatocyte Survival and Virus Replication. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (3), 339-363 (2017).
- Mazza, G., et al. Rapid production of human liver scaffolds for functional tissue engineering by high shear stress oscillation-decellularization. Scientific Reports. 7 (1), 5534 (2017).
- Hang, T. C., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G., Stolz, D. B. Lipids promote survival, proliferation, and maintenance of differentiation of rat liver sinusoidal endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (3), G375-G388 (2012).
- Hwa, A. J., et al. Rat liver sinusoidal endothelial cells survive without exogenous VEGF in 3D perfused co-cultures with hepatocytes. The FASEB Journal. 21 (10), 2564-2579 (2007).
- Khetani, S. R., Bhatia, S. N. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).
- March, S., et al. Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens. Nature Protocols. 10 (12), 2027-2053 (2015).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
- Griffith, L. G., Wells, A., Stolz, D. B. Engineering liver. Hepatology. 60 (4), 1426-1434 (2014).
- Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).
