Summary
이 프로토콜의 목표는 B 형 간염 바이러스와 3 차원 "간-온-어-칩" 감염 실험을 수행 하는 단계별 가이드를 제공 하는입니다.
Abstract
어디 3 바이러스 성 게놈은 실험적으로 감염 된 침팬지의 chronicity에서 발생할 수 있습니다, vivo에서, B 형 간염 바이러스 (HBV)의 뛰어난 infectivity에도 불구 하 고 대부분 체 외 모델 셀 당 바이러스 성 게놈의 수천 수백 필요 일시적인 감염을 시작 하는 순서입니다. 또한, 기본 인간의 hepatocytes (PHH)의 정적 2D 문화 때문에 그들의 급속 한 dedifferentiation 단기 연구만 허용합니다. 여기, 우리가 monocultures 또는 다른 nonparenchymal 간 상주 셀 cocultures PHH의 3D 칩에 간 문화를 설명합니다. 이러한 생리 적인 호스트 세포 응답 장기 HBV 감염을 공부 하 고 상당한 개선을 제공 합니다. 약물 효능 연구, 독물학 분석, 그리고 병 인에 대 한 조사를 촉진, 뿐만 아니라 이러한 미세 문화 시스템 사용 covalently 폐쇄, 제거 목적으로 HBV 감염에 대 한 치료 치료의 평가 원형 (ccc) DNA입니다. 이 방법을 제시 설명 PHH monocultures PHH/Kupffer 세포 공동 문화, 그들의 순화 HBV 감염 및 호스트 응답의 분석 설정을 합니다. 이 방법은 특히 HBV 감염, 치료의 조합, 그리고 병의 장기 효과의 평가에 적용 됩니다.
Introduction
HBV의 연구 시작 감염1셀당 HBV 게놈 사본의 수천 수백을 요구 하는 문화 시스템의 가난한 민감성에 의해 복잡 하 게 되어 있다. 또한, 기본 인간의 hepatocytes는 일반적으로 매우 약 하 고 빠르게 기존의 문화2동안 dedifferentiate. 이건 평평 하 고 단단한 플라스틱 표면의 자연 extracellular 환경 간 및 미세 순환의 부재에서 문화의 산소의 일반적인 부족 내에서 발견 모방 하지 않습니다는 사실 때문에 주로. 콜라겐 코팅 판에 기존의 정적 hepatocyte 문화는 급속 하 게 dedifferentiate 하 고 HBV 감염3그들의 민감성을 잃게됩니다. 여기, 우리가 설명 설정과 PHH 콜라겐 코팅 판 확장된 그들의 신진 대사와 기능 능력 때문에 기존의 2D 정적 PHH 문화 훨씬 유리한 끝났다, 3D 칩에 간 문화에서 자란의 감염을 촉진 적어도 40 일4의 장기 문화. 이 시스템에서 PHH 지속적으로 세포에 산소와 양분을 공급 성장 매체와 함께 끼얹는다는 콜라겐 코팅 건설 기계에 시드 있습니다. PHH 대안 문화 시스템에 따라 비록 murine 섬유 아 세포 또는 spheroids 3D 성장의 복잡 한 cocultures 검증 된 고 셀, 3D 당 500 게놈 등가물 (GE) HBV의 감염의 복합성을 사용 하 여 HBV 감염에 취약 간 온 칩 문화 유일한 체 외 모델 시스템 0.05에 취약 남아 GE의 HBV 셀4당. 이것은 또한 underpinned 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 및 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG)의 높은 농도 사용 하 여 HBV 감염을 확립의 필요성에 의해 이러한 문화에는 3D 칩에 간 문화 시스템의 감염을 위한 불가결 4. HBV의 주요 특징 중 감염 모든 드 노 보-생산 virions5,6transcriptional 템플릿 역할을 하는 cccDNA 풀 이다. 여부 cccDNA의 규칙 및 그것의 제거를 겨냥 하는 어떤 치료 접근은 지에 부분적으로 불분명 남아 비록 cccDNA 기존의 hepatocyte 문화7,8에서 검출 될 수 있다, 또는 완전히 dedifferentiated hepatocytes입니다. 우리는 cccDNA 3D 칩에 간 문화에서 형성 기능, 생리 적 자극에 응답 그리고 transcriptional 기계 cccDNA 게놈4의 접근을 방해 하 여 타겟팅 할 수 있습니다 나타났습니다.
그 관찰 HBV에 감염 된 환자에서 치료 성공으로 감염, 바이오 마커의 식별을 사용 하는 3D 간 온 칩 모방에서 HBV 감염 호스트 응답 합니다. 간 온 칩 문화의 독특한 기능 중 PHH와 Kupffer 세포4, 방사상 세포9및 간 정현파를 포함 하 여 간 내의 다른 nonparenchymal 셀 사이 장기 호스트 응답을 평가 하는 기능이입니다. 내 피 세포10,11. 이 복잡 한 3D microenvironment 상호 작용/셀을 평가 하는 독특한 기회를 제공 합니다.
또한,이 플랫폼의 확장된 문화 기간 용이 불가능 기존의 hepatocyte 문화 시스템을 사용 하 여 순차 약물 치료의 평가 및 HBV 지 속성에 미치는 영향.
이 프로토콜에 설명 합니다 어떻게 3D 간-온-어-칩 PHH의 monocultures 또는 Kupffer 세포 PHH의 cocultures에 대 한 문화 생성 됩니다. 또한, 우리 정화 HBV 감염의 낮은 다중성 연구의 생산 뿐만 아니라 호스트와 바이러스 응답의 후속 분석을 설명합니다.
Protocol
1. 어셈블리 및 플레이트의 평형
- 압축기와 진공 펌프 LiverChip 플랫폼 연관 켜져 있는지 확인 합니다. 클래스 II 캐비닛에서 어셈블리 및 플레이트의 재래식을 수행 합니다.
- Aseptically 플레이트 기지 사이 살 균 막 배치 잘 포함 상단 플레이트 (그림 1a)를 추가 하 여 미세 접시를 조립.
- 그 살 균 막 원활 하 게 달려있다 베이스 플레이트의 두 개의 핀에 고르지 못한 막 배치 타협부터 미세 순환을 확인 합니다.
- 살 균 접시 뚜껑을 추가 하 고 33 파운드 시퀀스를 강화 하는 나선형을 사용 하 여 자동화 된 정밀 토크를 사용 하 여 접시의 기지에서 나사를 조입니다. 수동 토크를 사용 하 여 35 파운드 모든 나사 강화는 확인 하십시오. 이 단계 동안 나사 대칭으로 강화 하는 것을 확인 (그림 1a).
- Hepatocyte 시드 중간 포함 윌리엄스 전자 매체, 기본 hepatocyte 녹고, 및 보충 교재, 5% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 그리고 못쓰게 하기 전에 37 ° C에 1 µ M dexamethasone 도금 prewarm
- 세척 선 창 내에서 그것을 배치 하 고 매체의 각 저수지 쪽에 시드 hepatocyte의 400 µ L을 추가 하 여 완전히 조립된 플레이트를 프라임. 접시 세척 선 창으로 완전히 넘어간 확인 합니다.
- 1 µ L/s에서 3.5 분 상승 방향에서 흐름을 시작 합니다. 미세 순환의 성공적인 기능 플레이트 (그림 1a)의 옆에 빨간 지표를 통해 확인 될 수 있습니다.
- 매체는 접시의 세포 성장 쪽으로 양수 된다, 일단 매체 시드 hepatocyte의 추가 1.2 mL 추가 흐름 채널의 정확한 어셈블리를 확인 합니다.
- 신중 하 게 접시를 37 ° C, 5% CO2 습도 인큐베이터 내에서 도킹 스테이션에 전송 하 고 1 µ L/s 16 h (그림 1c)의 유량에서 위쪽 방향으로 흐름 시작.
- 접시 세척 dock에 전송 하 고 부드럽게 위아래로 pipetting으로 잘에서 거품을 제거.
- 살 균, 필터 종이, 셀 첨부 비 계 및 소독 집게를 사용 하 여 각 우물에 고정 링 라운드 하나 추가 합니다. 살 균 플런저와 각 잘 눌러 고정 고리와 건설 기계 (그림 1b)에 고정.
- 모든 매체를 발음 및 발판 위에 부드럽게 prewarmed hepatocyte 시드 매체의 400 µ L을 추가 하 고 1 µ L/s에서 3.5 분 하향 방향으로 흐름을 시작.
- Aspirate 모든 중간 접시의 저수지 쪽에 밖으로 펌핑. 이 단계는 흐름 채널에 포함 된 매체를 대체 하는 데 필요한.
- 잘 당 총 볼륨을 완료 하려면 dock에 접시를 반환 하기 전에 각 잘 매체 시드 hepatocyte의 1.4 mL를 추가 합니다. 잘 당 볼륨은 지금 1.6 mL (1.4 mL에 잘 그리고 흐름 채널에서 0.2 mL).
2. 해빙 및 Monocultures 위한 Hepatocytes의 시드
- Hepatocyte 매체와 hepatocyte 시드 매체 공급 업체의 지침에 따라 PHH의 한 유리병을 녹고 전에 37 ° C에 녹고 prewarm 갑작스러운 온도 변화를 피하기 위해이 단계 동안 상 온에서 원심 분리기를 사용 합니다. 녹고는 및 클래스 II 캐비닛에서에서 hepatocytes의 시드를 수행 합니다.
- Hepatocyte 시드 매체의 1 mL에 셀 resuspend 고 trypan 블루를 사용 하 여 셀. 세포의 90% 이상 인지 확인 합니다.
- 우물에 추가 될 때까지 얼음에 셀을 계속.
- 세척 선 창에 equilibrated 하 고 완벽 하 게 조립 플레이트를 전송 하 고 우물에서 모든 매체를 발음.
- 600000 hepatocytes 각 잘 hepatocyte 시드 매체의 500 µ L 볼륨에 추가.
- 1 µ L/s 흐름 속도 하향 방향으로 흐름을 시작 하 고 매체 시드 hepatocyte의 900 µ L을 추가 하 여 1.6 mL를 잘 총 볼륨 가져.
- 접시 5% CO2와 37 ° C에서 습도 인큐베이터 내에서 도킹 스테이션에 전송 합니다.
- 8 시간, 8 h 1 µ L/s 흐름 속도에서 위쪽 방향으로 흐름 반전 뒤 1 µ L/s 흐름 속도 하향 방향으로 흐름을 시작 합니다.
- 접시 세척 dock에 전송 하 고 우물에서 모든 매체를 발음.
- 3.5 분 1 µ L/s 흐름 속도 하향 방향으로 잘 하 고 시작 각 흐름에 hepatocyte 유지 보수 매체 (윌리엄스 전자 매체 hepatocyte 유지 관리 보충 교재와 100 nM dexamethasone 보충)의 400 µ L를 추가 합니다.
- 저수지에서 모든 매체를 발음 하 고 hepatocyte 유지 보수 매체 (그림 1의 d)의 1.4 mL를 추가 합니다.
- Hepatocyte 유지 보수 매체 마다 48 h에 매체를 바꿉니다. 모든 매체는 잘에서 교체 되도록 신선한 hepatocyte 유지 보수 매체의 추가 하기 전에 세척 단계를 수행 합니다.
- 세척 단계에 대 한 전송 접시 세척 선 창에, 우물에서 모든 매체를 발음 및 유지 보수 매체의 400 µ L을 추가.
- 우물의 저수지 쪽에 게재 하는 모든 매체 1 µ L/s 3.5 분 Aspirate 하향 방향으로 흐름을 시작 합니다.
- 37 ° C에서 그리고 5% CO2hepatocyte 유지 보수 매체의 고 습도 인큐베이터 내에서 1.4 mL을 추가 하 고 도킹 스테이션에 접시를 전송 1 µ L/48 h (그림 1 층)에 대 한 s의 유량에서 위쪽 방향으로 흐름을 시작.
참고: Hepatocyte monocultures 제어 조건을 보장 cocultures에 대 한 컨트롤 사용에 대 한 유지 보수 매체의 두 번째 종류는 기본 인간의 Kupffer 세포와 cocultures에 사용 하기 위해 특정 사용 됩니다. 48 h hepatocyte 유지 보수 매체 (3 일 후 시드)와 매체 시드 hepatocyte 교체 후 일반 hepatocyte 유지 보수 매체 coculture 유지 보수 매체 II, 특히 monocultures PHH 비교할 때의 대체 됩니다 중간 컴포넌트로 PHH와 Kupffer 세포의 cocultures는 약간 다릅니다.
3. 해빙 및 공동 문화에 대 한 Kupffer 세포와 Hepatocytes의 시드
- 결과의 정확한 비교를 위해, 항상 PHH/Kupffer 세포 cocultures PHH monocultures 비교
- Cocultures PHH Kupffer 세포의 해 동 한 유리병 고급에 Kupffer 세포의 Dulbecco의 dexamethasone 없이 글의 중간 (AdDMEM)을 수정 했지만 기본 hepatocyte 녹고 보충 및 도금 (coculture 매체를 뿌리기)에 따르면 보충 에 공급 업체의 지침. 녹고는 및 Kupffer 세포와 클래스 II 캐비닛에서에서 hepatocytes의 시드를 수행 합니다.
- Resuspend coculture 매체를 시드 1 mL에 셀과 trypan 블루를 사용 하 여 셀. 세포의 90% 이상 인지 확인 합니다.
- 얼음을 세포 접착을 피하기 위해 우물에 그들을 추가 하기 전에 셀을 계속.
- 기본 인간 hepatocytes의 해빙에 대 한 2.1-2.3 단계에서 지침을 따릅니다.
- 세척 선 창에 equilibrated 하 고 완벽 하 게 조립 플레이트를 전송 하 고 우물에서 모든 매체를 발음.
- 60000 Kupffer 세포 및 600000 hepatocytes 250 µ L 각 매체를 시드 coculture의의 전체 볼륨에 있는 각 음을 추가 합니다.
- 1 µ L/s 흐름 속도 하향 방향으로 흐름을 시작 하 고 coculture 시드 각 잘 매체의 900 µ L를 추가 합니다.
- 접시 5% CO2와 37 ° C에서 습도 인큐베이터 내에서 도킹 스테이션에 전송 합니다.
- 8 시간, 8 h 1 µ L/s 흐름 속도에서 위쪽 방향으로 흐름 반전 뒤 1 µ L/s 흐름 속도 하향 방향으로 흐름을 시작 합니다.
- 접시 세척 dock에 전송 하 고 우물에서 모든 매체를 발음.
- Coculture 유지 보수 매체의 400 µ L 추가 나 (hepatocyte 유지 관리 보충 교재 보충 하지만 dexamethasone 없이 AdDMEM) 3.5 분 1 µ L/s 흐름 속도 하향 방향으로 잘 하 고 시작 각 흐름에.
- 저수지 쪽에서 모든 매체를 발음 하 고 1.4 mL coculture 유지 보수 매체의 추가 나 각 잘 하.
- 접시 5% CO2 와 37 ° C에서 습도 인큐베이터 내에서 도킹 스테이션에 전송 하 고 1 µ L/48 h에 대 한 s의 유량에서 위쪽 방향으로 흐름을 시작.
- 접시 세척 dock에 전송 하 고 우물에서 모든 매체를 발음. Coculture 유지 보수 매체 II (100 nM 날린 hepatocyte 유지 보수 보충으로 보충 하지만 dexamethasone 없이 윌리엄스 전자 매체)의 400 µ L을 추가 하 고 1 µ L/s 3.5 분 하향 방향으로 흐름을 시작.
- 우물의 저수지 쪽에 게재 하는 모든 중간 발음
- Coculture 유지 보수 매체 II의 1.4 mL을 추가 하 고 접시 5% CO2와 37 ° C에서 습도 인큐베이터 내에서 도킹 스테이션에 전송.
- 48 h (그림 1e)에 대 한 1 µ L/s 흐름 속도에서 위쪽 방향으로 흐름을 시작 합니다.
- Coculture 유지 보수 매체 II에 매체를 마다 48 h 바꿉니다. 모든 매체는 잘에서 교체 되도록 신선한 매체의 추가 하기 전에 세척 단계를 수행 합니다.
- 씻고, 접시 세척 선 창에 전송 하 고, 우물에서 모든 매체를 발음 coculture 유지 보수 매체 II의 400 µ L을 추가.
- 우물의 저수지 쪽에 게재 하는 모든 매체 1 µ L/s 3.5 분 Aspirate 하향 방향으로 흐름을 시작 합니다.
- Coculture 유지 보수 매체 II의 1.4 mL을 추가 5% CO2, 37 ° c와 습도 인큐베이터 내에서 도킹 스테이션에 접시를 전송 하 고 1 µ L/48 h (그림 1 층)에 대 한 s의 유량에서 위쪽 방향으로 흐름을 시작.
4. 감염 연구에 대 한 전염 성 간염 B 바이러스의 생산
- 봉쇄 수준 III 실험실에서에서 프로토콜의이 섹션을 수행 합니다. 시드, 매체 변경, 중간 컬렉션 및 클래스 II 캐비닛에서에서 바이러스 농도 할.
- 완전 한 DMEM/F12 (10 %FBS, 페니실린/steptomycin, 불필요 한 아미노산, 500 μ g/mL G418, 및 1 μ g/mL 항생물질)의 120 ml T1000 5 층 플라스 크 콜라겐 코팅에서 HBV 생산 세포 (HepDE19, HepAD38)를 문화 90 %confluency 도달할 때까지.
- HBV 생산을 유도 하기 위해 매체 유도 매체 (완전 한 DMEM 항생물질 없이) 변경 합니다.
- 완전 한 중간 볼륨 항생물질의 12 일 후 철수에 대 한 모든 48 h를 수집 하 고 4 ° c.에 그것을 저장합니다
- 0.45 μ m 병 상위 필터를 통해 수집 된 매체를 필터링 합니다.
- 4 %w / w의 최종 농도에 수집 된 매체에 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 메 마른 목이 8000를 추가, 반전 8 x-10 x, 혼합 및 16 h. 원심 분리기 10000 x g 못 시 켰 던 바이러스를 수집 하 고 resuspend에 4 ° C에서 1 시간에 4 ° C에서 품 어 10%를 포함 하는 PBS에 펠 릿 FBS.
- 모든 수확 시간 포인트에서 못 시 켰 던 바이러스를 결합 하 고 20% 자당 쿠션 위에 레이어. SW28로 터를 사용 하 여 4 ° C에서 16 h 140000 x g 에서 원심.
- 상쾌한 발음 하 고 10 %FBS, 약 수와 보충 하는 PBS에 펠 릿 resuspend-80 ° c.에 그것을 저장합니다
- HBV DNA 정량 (6 단계) 여는 상쾌한에 HBV DNA 복사본 수를 결정 합니다.
5입니다. 3D 문화 HBV 감염
- 클래스 II 포함 레벨 III 실험실 내 캐비닛에서 감염을 수행 합니다.
- 시드 monocultures 또는 cocultures, 후에 3 일 실 온에서 aliquots 포함 하는 HBV의 필요한 수를 해 동 하 고 필요한 바이러스 복용량 hepatocyte 유지 보수 매체 또는 잘, 당 coculture 유지 보수 매체 II 1.8 ml을 각각 희석.
- 이 1.8 mL 희석된 바이러스는 세척 단계 (400 µ L) 및 매체에 잘 (1.4 mL)의 교체에 대 한 충분 한. 그러나, 감염의 필요한 다양성 1.6 mL의 최종 문화 볼륨에 대 한 계정 조정 될 필요가 있다.
- 접시 세척 dock에 전송 하 고 우물에서 모든 매체를 발음. HBV 포함 된 매체의 400 µ L을 추가 하 고 우물의 저수지 쪽에 모든 매체 게재 1 µ L/s 3.5 분 Aspirate 하향 방향으로 흐름을 시작.
- HBV 포함 된 유지 보수 매체/coculture 유지 보수의 중간 2 차 당 고 접시 5% CO2와 37 ° C에서 습도 인큐베이터 내에서 도킹 스테이션에 전송 1.4 mL를 추가 합니다. 1 µ L/s 흐름 속도에서 위쪽 방향으로 반전 뒤 8 h 1 µ L/s 흐름 속도 하향 방향으로 흐름을 시작 합니다.
- HBV, 추가 다음 24 h 접시 세척 dock에 전송 하 고 우물에서 모든 매체를 발음.
- 각 씻어 접시에 잘 문화의 유형에 따라 해당 매체와 3 배에 설명 된 대로 단계 2.12-2.14, 우물에서 남은 바이러스를 제거 하. 단계 2.12-2.14, 달리 제외 inoculum carryover (그림 1 g)을 샘플링을 추가 볼륨에 대 한 계정에 모든 잘 매체의 1.6 mL을 추가 합니다.
- 다음 세척 단계, extracellular HBV DNA의 정량화 하 여 HBV inoculum의 완전 한 제거를 확인 하려면 각 우물에서 매체의 200 µ L를 수집 합니다.
- 접시 5% CO2, 37 ° c와 습도 인큐베이터 내에서 도킹 스테이션에 전송 하 고 1 µ L/48 h에 대 한 s의 유량에서 위쪽 방향으로 흐름을 시작.
- 48 h 후, hepatocyte 유지 보수 매체와 3 세척 단계 2.12-2.14에에서 설명 된 대로 다음 다운스트림 분석에 대 한 완전 한 잘 볼륨을 수집 합니다. 매체를 장착 하 고 실험 종료까지 모든 48 h x 3 각 잘 씻어.
6입니다. 세포 외 HBV DNA의 정량화
- 다른 지역에 그들을 이동 하기 전에 샘플에서 바이러스 비활성화 되도록 캐리어 견제 수준 III 실험실에 있는 RNA의 1 µ g의 추가 함께 제조업체의 지침에 따라 문화 supernatants에서 전체 DNA를 분리.
- 정량 PCR 마스터 믹스, 600 nM 앞으로 뇌관, 600 nM 역방향 뇌관, 포함 하는 마스터 믹스를 준비 및 300 nM의 조사.
- 384-잘 접시의 각 음에 마스터 믹스의 7 µ L를 추가 합니다.
- 중복, 아니 템플릿 컨트롤 및 반응의 각 음에 반응 당 102 부 당 109 복사본에서 이르기까지 순차적으로 희석된 HBV 게놈 포함 된 플라스 미드 기반 표준의 (예를 들어, pCMV-HBV) 중복 DNA 샘플의 5 µ L를 추가 합니다 정량 Pcr 플레이트입니다.
- 접시 위에 접착 커버를 놓고는 각각 잘 밀폐 되어 올바르게 확인 합니다.
- 300 x g에서 1 분 동안 접시 원심
- 정량 Pcr 제조업체의 지침에 따라 실행을 시작 합니다. 실시간 PCR 주기 조건은 95 ° C의 40 주기 다음 10 분 동안 95 ° C 15 s를 1 분 동안 60 ° C.
- 표준 곡선에 따라 알 수 없는 샘플 내에서 HBV DNA 사본의 수를 계량.
7. 세포내 HBV Pregenomic (pg) RNA의 정량화
- 제조업체의 지침에 따라 건설 기계에서 총 RNA 격리. 완전 한 세포 세포의 용 해를 위해, 소용돌이 각 발판 3 x 30에 대 한 s 뒤에 1 분 동안 300 x g 에서 원심 분리 하 여 각 vortexing 사이. 봉쇄 레벨 다른 지역에 그들을 이동 하기 전에 샘플에서 바이러스 비활성화 되도록 III 실험실에서에서 세포 세포의 용 해를 수행 합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 격리 된 RNA 로부터 cDNA 녹음
- retrotranscription 주기 조건은 10 분, 120 분 동안 37 ° C 25 ° C 및 5 분 동안 85 ° C.
- 4 ° C에서 cDNA 샘플을 계속 단기 또는 장기 저장을 위한-20 ° C에서.
- PgRNA 및 RPS11 포함 된 정량적 PCR 마스터 믹스 0.2 µ M의 최종 농도에 pgRNA 및 RPS11 (하우스키핑 유전자로 사용)에 대 한 앞으로 역 뇌관 마스터 믹스를 준비 합니다.
- 384-잘 접시에 마스터 믹스의 7.5 µ L와 잘 당 cDNA의 2.5 µ L를 추가 합니다. RPS11 및 pgRNA에 중복 각 샘플의 측정 하 고 잘 두 유전자에 대 한 노-템플릿 컨트롤 포함.
- 접시 위에 접착 커버를 놓고는 각각 잘 밀폐 되어 완전히 확인 합니다.
- 300 x g에서 1 분 동안 접시 원심
- 정량 cycler에 접시를 넣고 정량 제조업체의 지침에 따라 표준 정량 PCR 프로토콜을 사용 하 여 실행을 시작 합니다. 사이클 실시간 PCR 위한 조건은 50 ° C 95 ° C의 40 주기 뒤에 2 분, 2 분 동안 95 ° C 15 s를 1 분 동안 60 ° C.
- RPS11 기준으로 pgRNA의 식을 계산 합니다.
8. 면역 형광 검사 바이러스 성 항 원의 얼룩
- 우물에서 고정 링을 제거 하 고 클래스 제약 레벨 III 실험실에서 2 내각에서에서 집게로 발판을 제거.
- 봉쇄 수준 III 실험실에서에서 실 온에서 30 분 PBS의 1 mL에 4 %paraformaldehyde 셀이 포함 된 건설 기계를 수정 합니다. 다른 지역에서 다음 단계를 수행할 수 있습니다.
- 3 건설 기계 세척 1 mL의 PBS와 x.
- 0.1%를 사용 하 여 세포를 permeabilize 실 온에서 1 h에 대 한 PBS의 1 mL에 트리톤 X 100.
- 3 건설 기계 세척 1 mL의 PBS와 x.
- 16 h 4 ° c.에 대 한 PBS의 1 mL에 1 %BSA 건설 기계 외피에 의해 블록 비 특정 바인딩
- 3 건설 기계 세척 1 mL의 PBS와 x.
- 1 차적인 항 체 얼룩이 16 h 4 ° c.에 대 한 PBS의 1 mL에 1 %BSA 1: 200의 희석에 토끼 반대로 간염 B 바이러스 코어 항을 사용 하 여 수행
- 1 건설 기계 세척 0.1 %x 트윈 PBS (PBS-트윈)의 1 mL에 1 mL의 PBS로 3 배.
- 이차 항 체를 사용 하 여 얼룩 수행 염소 안티 토끼 IgG (H + L) 크로스 흡착 알 렉 사 Fluor 594 활용 된 이차 항 체 희석 16 h 4 ° c.에 대 한 PBS의 1 mL에 1 %BSA 1:2,000에서
- 1 건설 기계 세척 x 0.1%의 1 mL PBS-트윈 및 1 mL의 PBS로 3 배.
- 실 온에서 10 분 동안 2 µ g/mL의 농도에서 PBS의 1 mL에 DAPI를 사용 하 여 건설 기계 counterstain
- 1 건설 기계 세척 x 0.1%의 1 mL PBS-트윈 및 1 mL의 PBS로 3 배.
- 현미경 슬라이드에는 건설 기계를 전송 및 영상에 대 한 마운트.
- 형광 현미경을 사용 하 여 건설 기계를 이미지.
9. 인간의 알 부 민 애 란
- 전염 성 물질을 사용 하는 경우 포함 수준 III 실험실에에서 할당 된 클래스 II 캐비닛에서 프로토콜의이 섹션을 수행 합니다.
- PHH의 대사 기능과 생존 능력 평가, ELISA에 의해 인간의 알 부 민 생산을 평가 합니다.
- 염소 반대로 인간 항 체의 당 50 µ L 코트 96 잘 접시 희석 코팅 버퍼 (100 m m 중 탄산염/탄산염, pH 9.6)에서 1:800. 번호판을 커버 하 고 37 ° C에서 2 시간 또는 하룻밤 4 ° c.에 품 어
- 접시에서 코팅 항 체를 발음 하 고 그것을 씻어 0.05%의 200 µ L 4 x PBS-트윈.
- 블로킹 버퍼 (PBS에 1 %BSA)의 200 µ L을 추가, 커버 플레이트, 37 ° C에서 1 시간에 대 한 그들을 품 어 또는 3 개월에 대 한 그들을 4 ° C에서 저장. 장기 저장에 대 한 블로킹 버퍼를 0.05% 나트륨 아 지 드를 추가 합니다.
- 블로킹 버퍼를 발음 하 고 0.05%의 200 µ L 1 x 씻어 PBS-트윈.
- 잘 (1: 100) 당 이전 희석된 샘플의 50 µ L를 추가 합니다. 샘플 희석 액 0.05%에서 1 %BSA 포함 PBS-트윈. 37 ° C에서 1 시간 또는 하룻밤 4 ° c.에 품 어
참고: 샘플으로 동시에 표준 품 어. 농도 범위 500-0.488의 ng/mL (1:2 직렬 희석)는 것이 좋습니다. 샘플 희석 액에 인간의 알 부의 모든 직렬 희석을 수행 합니다. - 접시에서 샘플을 발음 하 고 그것을 씻어 0.05%의 200 µ L 4 x PBS-트윈.
- HRP 활용 된 염소 항 인간의 알 부 민 항 체의 50 µ L 이전 1:10,000 샘플 희석 액에 희석을 추가 합니다. 37 ° C에서 2 시간 또는 하룻밤 4 ° c.에 품 어
- 접시에서 항 체를 발음 하 고 그것을 씻어 0.05%의 200 µ L 6 x PBS-트윈.
- TMB 시 약의 100 µ L을 추가 하 고, 최대한 빨리 가장 높은 표준을 완벽 하 게 개발 하 고, 추가 100 µ L 1 M H2이렇게4 색도계 반응을 중지.
- 450에서 흡 광도 읽고 분석에 대 한 96 잘 접시 리더에 nm.
10. 인터 루 킨 (IL) 6와 3D 공동 문화에 종양 괴 사 인자 (TNF) α 생산
- 전염 성 물질을 사용 하는 경우 포함 수준 III 실험실에에서 할당 된 클래스 II 캐비닛에서 프로토콜의이 섹션을 수행 합니다.
- 계량 기능 및 기본 Kupffer 세포의 생존 능력을 평가 하기 위해 IL6 TNFα 생산. Kupffer 세포에 의해 이러한 cytokines의 생산을 유도, 1 µ g/mL lipopolysaccharide (LPS) 후 48 h에 대 한 coculture 유지 보수 매체 II에에서 시드 9 d와 cocultures를 취급 합니다.
- 하루 11 후 시드에 각 우물에서 매체를 수확 하 고-80 ° c.에 그것을 저장합니다
- 적절 한 분석 결과 제조업체의 지침에 따라 문화 매체에서 IL6 및 TNFα 농도 측정 합니다.
Representative Results
우리는 기본 인간 Kupffer 세포 또는 hepatocytes 및 그들의 HBV 감염의 장기 문화에 대 한 간단 하 고 다양 한 플랫폼을 설명합니다. 기본 인간 세포는 지속적으로 성장 매체 (그림 1a)와 셀 perfuses 미세 플레이트 어셈블리 내에서 폴리스 티 렌 건설 기계 콜라겐 코팅에 시드.
보통만 안정적인 제한 시간 동안에 있는 기존의 문화 시스템, PHH 시간의 연장된 기간에 대 한 기능적으로 유지할 수 있습니다. 인간의 알 부 민, 기능 hepatocytes에 의해 은닉 되 고 간 대사의 평가 대 한 가장 좋은 표식으로 간주 됩니다, 안정적으로 그리고 높게 표현 된다 3D 문화에 의해 하루 40 포스트 시드 (그림 2)까지. Cocultures, 대 한 Kupffer 세포 기능과 생존 능력 (예: IL6 및 TNFα) 특정 cytokines의 분 비에 의해 평가할 수 있습니다. Cytokine 생산 측정, cocultures의 LPS 자극에 따라 캡처 기반 탐지 방법의 사용 것이 좋습니다 (그림 3).
셀은 PHH, 기능적 담 즙 canaliculi와 완전 한 셀 분극 (그림 2)을 보여주는의 뿌리기의 3 일 이내 간 microtissues를 형성 한다. 그들의 생리 적 세포 신진 대사를 유지 뿐만 아니라 이러한 문화 될 HBV 감염에 매우 취약. HBV DNA 및 다른 문화 시스템, 달리 다른 바이러스 성 마커 하루 2 감염 된 후 (그림 4)에서 쉽게 감지 된다. 분 비 바이러스 성 감염의 표식, 이외 hepatocyte 포함 된 건설 기계 문화에서 검색 하 고 수 바이러스 항 원의 면역 형광 탐지를 위해 사용 (예: HBsAg, HBcAg) (그림 4). 어디 기존의 hepatocyte 문화 요구 셀과 2 %DMSO 추가 당 적어도 500 HBV GE와 접종 하 고 4% 말뚝, 몇 가지 0.05 HBV GE로 DMSO의 페그 (그림 4)는 요구 하지 않고 3 차원 문화에 감염을 시작할 수 있습니다.
그림 1: 3 차원 칩에 간 문화의. (한) 이것은 문화 접시의 어셈블리에 대 한 도식 레이아웃 미세 순환의 설립을 위해. (b)이이 패널 표시를 포함 하 여 문화 웰 스의 근접 보기 필터 종이, 비 계, 그리고 유지 반지. (c)이이 패널은 문화를 뿌리기 전에 접시 평형의 과정을 보여 줍니다. 다음 두 개의 패널 시드 hepatocyte monocultures (d) 및 (e) hepatocyte/Kupffer 세포 cocultures의 과정을 보여줍니다. (f)이이 패널이 보여줍니다 세척 단계 중간 변경에 관련 된. (g)이이 패널 표시 inoculum의 제거를 포함 하 여 HBV 감염 설정. S.M. 시드 매체, mm은 = = 유지 보수 매체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 간장 microtissue 형성과 hepatocyte 생존. (한)이이 패널 표시 다음 microtissue 형성을 보여주는 3D hepatocyte monocultures의 경도 명시 이미지 시드. (b)이이 패널 표시 핵 (파란색)을 위해 문화권의 면역 형광 이미징 및 인간의 알 부 민 (녹색). (c)이이 패널 경도 총 알 부 민을 보여줍니다으로 ELISA 정한 조정 hepatocyte monocultures의 40 일 동안 알 부 민 생산을 셀 당. 표시 된 데이터는 평균 ± sd. 이 그림은 오르테가-데이비스 외.4에서 적응 시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 3 차원 cocultures에 Kupffer 세포 기능. 이러한 패널 표시 (의한) IL6 분 비 및 (b) TNFα hepatocyte monocultures과 hepatocyte/Kupffer 세포 cocultures 인간의 자기를 사용 하 여 결정으로 하루 9 게시물 시드에 것 추가 LPS에 시드 후 11 일 Luminex의 시험 이 그림은 오르테가-데이비스 외.4에서 적응 시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: HBV 감염 간 온 칩 문화에서. (한)이이 패널이 보여줍니다 HBcAg (레드), HBsAg (녹색), 및 핵 (파란색)의 면역 형광 검사 현미경 검사 법 검출 10 일 HBV와 문화의 감염. (b)이이 패널 문화의 문화 supernatants에서 HBV DNA의 정량화에 의해 결정으로 다른 복합성 감염의 사용 하 여 HBV 감염의 민감성을 보여줍니다. (c)이이 패널 내부 관리 유전자 RPS11 기준으로 HBV pgRNA의 경도 축적의 정량화를 보여줍니다. 표시 된 데이터는 평균 ± sd. 이 그림은 오르테가-데이비스 외.4에서 적응 시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여러 문화 모델 개발 증가 기능와 장 수, 각 차동 장단점 전시 PHH의 장기 문화를 유지 하는 도전 몰 았다. 그것은 이제 널리 인정 했다 PHH의 정적 2D 문화 매우 제한 된 양의 시간 hepatocyte 생물학의 특정 측면을 흉내내는. 따라서, micropatterned cocultures12,13,15, 회전 타원 체의 문화14,및 3D 칩에 간 문화16,17 빠르게 이러한 기본적인 시스템을 대체 하는. 생리 적인 환경을 제공 하기 위한 요구 사항은 종종 어려운 자연 인간 트로픽 경작의 underpinned 전염 성 질환, 특정 microenvironments를 활용 하는 것 그들의 호스트와 함께 coevolved 있다, 공부 하는 경우에 특히 전염 성 질환, C 형 간염 바이러스, HBV, 말라리아 등.
3D 칩에 간 문화를 수행 하는 가장 중요 한 단계는 처음 공급된 기본 셀 형식의 품질입니다. 이 세포는 그들의 준수 능력에 대 한 테스트 해야 하 고 plateable PHH 많은 성공적인 조직 형성 및 문화 생성을 위해 사용 되어야 한다. 갓 격리 PHH 사용할 수 있습니다, 비록 그들의 cryopreservation는 일반적으로 복잡 하며 특별 한 속도 제어 냉동 고.
기존의 정적 2D 문화, 달리 호스트 유전 배경 민감성 HBV 감염에 관한 무시할 이며 모든 따라서 멀리 테스트 hepatocyte 기증자 HBV 감염4을 설정할 수 있습니다.
환자 파생 HBV 감염 3D 문화의 설정, 그것은 절대적으로 못 시 켰 던 활용 하 고 자당 쿠션-정화 HBV 바이러스 inocula의 생성에 대 한 라인 유도할 수 있는 HBV 프로듀서 셀을 사용 하 여 언제 든 지. 셀 문화 supernatants 3D 칩에 간 문화, hepatocytes와 현재 성장 요인의 호환성 또는 억제 요인의 존재를 통해 직접 적용 쉽게 감염 발생 하지 않습니다. 또한, 선택할 때 환자 파생 바이러스 inocula, 혈 청만 사용 되어야 한다, 때문에 플라즈마 필연적으로 coagulates 문화 플랫폼의 미세 순환을 나 막 신.
바이러스 inoculum 사용에 관계 없이 초기 HBV inoculum의 완전 한 제거를 보장 뿐 아니라 세포 생존 능력 및 차별화, 확신은 성공적인 장기 감염 연구 열쇠 이다. 이렇게 하는 가장 편리한 방법은 문화 바이러스 inoculum의 제거 다음으로 문화 기간 동안 인간 혈 청 알 부 민 수준 측정 샘플링입니다. 노트, 모든 다른 기술된 플랫폼, HBV 감염, 유사 하 게, 않습니다 쉽게 확산 되지 감염 되지 않은 세포에. HBV 감염 vivo에서 쉽게 감염 간 내 hepatocytes의 대부분 이후이 대 한 기본 메커니즘 애매 남아 있습니다.
PHH와 Kupffer 세포의 cocultures에 관해서는 그것은 이후 모든 상용 Kupffer 세포 기증자는 동일한 응답 IL6 및 TNFα 분 비 LPS 자극에 대 한 응답에서을 평가 하 Kupffer 세포의 많은 테스트를 수행 하는 것이 좋습니다.
중요 한 것은, 모든 약물 치료 또는 HBV와 문화의 초기 감염, 우물의 (1.4 mL)도로 미세 채널 (0.2 mL), 총 볼륨 해야 합니다 수 고려 약물 또는 inoculum 농도의 계산에 대 한. 정확한 투약을 보장 하기 위해서 HBV 또는 약물을 포함 하는 매체와 한 세척 단계는 미세 채널 프라임 위해 수행 됩니다.
사용 하는 플랫폼은 건설 기계 내에서 다층된 hepatocytes 보장 잘 당 600000 PHH 활용 합니다. 휴대폰 번호는 변화 될 수 있지만 선택한 셀 농도 최적의 결과 보장 합니다. 플레이트 형식 12 건설 기계, 건설 기계 36에 격상 될 수 있는 총을 보유 하고있다. 그러나, 미세 요구 사항이 높은 잘 번호 확장 불가능 날짜 합니다.
이러한 방법을 사용 하 여, 문화 유지 될 수 있는 최적의 셀 성능을 가진 적어도 40 일 동안,까지, 새로운 약 후보자를 평가 하 고 다른 간 세포 사이 복잡 한 상호 작용을 공부 전례 없는 기회를 제공 HBV 감염 시의 인구
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 유럽 연구 위원회 (637304), Wellcome 신뢰 조사 수상 (104771/Z/14/Z)에서 시 동기 부여에 의해 그리고 CN 바이오 혁신에 의해 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| William's E Medium, no phenol red | GIBCO | A12176-01 | |
| Hepatocyte Thaw Medium | GIBCO | CM7500 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | GIBCO | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | GIBCO | CM4000 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Advanced DMEM | GIBCO | 12491023 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-144 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | GIBCO | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture | SIGMA | 12106C | |
| Hydrocortisone | SIGMA | H0888 | |
| Trypan blue | Merck | T8154 | |
| Collagen from calf skin | Merck | C9791 | |
| G418 | SIGMA | G418-RO | |
| Tetracycline | SIGMA | T3258 | |
| Polyethylene glycol 8000 | SIGMA | P2139 | |
| Sucrose | SIGMA | SO389 | |
| Sodium carbonate anhydrous | SIGMA | 451614-25G | |
| Sodium bicarbonate | SIGMA | S5761 | |
| Sodium azide | SIGMA | S2002-5G | |
| Sulfuric acid, 99.999% | SIGMA | 339741 | |
| 4% Paraformaldehyde | SIGMA | 252549 | |
| Triton-X 100 | SIGMA | X100 | |
| Tween 20 | SIGMA | P1379 | |
| DAPI | SIGMA | D9564 | |
| Albumin (human) | SIGMA | A9731 | |
| Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP9701-100 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | |
| SYBR Select Master Mix | Applied Biosystems | 4472903 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits/Consumables | |||
| Sterile membrane | CN Bio innovations | LC-SC | |
| LiverChip Perfusion cell culture plate | CN Bio innovations | LC12 | |
| LiverChip culture plate lid | CN Bio innovations | LC-SC | |
| Sterile round filter paper | CN Bio innovations | LC-SC | |
| Cell attachment scaffold | CN Bio innovations | LC-SC | |
| Retaining ring | CN Bio innovations | LC-SC | |
| Sterile plunger | CN Bio innovations | LC-ST | |
| Dneasy blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| Human Magnetic Luminex assay | R&D Systems | ||
| 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 4368814 | |
| QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set | Qiagen | 1048147 | Containing RNA carrier |
| Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile | Millipore (Merck) | PFHYS1008 | |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Life technologies | 4309849 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Life technologies | 4311971 | |
| Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 442404 | |
| Sealing Tape for 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane | ThermoFisher Scientific | 295-3345 | |
| Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost | Fisher Scientific | FB58628 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 344058 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells / Cell lines | |||
| Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified | Thermo Fisher Scientific | HMCPTS | |
| Cryopreserved Human Kupffer Cells | Thermo Fisher Scientific | HUKCCS | |
| HepDE19 cell line | Haitao Guo (Indiana University, IN, USA) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers/Probes/Standards | |||
| HBV DNA forward primer | Invitrogen | 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3' | |
| HBV DNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3' | |
| HBV DNA probe | Invitrogen | 5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA | |
| pgRNA forward primer | Invitrogen | 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3' | |
| pgRNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3' | |
| RPS11 forward primer | Invitrogen | 5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3' | |
| RPS11 reverse primer | Invitrogen | 5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3' | |
| pCMV-HBV | Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal) | DAKO | discontinued | Lot 10102505 |
| Human Albumin Antibody, A80-129A | Bethyl Laboratories. inc | A80-129A | |
| Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P | Bethyl Laboratories. inc | A80-229P | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | # A-11072 | Lot 1431810 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| LiverChip Vacuum pump | CN Bio innovations | LC-PN | |
| LiverChip Pneumatic Hookup | CN Bio innovations | LC-PN | |
| LiverChip platform | CN Bio innovations | LC-PN | |
| LiverChip plate washing dock | CN Bio innovations | ||
| Autoclavable metal forceps | VWR | 232-0106 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries | SKU: SI-0236 | |
| Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004500 | |
| SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow | MGE worldwide | SAM12/01010101 | |
| NUAIRE 5800 SERIES incubator | NUAIRE | NU-5841 | |
| Automated precision torgue | CN Bio innovations | ||
| Manual torque | CN Bio innovations | ||
| LiverChip compressor | CN Bio innovations | ||
| Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1 | Luminex | ||
| Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block | ThermoFisher Scientific | Millipore™ 40-285 | |
| FluoStar Optima Plate Reader | BMG Labtech | ||
| KOLVER Precision electric screwdrivers | VTECH ltd | FAB10RE/FR | |
| KOLVER Power supply | VTECH ltd | EDU1FR | |
| BAMBI VTS75D | Air Equipment | Discontinued | |
| Integra Vacuboy | INTEGRA | ||
| ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453536 |
References
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