Summary
该协议的目标是提供一个分步指南, 以执行三维 "片上的肝脏上" 感染实验与乙型肝炎病毒。
Abstract
尽管乙型肝炎病毒 (hbv) 在体内具有特殊的传染性, 只有三个病毒基因组可以导致实验感染的黑猩猩的慢性, 但大多数体外模型每个细胞需要数百到数千个病毒基因组。以引发短暂感染。此外, 人类原代肝细胞 (phh) 的静态2d 培养由于其快速去分化而只允许短期研究。在这里, 我们描述了 phh 的三维肝片上培养物, 无论是单分子还是与其他非实质肝细胞的共聚。这些为研究具有生理宿主细胞反应的长期乙肝病毒感染提供了显著的改进。除了促进药物疗效研究、毒理学分析和发病机制调查外, 这些微流体培养系统还有助于评估旨在消除共价闭合的乙肝病毒感染的治疗方法,圆形 (ccc) dna。该方法描述了 phh 单核细胞培养和 phh kupffer 细胞共培养的建立、其对纯化 hbv 的感染以及宿主反应的分析。该方法特别适用于 hbv 感染、治疗组合和发病机制的长期影响评价。
Introduction
乙肝病毒的研究由于培养系统的敏感性差而变得复杂, 每个细胞需要几百到几千个乙肝病毒基因组拷贝才能引发感染1。此外, 在常规培养过程中, 原代肝细胞一般异常脆弱, 并迅速分化2。这主要是由于平面和硬塑料表面不模仿肝脏内的自然细胞外环境, 以及在没有微流体循环的情况下, 培养物普遍缺乏氧合作用。传统的胶原蛋白包衣板静态肝细胞培养物迅速分化, 降低了对乙肝病毒感染的易感性3。在这里, 我们描述了在芯片上的3d 肝脏培养中生长的 phh 的设置和感染, 这些培养体由于具有广泛的代谢和功能能力, 比传统的2d 静态 phh 培养在胶原蛋白涂层板上非常有利, 这促进了至少 40天的长期文化4。在该系统中, phh 被播种在胶原蛋白涂层支架上, 这些支架不断与生长介质灌注, 为细胞提供氧气和营养。尽管基于小鼠成纤维细胞复杂共体或球体三维生长的 phh 替代培养系统已经得到验证, 并且很容易感染乙肝病毒, 使用每个细胞500基因组等价物 (ge) 的感染倍数, 3d片上肝培养物仍然是唯一的体外模型系统, 每个细胞4容易感染0.05 的 hbv ge。这还因为有必要使用高浓度的二甲基亚硫醚 (dmso) 和聚乙二醇 (peg) 来建立 hbv 感染, 这对于3d 芯片上的肝脏培养系统的感染是不可或缺的4. 乙肝病毒感染的主要特征之一是 cccdna 池, 它是所有新产生的病毒 5,6的转录模板.尽管 cccdna 可以在常规肝细胞培养物 7,8中检测到, 但目前尚不清楚是否部分或部分地重述了 cccdna 的调控和任何旨在消除其的治疗方法。完全去分化肝细胞。我们已经证明, cccdna 是在三维芯片上的肝脏培养中形成的, 对生理刺激有反应, 并且可以通过干扰转录机械对 cccdna 基因组 4的访问性来定向。
宿主对芯片上3d 肝上的乙肝病毒感染的反应与 hbv 感染患者的反应相似, 从而能够识别感染的生物标志物, 并取得治疗成功。片上肝培养物的独特之处在于能够评估 phh 与肝脏内其他非实质细胞之间的长期宿主反应, 包括库弗细胞4、星状细胞9和肝脏正弦波内皮细胞10,11。这为评估复杂的3d 微环境中的细胞细胞相互作用提供了独特的机会。
此外, 该平台的延长培养周期有助于评估连续药物治疗及其对乙肝病毒持久性的影响, 而传统的肝细胞培养系统是不可能的。
该协议描述了如何生成三维肝片上培养物, 无论是用于 phh 的单分子, 还是用于 phh 与 kupffer 细胞的共聚。此外, 我们还描述了用于低感染倍数研究的纯化乙肝病毒的生产, 以及随后对宿主和病毒反应的分析。
Protocol
1. 板材的装配和平衡
- 确保与 livchip 平台相关的压缩机和真空泵都已打开。在二级机柜中对板材进行组装和平衡。
- 通过在板基座之间放置无菌膜并添加包含良好的顶板, 无效果地组装微流体板 (图 1a)。
- 确保无菌膜平稳地固定在基板的两个针脚上, 因为不均匀的膜放置会破坏微流体循环。
- 添加无菌板盖, 并使用螺旋拧紧顺序的自动精确扭矩至33磅, 拧紧板底部的螺钉。确保所有螺丝都使用手动扭矩拧紧至35磅。在此步骤中, 确保螺丝对称拧紧 (图 1a)。
- 原生肝细胞播种培养基, 包括威廉姆斯 e 培养基、原代肝细胞解冻和电镀补充剂、5% 的胎牛血清 (fbs) 和1微米地塞米松至37°c。
- 将完全组装好的板放置在洗涤底座内, 并在每口井的储集层一侧添加400μl 的肝细胞种子培养基。确保盘子完全卡入洗涤底座。
- 在1μlss 处向上启动流动3.5 分钟。微流体循环的成功功能可以通过板侧的红色指标来确定 (图 1a)。
- 一旦培养基被泵送到板的细胞生长侧, 确保流道的正确组装, 添加额外的1.2 毫升肝细胞播种培养基。
- 在37°c 和 5% co 2 的加湿孵化器内小心地将板材转移到坞站中, 并以1μlx 的流速启动向上流动, 时间为 16h (图 1c)。
- 将盘子转移到洗涤底座上, 通过上下轻轻移液来消除井内的气泡。
- 在每口井中加入一张无菌的圆形滤纸, 然后加入一个细胞附件支架和一个固定环, 用于使用无菌钳。用无菌柱塞向下压每口井, 将固定环和脚手架固定到位 (图 1b)。
- 将所有培养基吸气, 在支架上轻轻加入400μl 的预热肝细胞播种介质, 并在1μll 时在向下方向启动流动3.5分钟。
- 从板的储集层一侧吸气所有介质。此步骤是更换流通道中包含的介质所必需的。
- 在每口井加入1.4 毫升的肝细胞播种培养基, 然后将板返回到码头, 以完成每口井的总体积。每口井的体积现在为 1.6 ml (井中1.4 毫升, 流动通道为 0.2 ml)。
2. 单种肝细胞的解冻和播种
- 根据供应商的指示, 在解冻一小瓶 phh 之前, 原肝细胞解冻培养基和肝细胞播种培养基至37°c。在此步骤中, 在室温下使用离心机, 以避免温度突然变化。在二级机柜中对肝细胞进行解冻和播种。
- 在1毫升的肝细胞播种培养基中重新移植细胞, 并用色氨酸蓝计数细胞。确保细胞的活力超过90%。
- 将细胞放在冰上, 直到它们被添加到井中。
- 将平衡和完全组装的板转移到洗涤底座, 并从水井中吸气所有介质。
- 在500μl 体积的肝细胞播种培养基中, 为每口井添加 600, 000 肝细胞。
- 以1μls 的流速向下启动流动, 加入900μl 的肝细胞播种培养基, 使井内总体积达到 1.6 ml。
- 在37°c 和 5% co 2 的加湿孵化器内将板材转移到坞站.
- 以1μls 的流速向向下启动流动, 以8h 的速度, 然后在流速率为1μls 的情况下, 以8h 的速度向向上方向反转。
- 将盘子转移到洗涤场, 并从水井中吸气所有介质。
- 在每个井中加入400μl 的肝细胞维持介质 (williams e 培养基, 补充肝细胞维持剂和 100 nm 地塞米松), 并以1μls 的流速在向下启动流动, 时间为3.5 分钟。
- 从储层中吸收所有培养基, 加入1.4 毫升的肝细胞维持培养基 (图 1d)。
- 每48小时将培养基更换为肝细胞维持培养基。为确保更换井内的所有培养基, 请在添加新鲜肝细胞维持培养基前进行清洗步骤。
- 对于洗涤步骤, 将板材转移到洗涤底座, 从井中吸气所有介质, 并添加400μl 的维护介质。
- 以1μls 的向下启动流动, 时间为 3.5分钟, 使所有介质出现在井的储集层一侧。
- 加入1.4 毫升的肝细胞维持介质, 并在37°c 和 5% co2的加湿孵化器内, 将板转移到坞站, 并以1μls 的流速在48小时内启动向上流动 (图 1f)。
请注意:对于用作控制共塞的肝细胞单体, 为了确保控制条件, 使用了第二种维持介质, 这是特定用于原代人类库珀细胞的配置。48小时后, 用肝细胞维持培养基 (第3天后播种) 取代肝细胞播种介质 (第3天后播种), 常规肝细胞维持培养基将被共培养维持培养基 ii 取代, 特别是在 phh 单分子中, 与之相比,phh 和 kupffer 细胞的共组成, 因为培养基成分略有不同。
3. 库弗细胞和肝细胞的解冻和播种, 用于共培养
- 为了确保结果的准确比较, 总是将 phh？库珀细胞的配置与 phh 单效进行比较
- 对于 phh 和 kupffer 细胞的共聚物, 在没有地塞米松的情况下, 在不进行地塞米松的情况下, 在高级 dulbecco 的改进型鹰培养基 (admem) 中解冻一小瓶库弗细胞, 但补充原代肝细胞解冻和电镀补充剂 (共培养播种培养基)。供应商的指示。在二级柜中对库弗细胞和肝细胞进行解冻和播种。
- 在共种播种培养基中重新利用细胞, 用色氨酸蓝计数细胞。确保细胞的活力超过90%。
- 在将细胞添加到井中之前, 请将其放在冰上, 以避免细胞粘附。
- 按照步骤 2.1-2.3 中的说明解冻原代人肝细胞。
- 将平衡和完全组装的板转移到洗涤底座, 并从水井中吸气所有介质。
- 在每口井中加入 60, 000个库弗细胞和/或 600, 000个肝细胞, 每个共种播种培养基的总体积为250μl。
- 以1μls的流速向向动 , 并在每口井中添加900μl的共培养播种介质。
- 在37°c 和 5% co 2 的加湿孵化器内将板材转移到坞站中.
- 以1μls 的流速向向下启动流动, 以8h 的速度, 然后在流速率为1μls 的情况下, 以1μls 的速度向向上方向反转, 为8小时。
- 将盘子转移到洗涤场, 并从水井中吸气所有介质。
- 在每口井加入400μl 的共培养维持介质 i (addmem 不含地塞米松, 但辅以肝细胞维持剂), 并以1μl 的流速在向下启动流动, 时间为3.5 分钟。
- 从储层侧吸吸所有培养基, 并在每口井中加入 1.4 ml 的共培养维持介质 i。
- 在37°c 和 5% co 2 的加湿孵化器内将板材转移到坞站中, 并以 1μls 的流速在48小时内启动向上流动。
- 将盘子转移到洗涤场, 并从水井中吸气所有介质。加入400μl 的共培养维持介质 ii (威廉姆斯 e 培养基, 不含地塞米松, 但辅以 100 nm 氢化可的松和肝细胞维持剂), 并在1μls 向下启动流动, 时间为3.5 分钟。
- 吸出所有介质出现在井的储集层一侧。
- 加入1.4 毫升的共培养维护介质 ii, 并将板材转移到37°c 加湿孵化器内的坞站, 并使用 5% co 2.
- 以1μls 的流速在48小时内向上启动流动 (图 1e)。
- 每48小时将介质更换为共培养维护介质 ii。为确保更换井内的所有介质, 请在添加新鲜介质之前执行清洗步骤。
- 要清洗, 转移到洗涤码头, 从井中吸气所有介质, 并添加400μl 的共培养维护介质 ii。
- 以1μls 的向下启动流动, 时间为 3.5分钟, 使所有介质出现在井的储集层一侧。
- 加入 1.4 ml 的共培养维护介质 ii, 并将板材转移到37°c 和 5% co 2 的加湿孵化器内的坞站, 并以1μls 的流速在48小时内启动向上流动 (图 1f).
4. 为感染研究生产传染性乙型肝炎病毒
- 在安全包含级别 iii 实验室中执行协议的这一部分。在二级机柜中进行播种、培养基变化、培养基收集和病毒浓度。
- 在120毫升的完整 dmm/f12 中培养 hbv 产生的细胞 (例如 hepde19, hepad38) 在胶原蛋白涂层 t1000 5 层瓶中培养 (10% fbs, 青霉素/烟酸, 非必需氨基酸, 500μgml g418 和1μgml 四环素), 直到他们达到90% 的融合。
- 将培养基改为诱导培养基 (没有四环素的完整 dmem) 诱导乙肝病毒的产生。
- 在提取四环素后的12天内, 每48小时收集一次完整的中等体积, 并将其存放在4°c。
- 通过0.45μm 瓶顶过滤器过滤收集的介质。
- 在磷酸盐缓冲盐水中加入无菌 peg 8000 (pbs), 在收集的培养基中加入, 最终浓度为 4% w, 通过倒置8x–10x 混合, 在4°c 孵育 16h. 在4°c 下, 以 10, 000 x克的速度离心 1小时, 收集 peg 沉淀病毒并重新悬浮含有 10% fbs 的 pbs 中的颗粒。
- 将 pegg 沉淀病毒从所有收获时间点结合起来, 并将其分层在20% 的蔗糖垫上。使用 sw28 转子以 140, 000 x g的速度在4°c 下进行16小时的离心。
- 吸收上清液并重新悬浮在 pbs 中的颗粒, 再加上10% 的 fbs 和脂肪, 并将其储存在-80°c。
- 用 hbv dna qpcr (步骤 6) 测定上清液中存在的 hbv dna 拷贝数。
5. 3d 培养与乙肝病毒的感染
- 在 iii 级实验室内的二级机柜中执行感染。
- 播种单核或共生种后 3天, 在室温下解冻所需数量的含 hbv 的脂肪, 并分别在1.8 毫升的肝细胞维持培养基或共培养维持介质 ii 中稀释所需的病毒剂量。
- 这种1.8 毫升稀释病毒足以用于洗期 (400μl) 和井内介质的置换 (1.4 ml)。然而, 所需的感染多样性需要调整, 以考虑到 1.6 ml 的最终培养量。
- 将盘子转移到洗涤场, 并从水井中吸气所有介质。加入400μl 含六溴代素培养基, 以1μls 的向下启动流动, 为3.5分钟。
- 每口井加入1.4 毫升 (含 hbv) 的维护介质/共培养维护介质 ii, 并将其转入37°c 加湿孵化器内的坞站, 并使用5% 的 co2。以1μls 的流速向向下启动流动, 以8h 的速度, 然后以1μls 的流速向向上方向反转。
- 在添加乙肝病毒24小时后, 将盘子转移到洗涤场, 并从水井中吸气所有介质。
- 根据第2.12–2.14 步中概述的培养类型, 用相应的培养基清洗板3x 中的每口井, 以消除油井中残留的病毒。与步骤2.12–2.14 相比, 在每口井中添加 1.6 ml 介质, 以考虑到要取样的额外体积, 从而排除接种结转 (图 1g)。
- 按照这些清洗步骤, 从每口井收集200μl 培养基, 通过对细胞外 hbv dna 进行定量, 确认乙肝病毒接种的完全去除。
- 在37°c 和 5% co 2 的加湿孵化器内将板材转移到坞站, 并以1μlx 的流速启动向上流动, 流动时间为 48小时.
- 48小时后, 收集完整的井量进行下游分析, 然后按照步骤2.12-2.14 中概述的用肝细胞维持介质洗三次。更换介质, 每48小时清洗一次 3x, 直到实验结束。
6. 细胞外乙肝病毒 dna 的定量
- 根据制造商的说明, 从培养品上分离总 dna, 并在安全 iii 级实验室中添加1微克的携带 rna, 以确保病毒在将样本转移到不同区域之前在样本中失活。
- 制备主混合, 包括定量 pcr 主混合物、600 nm 正向底漆、600 nm 反向底漆和 300 nm 探针。
- 在384井板的每口井中加入7μl 的主混合物。
- 添加5μl 的 dna 样本一式两份, 无模板控制, 并复制一系列稀释的 hbv 基因相关标准 (例如, pcmv-hbv), 从每次反应 10 9份到每次反应10份, 再到每口井10份。板。
- 将粘合盖放在板上, 确保每口井都能正确密封。
- 以 300 x g 离心板 1分钟.
- 根据制造商的说明启动 qpcr 运行。实时 pcr 的循环条件为 95°c 10分钟, 然后40个周期的95°c 为 15秒, 60°c 为1分钟。
- 根据标准曲线量化未知样本中乙肝病毒 dna 拷贝的数量。
7. 细胞内乙肝病毒 (pg) rna 的定量
- 根据制造商的说明, 从脚手架中分离出总 rna。为了确保完整的细胞裂解, 涡旋每个支架3x 为 30秒, 然后在 300 x g离心1分钟之间的每一个涡流。在安全壳三级实验室进行细胞裂解, 以确保病毒在样本中不激活, 然后再将其转移到不同的区域。
- 根据制造商的说明, 从分离的 rna 中转录 cdna。
- 逆转录酶的循环条件为 25°c 10分钟, 37°c 120分钟, 85°c 5分钟。
- 将 cdna 样本保存在4°c 下短期或-20°c, 以便长期储存。
- 在最终浓度为0.2μm 的情况下, 为 pgrna 和 rps11 准备含有定量 pgRNA 主混合物以及 pgrna 和 rps11 (用作家政基因) 的正向和反向引物的主混合物。
- 在384孔板上加入7.5μl 的主混合物和2.5μl 的 cdna。测量每个样本的 rps11 和 pgrna 一式两份, 并包括两个基因的无模板控制。
- 将粘合盖放在板上, 确保每口井完全密封。
- 以 300 x g 离心板 1分钟.
- 将板材插入 qpcr 循环器中, 并根据制造商的说明使用标准定量 pcr 协议启动 qpcr 运行。实时 pcr 的循环条件为 50°c, 2分55°c, 95°c, 95°c 循环 15秒, 60°c, 1分钟。
- 计算 pgrna 相对于 rps11 的表达。
8. 病毒抗原的免疫荧光染色
- 从井里取下挡圈, 用钳子将支架取下于 iii 层安全壳实验室的二级机柜中。
- 在封闭 iii 级实验室的室温下, 将含有4% 甲醛的支架固定在1毫升的 pbs 中, 在室温下保存30分钟。可以在不同的区域执行以下步骤。
- 用1毫升的 pbs 清洗支架3倍。
- 在室温下使用 1% triton-x 100 在 1 ml 的 pbs 中, 使细胞渗透1小时。
- 用1毫升的 pbs 清洗支架3倍。
- 在4°c 条件下, 用 1% bsa 在 pbs 1 ml 中对支架进行16小时的嵌套非特异性结合。
- 用1毫升的 pbs 清洗支架3倍。
- 在 4°c 16小时的 pbs 1 毫升中, 使用兔抗乙型肝炎病毒核心抗原稀释 1:200 1% bsa 进行一次性抗体染色。
- 用1% 的 pbs (pbs-twin) 清洗支架 1x, 用1毫升的 pbs 清洗3倍。
- 在 4°c 16小时的 pbs 1 毫升中, 用山羊兔抗兔 igg (h + l) 交叉吸附亚历克莎氟化物594共轭二级抗体进行二次抗体染色, 稀释为 1:2000, 为 1% bsa, 为16小时。
- 用1毫升的 1% pbs-tw内清洗支架 1x, 用 pbs 的1毫升清洗3倍。
- 在室温下, 在浓度为2μgml 的情况下, 使用 dapi 在 pbs 的1毫升中对支架进行反污, 时间为10分钟。
- 用1毫升的 1% pbs-tw内清洗支架 1x, 用 pbs 的1毫升清洗3倍。
- 将支架转移到显微镜幻灯片上, 并将其安装以进行成像。
- 使用荧光显微镜对支架进行成像。
9. 人白蛋白酶联免疫吸附法
- 如果使用传染性材料, 请在安全壳三级实验室分配的二级机柜中执行协议的这一部分。
- 为了评估 phh 的可行性和代谢功能, 用 elisa 评价人白蛋白的生产。
- 在涂布缓冲液中涂布96孔板, 每口山羊抗人体抗体 50μl, 稀释 1:800 (100 mm 碳酸氢盐/碳酸盐, ph 9.6)。在37°c 下覆盖板材并孵育 2小时, 在4°c 下孵育2小时。
- 从板材中吸干涂层抗体, 用200μl 为 0.05% pbs-tween 清洗4倍。
- 加入200μl 的阻滞剂 (pbs 中的 1% bsa), 覆盖板, 在37°c 下孵育 1小时, 或在4°c 下储存3个月。对于长期储存, 在阻滞缓冲液中添加0.05% 的氮化钠。
- 吸入阻滞剂, 用200μl 的 0.05% pbs-tfenh 清洗1x。
- 每口井加入50μl 以前稀释的样品 (1: 100)。样品稀释剂在 0.05% pbs-twin 中含有 1% bsa。在37°c 下孵化 1小时, 在4°c 下过夜。
注: 在样品的同时孵化标准。浓度范围为 500–0.488 ngml (1: 2 串行稀释剂)。对样品稀释剂中的人白蛋白进行所有系列稀释。 - 将样品从板材中吸气, 用 200μl 0.05% 的 pbs-tw内清洗4倍。
- 加入50μl 的 hrp 共轭山羊抗人白蛋白抗体先前稀释1:10000 样品稀释剂。在37°c 下孵化 2小时, 在4°c 下过夜。
- 从板中吸收抗体, 用200μl 为 0.05% pbs-tween 清洗6x。
- 添加100μl 的 tmb 试剂, 一旦完全制定了最高标准, 加入 100μl 1m h 2 so 4 以停止比色反应。
- 阅读96孔板读取器上450纳米的吸收率进行分析。
10. 三维共培养中白细胞介素 (IL)6 和肿瘤坏死因子 (tnf) α的产生
- 如果使用传染性材料, 请在安全壳三级实验室分配的二级机柜中执行协议的这一部分。
- 量化 il6 和 tnfα的生产, 以评估主要库普弗细胞的功能和活力。为了诱导库珀细胞产生这些细胞因子, 在共培养维持培养基 ii 中, 用1μgml 脂多糖 (lps) 9 d 后播种在48小时内处理这些细胞因子。
- 在第11天播种后, 从每口井中收获培养基, 并将其储存在-80°c。
- 根据制造商的说明, 通过适当的测定和工艺测定培养基中的 il6 和 tnfα浓度。
Representative Results
我们描述了一个简单和多才多艺的平台, 用于原代人类库弗细胞和/或肝细胞的长期培养及其感染乙肝病毒。原生人细胞在微流体板组件内的胶原蛋白涂层聚苯乙烯支架上播种, 该支架不断为细胞注入生长介质 (图 1a)。
phh 通常在传统的培养系统中只稳定在有限的时间内, 可以在功能上长时间维护。人类白蛋白是由功能性肝细胞分泌的, 被认为是评估肝脏代谢的最佳标志物, 它被三维培养稳定和高度表达, 直到第40天播种后 (图 2)。对于共济会, 库珀细胞的功能和活力可以通过分泌特定的细胞因子 (例如, il6 和 tnfα) 来评估。为了测量细胞因子的产生, 建议使用基于捕获的检测手段对分子的 lps 刺激 (图 3)。
细胞形成肝微组织, 通常在 phh 播种后3天内, 显示功能性胆管和完全细胞极化 (图 2)。除了保持其生理细胞代谢, 这些培养物变得特别容易感染乙肝病毒。与其他培养系统相比, hbv dna 和其他病毒标记物从感染后第2天就容易检测到 (图 4)。除了病毒感染的分泌标记外, 还可以从培养物中提取含有肝细胞的支架, 用于病毒抗原 (如 hbsag、hbcag) 的免疫荧光检测 (图 4)。在常规肝细胞培养物要求每个细胞至少接种 500 hbv ge 并添加 2% dmso 和 4% peg 的情况下, 只有 0.05 hbv ge 能够在三维培养中引发感染, 而无需 dmso 或 peg (图 4)。
图 1: 芯片上的三维肝脏区域性的设置.(a) 这是一个用于组装培养板的示意图布局, 以确保建立微流体循环。(b) 该面板显示培养井的特写镜头, 包括滤纸、脚手架和挡圈。(c) 该面板显示了在播种培养物之前的板块平衡过程。接下来的两个面板显示了 (d) 肝细胞单体和 (e) 肝细胞-库珀细胞共体的播种过程。(f) 该面板显示介质变化所涉及的清洗步骤。(g) 该面板显示乙肝病毒感染的设置, 包括摘除接种疫苗。s. m. = 播种介质, m. m. = 维护介质。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 肝微组织形成和肝细胞活力.(a) 该面板显示三维肝细胞单核细胞的纵向明亮场图像, 显示播种后的微组织形成情况。(b) 该面板显示细胞核 (蓝色) 和人白蛋白 (绿色) 培养物的免疫荧光成像。(c) 该面板显示 elisa 确定的40天肝细胞单核细胞中的纵向总白蛋白以及每个细胞调整后的白蛋白的产生情况。所示数据为平均值±sd。这一数字改编自 ortega-prieto 等人.请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 三维共塞中的库珀细胞功能.这些面板显示 (a) il6 和 (b) tnfα在肝细胞单肠和肝细胞/kupfer 细胞组合中的分泌 11天, 以响应在播种后第9天外生添加的 lps, 如人类用人类确定的那样发光分析。这一数字改编自 ortega-prieto 等人.请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 片上肝脏培养物中的乙肝病毒感染.(a) 该面板显示, 在 hbv 培养物感染后 10天, hbpag (红色)、hbsag (绿色) 和细胞核 (蓝色) 的免疫荧光显微镜检测。(b) 该小组使用不同的感染倍数显示培养物对乙肝病毒感染的易感性, 这是由培养中的乙肝病毒 dna 在培养物中的定量确定的。(c) 该面板显示 hbv pgrna 相对于家养基因 rps11 的纵向积累的定量。所示数据为平均值±sd。这一数字改编自 ortega-prieto 等人.请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
在保持 phh 长期文化方面的挑战推动了几种具有更高功能和寿命的文化模型的开发, 每个模型都表现出不同的优势和劣势。现在人们普遍承认, phh 的静态2d 培养物在非常有限的时间内模仿肝细胞生物学的某些方面。因此, 微图案的共体 12,13, 球体培养14,15 和3d 芯片上的肝脏培养16, 17 正在迅速取代这些更基本的系统。特别是在研究传染病时, 人类热带文化往往具有挑战性, 这些传染病与宿主共同进化, 利用特定的微环境, 因此对提供生理环境的要求是有挑战性的传染病, 包括丙型肝炎病毒、乙肝病毒和疟疾。
执行芯片上的3d 肝脏培养的最关键的步骤是最初来源的主要细胞类型的质量。这些细胞应测试其粘附能力, 只应使用可移植的 phh 批次, 以确保成功的组织形成和培养。尽管可以使用新隔离的 phh, 但它们的冷冻保存通常很复杂, 需要特殊的速率控制冰柜。
与传统的静态2d 培养相比, 宿主遗传背景在易受乙肝病毒感染方面可以忽略不计, 所有经过检测的肝细胞捐献者都能建立乙肝病毒感染4。
即使患者衍生的 hbv 建立感染的3d 培养, 它是必要的利用 peg 沉淀和蔗糖缓冲纯化 hbv, 每当使用诱导乙肝病毒生产者细胞系生成病毒接种。直接应用于三维片上肝培养的细胞培养上清液, 无论是通过抑制因子的存在, 还是由于目前的生长因子与肝细胞不相容, 都不会轻易导致感染。此外, 在选择患者衍生的病毒接种时, 应只使用血清, 因为血浆不可避免地凝固和堵塞培养平台的微流化循环。
无论使用何种病毒接种, 确保细胞活力和分化, 以及确保完全去除最初的乙肝病毒接种, 都是成功进行长期感染研究的关键。最方便的方法是在清除病毒接种后对培养物进行采样, 并在整个培养过程中测量人血清白蛋白水平。值得注意的是, 与所有其他描述的平台一样, 乙肝病毒感染一旦建立, 就不会轻易扩散到未感染的细胞。这方面的潜在机制仍然难以捉摸, 因为体内的乙肝病毒感染很容易感染肝脏中的大部分肝细胞。
关于 phh 和 kupffer 细胞的共泡, 建议对 kupffer 细胞进行大量测试, 以评估 il6 和 tnfα分泌对 lps 刺激的反应, 因为并非所有市售的库弗细胞捐献者都有相同的反应能力。
重要的是, 对于所有药物治疗或培养物与乙肝病毒的初步感染, 在计算药物或接种浓度时, 必须考虑到井的总量 (1.4 毫升) 以及微流体通道 (0.2 毫升)。为了保证准确的剂量, 与含有乙肝病毒的介质或药物进行了一个清洗步骤, 以保证微流体通道。
该平台使用 600, 000 phh 每口井, 这确保多层肝细胞在支架内。即使细胞数量可以变化, 所选择的细胞浓度可确保最佳的结果。平板格式共容纳 1 2个脚手架, 可升级为 3 6个脚手架。然而, 由于微流体的要求, 到更高的井数到现在是不可能的。
使用这些方法, 培养物可以保持至少40天的最佳细胞性能, 到目前为止, 这提供了前所未有的机会来评估新的候选药物, 以及研究不同肝细胞之间的复杂相互作用乙肝病毒感染期间的人群。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由欧洲研究理事会 (637304)、wellcome 信托调查员奖 (10477\ z\ z\ z) 和 cn bio 创新公司提供的一笔赠款资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| William's E Medium, no phenol red | GIBCO | A12176-01 | |
| Hepatocyte Thaw Medium | GIBCO | CM7500 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | GIBCO | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | GIBCO | CM4000 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Advanced DMEM | GIBCO | 12491023 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-144 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | GIBCO | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture | SIGMA | 12106C | |
| Hydrocortisone | SIGMA | H0888 | |
| Trypan blue | Merck | T8154 | |
| Collagen from calf skin | Merck | C9791 | |
| G418 | SIGMA | G418-RO | |
| Tetracycline | SIGMA | T3258 | |
| Polyethylene glycol 8000 | SIGMA | P2139 | |
| Sucrose | SIGMA | SO389 | |
| Sodium carbonate anhydrous | SIGMA | 451614-25G | |
| Sodium bicarbonate | SIGMA | S5761 | |
| Sodium azide | SIGMA | S2002-5G | |
| Sulfuric acid, 99.999% | SIGMA | 339741 | |
| 4% Paraformaldehyde | SIGMA | 252549 | |
| Triton-X 100 | SIGMA | X100 | |
| Tween 20 | SIGMA | P1379 | |
| DAPI | SIGMA | D9564 | |
| Albumin (human) | SIGMA | A9731 | |
| Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP9701-100 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | |
| SYBR Select Master Mix | Applied Biosystems | 4472903 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits/Consumables | |||
| Sterile membrane | CN Bio innovations | LC-SC | |
| LiverChip Perfusion cell culture plate | CN Bio innovations | LC12 | |
| LiverChip culture plate lid | CN Bio innovations | LC-SC | |
| Sterile round filter paper | CN Bio innovations | LC-SC | |
| Cell attachment scaffold | CN Bio innovations | LC-SC | |
| Retaining ring | CN Bio innovations | LC-SC | |
| Sterile plunger | CN Bio innovations | LC-ST | |
| Dneasy blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| Human Magnetic Luminex assay | R&D Systems | ||
| 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 4368814 | |
| QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set | Qiagen | 1048147 | Containing RNA carrier |
| Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile | Millipore (Merck) | PFHYS1008 | |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Life technologies | 4309849 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Life technologies | 4311971 | |
| Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 442404 | |
| Sealing Tape for 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane | ThermoFisher Scientific | 295-3345 | |
| Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost | Fisher Scientific | FB58628 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 344058 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells / Cell lines | |||
| Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified | Thermo Fisher Scientific | HMCPTS | |
| Cryopreserved Human Kupffer Cells | Thermo Fisher Scientific | HUKCCS | |
| HepDE19 cell line | Haitao Guo (Indiana University, IN, USA) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers/Probes/Standards | |||
| HBV DNA forward primer | Invitrogen | 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3' | |
| HBV DNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3' | |
| HBV DNA probe | Invitrogen | 5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA | |
| pgRNA forward primer | Invitrogen | 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3' | |
| pgRNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3' | |
| RPS11 forward primer | Invitrogen | 5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3' | |
| RPS11 reverse primer | Invitrogen | 5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3' | |
| pCMV-HBV | Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal) | DAKO | discontinued | Lot 10102505 |
| Human Albumin Antibody, A80-129A | Bethyl Laboratories. inc | A80-129A | |
| Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P | Bethyl Laboratories. inc | A80-229P | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | # A-11072 | Lot 1431810 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| LiverChip Vacuum pump | CN Bio innovations | LC-PN | |
| LiverChip Pneumatic Hookup | CN Bio innovations | LC-PN | |
| LiverChip platform | CN Bio innovations | LC-PN | |
| LiverChip plate washing dock | CN Bio innovations | ||
| Autoclavable metal forceps | VWR | 232-0106 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries | SKU: SI-0236 | |
| Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004500 | |
| SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow | MGE worldwide | SAM12/01010101 | |
| NUAIRE 5800 SERIES incubator | NUAIRE | NU-5841 | |
| Automated precision torgue | CN Bio innovations | ||
| Manual torque | CN Bio innovations | ||
| LiverChip compressor | CN Bio innovations | ||
| Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1 | Luminex | ||
| Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block | ThermoFisher Scientific | Millipore™ 40-285 | |
| FluoStar Optima Plate Reader | BMG Labtech | ||
| KOLVER Precision electric screwdrivers | VTECH ltd | FAB10RE/FR | |
| KOLVER Power supply | VTECH ltd | EDU1FR | |
| BAMBI VTS75D | Air Equipment | Discontinued | |
| Integra Vacuboy | INTEGRA | ||
| ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453536 |
References
- Verrier, E. R., Colpitts, C. C., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. F. Cell Culture Models for the Investigation of Hepatitis B and D Virus Infection. Viruses. 8 (9), (2016).
- Elaut, G., et al. Molecular mechanisms underlying the dedifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures. Current Drug Metabolism. 7 (6), 629-660 (2006).
- Konig, A., et al. Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes. Journal of Hepatology. 61 (4), 867-875 (2014).
- Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682 (2018).
- Allweiss, L., Dandri, M. The Role of cccDNA in HBV Maintenance. Viruses. 9 (6), (2017).
- Guo, J. T., Guo, H. Metabolism and function of hepatitis B virus cccDNA: Implications for the development of cccDNA-targeting antiviral therapeutics. Antiviral Research. 122, 91-100 (2015).
- Lucifora, J., et al. Direct antiviral properties of TLR ligands against HBV replication in immune-competent hepatocytes. Scientific Reports. 8 (1), 5390 (2018).
- Hosel, M., et al. Hepatitis B Virus Activates Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Supporting Hepatocyte Survival and Virus Replication. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (3), 339-363 (2017).
- Mazza, G., et al. Rapid production of human liver scaffolds for functional tissue engineering by high shear stress oscillation-decellularization. Scientific Reports. 7 (1), 5534 (2017).
- Hang, T. C., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G., Stolz, D. B. Lipids promote survival, proliferation, and maintenance of differentiation of rat liver sinusoidal endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (3), G375-G388 (2012).
- Hwa, A. J., et al. Rat liver sinusoidal endothelial cells survive without exogenous VEGF in 3D perfused co-cultures with hepatocytes. The FASEB Journal. 21 (10), 2564-2579 (2007).
- Khetani, S. R., Bhatia, S. N. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).
- March, S., et al. Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens. Nature Protocols. 10 (12), 2027-2053 (2015).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
- Griffith, L. G., Wells, A., Stolz, D. B. Engineering liver. Hepatology. 60 (4), 1426-1434 (2014).
- Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).
