Summary
Målet med denne protokol er at give en trin for trin guide til at udføre 3-D "leveren-on-a-chip" infektion eksperimenter med hepatitis B-virus.
Abstract
Trods den ekstraordinære smitteevne af hepatitis B virus (HBV) in vivo, hvor kun tre viral genomer kan resultere i en chronicity af eksperimentelt inficerede chimpanser, kræver mest in vitro-modeller flere hundreder til tusinder af viral genomer pr. celle i for at indlede en forbigående infektion. Derudover tillader statisk 2D kulturer af primære humane hepatocytter (PHH) kun kortsigtede undersøgelser på grund af deres hurtige dedifferentiation. Her beskriver vi 3D leveren-on-a-chip kulturer af PHH, enten i monokulturer eller i cocultures med andre nonparenchymal lever-resident celler. Disse tilbyder en betydelig forbedring af at studere langsigtede HBV infektioner med fysiologiske vært celle svar. Ud over at lette stof effekt undersøgelser, toksikologiske analyser og undersøgelser af patogenese, muliggøre disse mikrofluid kultur systemer evaluering af helbredende behandlinger for HBV infektion med henblik på at eliminere kovalent lukket, cirkulær (ccc) DNA. Dette præsenteret metode beskriver opsætning af PHH monokulturer og PHH/Kupffer Co cellekulturer, deres infektion med renset HBV og analyse af vært svar. Denne metode gælder især for vurdering af langtidsvirkningerne af HBV infektion, behandling kombinationer og patogenese.
Introduction
Studiet af HBV er blevet kompliceret af den fattige modtagelighed for kultur systemer, der kræver flere hundreder til tusinder af HBV genom kopier pr. celle at indlede infektion1. Endvidere, primære humane hepatocytter er generelt yderst skrøbelige og dedifferentiate hurtigt under konventionelle kulturer2. Dette skyldes primært, at de flade og hård plast overflader ikke efterligne de naturlige ekstracellulære miljøer fundet inden for leveren og den generelle mangel på iltning af kulturer i mangel af mikrofluid omsætning. Konventionelle statisk hepatocyt kulturer på kollagen-belagte plader hurtigt dedifferentiate og mister deres følsomhed over for HBV infektion3. Her beskriver vi set-up og infektion af PHH vokset i 3D leveren-on-a-chip kulturer, som er meget fordelagtige over konventionel 2D statisk PHH kulturer på kollagen-belagte plader på grund af deres udvidede metaboliske og funktionel kompetence, lette langsigtet kulturer af mindst 40 dage4. I dette system, PHH seedede på kollagen-belagt stilladser, der er konstant perfunderet med vækstmedium til at levere ilt og næringsstoffer til cellerne. Selv om alternativ kultur systemer til PHH baseret på komplekse cocultures af murine fibroblaster eller 3D vækst i spheroids er blevet valideret og er modtagelige for HBV-infektion ved hjælp af multiplicities af infektion af 500 genom ækvivalenter (GE) af HBV pr celle, 3D leveren-on-a-chip kulturer forbliver den eneste in vitro-modelsystem modtagelige til 0,05 GE af HBV pr. celle4. Dette understøttet desuden af nødvendigheden af at bruge høje koncentrationer af dimethylsulfoxid (DMSO) og polyethylenglycol (PEG) for at etablere HBV infektion i disse kulturer, der er overflødige for infektion af 3D leveren-on-a-chip kultur systemer 4. blandt de store kendetegnende for HBV-infektion er cccDNA-pool, der fungerer som den transcriptional skabelon for alle de novo-produceret virioner5,6. Selv om cccDNA kan påvises i konventionelle hepatocyt kulturer7,8, det er fortsat uklart, om regulering af cccDNA og eventuelle terapeutiske tilgange med henblik på dens fjernelse er sammenfattet i delvis eller helt dedifferentiated hepatocytter. Vi har vist, at cccDNA er funktionelt dannet i 3D leveren-on-a-chip kulturer, reagerer på fysiologiske stimuli og kan rettes ved at blande sig med tilgængeligheden af det transkriptionel maskiner til cccDNA genom4.
Værten svar til HBV infektion i 3D leveren-on-a-chip efterligner dem observeret i HBV-inficerede patienter, muliggør identifikation af biomarkører for infektion, samt terapeutiske succes. Blandt de unikke funktioner i leveren-on-a-chip kulturer er evnen til at vurdere langsigtede vært svar mellem PHH og andre nonparenchymal celler i leveren, herunder Kupffer celler4, Stjernehus celler9og leveren sinusformet endotelceller10,11. Dette giver en unik mulighed for at evaluere celle/celle interaktioner i en kompleks 3D mikromiljø.
Derudover letter perioden udvidet kultur af denne platform evaluering af sekventielle lægemiddelsbehandlinger og deres indvirkning på HBV persistens, som ikke er muligt ved hjælp af konventionelle hepatocyt kultur systemer.
Denne protokol beskriver hvordan 3D leveren-on-a-chip kulturer er genereret, enten til monokulturer af PHH eller til cocultures af PHH med Kupffer celler. Derudover beskriver vi produktion af renset HBV for lav mangfoldighed af infektion undersøgelser, samt den efterfølgende analyse af værten og viral svar.
Protocol
1. forsamlingen og ækvilibrering af plader
- Sikre, at både kompressoren og vakuumpumpe tilknyttet LiverChip platform er tændt. Udføre montage og ækvilibrering af pladerne i en klasse II kabinet.
- Aseptisk samle mikrofluid plader ved at placere en steril membran mellem plade base og tilføje den godt indeholdende topplade (figur 1a).
- Sikre at den sterile membran glat hviler på de to stifter af bundpladen, siden ujævn membran placering kompromiser mikrofluid cirkulation.
- Tilføje en sterile plade låg og fastspænd skruerne i bunden af pladen ved hjælp af en automatiseret præcision drejningsmoment til 33 lb ved hjælp af en spiral stramning sekvens. Sikre, at alle skruer er strammet til 35 lb ved hjælp af en manuel drejningsmoment. Under dette trin skal sikre, at skruerne strammes symmetrisk (figur 1a).
- Prewarm hepatocyt seeding medium indeholdende Williams E medium, primære hepatocyt optøning og plating kosttilskud, 5% føtal bovint serum (FBS) og 1 µM dexamethason til 37 ° C før grunding.
- Prime helt samlet pladen ved at anbringe det inden for vask dock og tilføje 400 µL af hepatocyt såning medium til hver brønd reservoir side. Sikre pladen fastgøres i vask docken helt.
- Indlede flow i opadgående retning for 3,5 min. ved 1 µL/s. Den vellykkede funktion af mikrofluid omsætning kan konstateres gennem de røde indikatorer på siden af pladen (figur 1a).
- Når mediet er pumpet til celle vækst side af pladen, at sikre den korrekte montering af flow-kanal, tilføje en yderligere 1,2 mL hepatocyt såning medium.
- Omhyggeligt overføre pladen i dockingstationen indenfor en befugtet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 og indlede flow i opadgående retning med en væskehastighed på 1 µL/s til 16 h (figur 1 c).
- Overføre pladen til vask dock og fjerne bobler i brønden ved forsigtigt pipettering op og ned.
- Tilføje en steril, runde filtrerpapir, efterfulgt af en celle vedhæftet fil stillads og en låseringen til hver brønd ved hjælp af steril pincet. Tryk på ned i hver brønd med en steril stemplet til at låse de fastholde ringe og stilladser på plads (figur 1b).
- Opsug alle medium og tilføje 400 µL forvarmet hepatocyt seeding medium forsigtigt over skafottet og indlede flow i nedadgående retning for 3,5 min. ved 1 µL/s.
- Aspirat alle medium pumpes ud af reservoiret side af pladen. Dette trin er nødvendigt at erstatte det medium, der er indeholdt i flow-kanal.
- Tilføje 1,4 mL af hepatocyt såning medium til hver brønd før han vendte tilbage på pladen til dock for at fuldføre den samlede mængde pr. brønd. Volumen pr. brønd er nu 1,6 mL (1,4 mL i brønden og 0,2 mL i flow-kanal).
2. optøning og såning af hepatocytter for monokulturer
- Prewarm hepatocyt optøning medium og hepatocyt seeding medium til 37 ° C før optøning et hætteglas med PHH efter leverandørens anvisninger. Brug en centrifuge ved stuetemperatur under dette trin til at undgå pludselige temperaturændringer. Udføre optøs og såning af hepatocytter i en klasse II kabinet.
- Resuspend celler i 1 mL af hepatocyt seeding medium og tælle de celler, der benytter trypan blå. Sikre levedygtigheden af cellerne er over 90%.
- Hold celler på is, indtil de er føjet til brøndene.
- Overføre de afbalancerede og færdigsamlet plade at vaske dock og Opsug alle medium fra brøndene.
- Tilføje 600.000 hepatocytter til hver brønd i en 500 µL volumen af hepatocyt seeding medium.
- Indlede flow i nedadgående retning med en væskehastighed på 1 µL/s og bringe den samlede mængde i brønden til 1,6 mL ved at tilføje 900 µL af hepatocyt såning medium.
- Overføre pladen til dockingstationen indenfor en befugtet inkubator ved 37 ° C og med 5% CO2.
- Indlede flow i nedadgående retning med en væskehastighed på 1 µL/s for 8 h, efterfulgt af et flow vending i opadgående retning med en væskehastighed på 1 µL/s for 8 h.
- Overføre pladen til vask dock og Opsug alle medium fra brøndene.
- Tilføj 400 µL af hepatocyt vedligeholdelse medium (Williams E medium suppleret med hepatocyt vedligeholdelse kosttilskud og 100 nM dexamethason) til hver godt og indlede flow i nedadgående retning med en væskehastighed på 1 µL/s for 3,5 min.
- Opsug alle medium fra reservoiret og tilføje 1,4 mL af hepatocyt vedligeholdelse medium (fig. 1 d).
- Udskift mediet med hepatocyt vedligeholdelse medium hver 48 timer. For at sikre alle medium i brønden er erstattet, udføre en vask skridt før tilsætning af friske hepatocyt vedligeholdelse medium.
- Overføre pladen til vask dock for trinnet vask Aspirér alle medium fra brøndene, og tilføje 400 µL af vedligeholdelse medium.
- Indlede flow i nedadgående retning på 1 µL/s for 3,5 min. aspirat alle medium optræder i reservoir side af brøndene.
- Tilføje 1,4 mL hepatocyt vedligeholdelse medium og inden for en befugtet inkubator ved 37 ° C og med 5% CO2, overføre pladen i dockingstationen og indlede flow i opadgående retning med en væskehastighed på 1 µL/s for 48 h (figur 1f).
Bemærk: For hepatocyt monokulturer bruges som kontrol for cocultures, for at sikre kontrollerede forhold, bruges en anden type af vedligeholdelse medium, som er bestemt til brug i cocultures med primære menneskelige Kupffer celler. 48 timer efter udskiftning hepatocyt såning medium med hepatocyt vedligeholdelse medium (dag 3 efter såning), regelmæssig hepatocyt vedligeholdelse medium vil blive erstattet med coculture vedligeholdelse medium II, især i monokulturer af PHH hvor sammenligner hen til cocultures af både PHH og Kupffer celler, som de mellemstore komponenter afviger lidt.
3. optøning og såning af Kupffer celler og hepatocytter for Co kulturer
- For at sikre en nøjagtig sammenligning af resultater, altid sammenligne PHH/Kupffer celler cocultures til PHH monokulturer
- For cocultures af PHH og Kupffer celler, tø ét hætteglas af Kupffer celler i avancerede Dulbeccos modificerede Eagle's medium (AdDMEM) uden dexamethason men suppleret med primære hepatocyt optøning og plating kosttilskud (coculture såning medium) Ifølge leverandørens anvisninger. Udføre optøs og såning af Kupffer celler og hepatocytter i en klasse II kabinet.
- Resuspend celler i 1 mL af coculture såning medium og tælle de celler, der benytter trypan blå. Sikre levedygtigheden af cellerne er over 90%.
- Hold celler på is forud for at føje dem til brønde at undgå celle vedhæftning.
- Følg instruktionerne i trin 2.1-2.3 til optøning af primære humane hepatocytter.
- Overføre de afbalancerede og færdigsamlet plade at vaske dock og Opsug alle medium fra brøndene.
- Tilføje 60.000 Kupffer celler og/eller 600.000 hepatocytter til hver brønd i en samlet maengde paa 250 µL af coculture såning medium.
- Indlede flow i nedadgående retning med en væskehastighed på 1 µL/s og tilføje 900 µL af coculture såning medium til hver brønd.
- Overføre pladen i dockingstationen indenfor en befugtet inkubator ved 37 ° C og med 5% CO2.
- Indlede flow i nedadgående retning med en væskehastighed på 1 µL/s for 8 h, efterfulgt af flow vending i opadgående retning med en væskehastighed på 1 µL/s for 8 h.
- Overføre pladen til vask dock og Opsug alle medium fra brøndene.
- Tilføj 400 µL af coculture vedligeholdelse medium I (AdDMEM uden dexamethason men suppleret med hepatocyt vedligeholdelse kosttilskud) til hver godt og indlede flow i nedadgående retning med en væskehastighed på 1 µL/s for 3,5 min.
- Opsug alle medium fra reservoir side og tilføje 1,4 mL af coculture vedligeholdelse medium I til hver brønd.
- Overføre pladen i dockingstationen indenfor en befugtet inkubator ved 37 ° C og med 5% CO2 og indlede flow i opadgående retning med en væskehastighed på 1 µL/s for 48 h.
- Overføre pladen til vask dock og Opsug alle medium fra brøndene. Tilføj 400 µL af coculture vedligeholdelse medium II (Williams E medium uden dexamethason men suppleret med 100 nM hydrocortison og hepatocyt vedligeholdelse kosttilskud) og indlede flow i nedadgående retning på 1 µL/s for 3,5 min.
- Opsug alle medium optræder i reservoir side af brøndene.
- Tilføje 1,4 mL af coculture vedligeholdelse medium II og overføre pladen i dockingstationen indenfor en befugtet inkubator ved 37 ° C og med 5% CO2.
- Indlede flow i opadgående retning med en væskehastighed på 1 µL/s for 48 h (figur 1e).
- Erstatte medium hver 48 h med coculture vedligeholdelse medium II. For at sikre alle medium i brønden er erstattet, udføre en vask skridt før tilsætning af friske medium.
- At vaske, overføre pladen til vask dock, Aspirér alle medium fra brøndene, og tilføje 400 µL af coculture vedligeholdelse medium II.
- Indlede flow i nedadgående retning på 1 µL/s for 3,5 min. aspirat alle medium optræder i reservoir side af brøndene.
- Tilføje 1,4 mL af coculture vedligeholdelse medium II og overføre pladen i dockingstationen indenfor en befugtet inkubator ved 37 ° C og med 5% CO2, og indlede flow i opadgående retning med en væskehastighed på 1 µL/s for 48 h (figur 1f).
4. produktion af en infektiøs Hepatitis B Virus Infektion undersøgelser
- Udføre denne del af protokollen i et indeslutningsniveau III lab. Gøre såning, medium ændringer, medium indsamling, og virus fusionen i en klasse II kabinet.
- Kultur HBV-producerende celler (f.eks. HepDE19, HepAD38) i kollagen-belagt T1000 5-lags kolber i 120 mL af komplet DMEM/F12 (10% FBS, penicillin/steptomycin, uvæsentlige aminosyrer, 500 μg/mL G418 og 1 μg/mL tetracyclin) indtil de når 90% confluency.
- Ændre medium til induktion medium (komplet DMEM uden tetracyklin) til at fremkalde HBV produktion.
- Indsamle den fuldstændige medium volumen hver 48 h til 12 dage efter tilbagetrækning af tetracyklin og opbevare det ved 4 ° C.
- Filtrere de indsamlede medium gennem et 0,45 µm flaske top filter.
- Tilføje sterile PLØK 8000 i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) til det indsamlede medium til en endelig koncentration på 4% w/w, mix af invertere 8 x-10 x og inkuberes ved 4 ° C for 16 h. Centrifuge på 10.000 x g i 1 time ved 4 ° C til at indsamle den PIND-udfældet virus og resuspend pellet i PBS, som indeholder 10% FBS.
- Kombinere virussen PIND-udfældet fra alle høst tid point og lag det på toppen af en 20% saccharose pude. Der centrifugeres ved 140.000 x g i 16 timer ved 4 ° C ved hjælp af en SW28 rotor.
- Opsug supernatanten og resuspenderes i PBS suppleret med 10% FBS og delprøve og opbevar den ved-80 ° C.
- Bestemme HBV DNA kopi nummer i supernatanten ved HBV DNA qPCR (trin 6).
5. 3D kulturer med HBV infektion
- Udføre infektioner i en klasse II kabinet i en indeslutningsniveau III lab.
- 3 dage efter såning monokulturer eller cocultures, tø det krævede antal HBV-holdige alikvoter ved stuetemperatur og fortyndes den krævede virus dosis i 1,8 mL af hepatocyt vedligeholdelse medium eller coculture vedligeholdelse medium II pr. brønd, henholdsvis.
- Denne 1,8-mL fortyndet virus er tilstrækkelig trinnet vask (400 µL) og udskiftning af medium i godt (1,4 mL). Den nødvendige mangfoldighed af infektion skal dog tilpasses konto for den endelige kultur volumen på 1,6 mL.
- Overføre pladen til vask dock og Opsug alle medium fra brøndene. Tilføj 400 µL af HBV-holdige medium og indlede flow i nedadgående retning på 1 µL/s for 3,5 min. aspirat alle mellemstore optræder i reservoir side af brøndene.
- Tilføje 1,4 mL af HBV-holdige vedligeholdelse medium/coculture vedligeholdelse medium II pr. godt og overføre pladen i dockingstationen indenfor en befugtet inkubator ved 37 ° C og med 5% CO2. Indlede flow i nedadgående retning med en væskehastighed på 1 µL/s for 8 h, efterfulgt af en vending i opadgående retning med en væskehastighed på 1 µL/s.
- 24 timer efter tilsætning af HBV, overføre pladen til vask dock og Opsug alle medium fra brøndene.
- Vask hver godt i pladen 3 x med den tilsvarende medium, afhængigt af typen af kultur som beskrevet i trin 2.12 – 2.14, for at fjerne rester virus fra brønden. I modsætning til trin 2.12 – 2.14, tilføje 1,6 mL medium i hver godt at tage højde for den ekstra volumen skal udtages for at udelukke inokulum fremførsel (figur 1 g).
- Efter disse vask trin, skal du indsamle 200 µL af medium fra hver brønd at bekræfte den fuldstændig fjernelse af HBV inokulum ved kvantificeringen af ekstracellulære HBV DNA.
- Overføre pladen til dockingstationen indenfor en befugtet inkubator ved 37 ° C og med 5% CO2, og indlede flow i opadgående retning med en væskehastighed på 1 µL/s for 48 h.
- 48 timer senere, indsamle komplette godt lydstyrken for downstream analyse, efterfulgt af tre vasker med hepatocyt vedligeholdelse medium som beskrevet i trin 2.12 – 2.14. Udskift mediet og vaske hver godt 3 x hver 48 h indtil eksperimentelle opsigelse.
6. kvantificering af ekstracellulære HBV DNA
- Isolere samlede DNA fra kultur analysere ifølge producentens anvisninger med tilsætning af 1 µg luftfartsselskab RNA i en indeslutningsniveau III lab til at sikre virus er blevet Inaktiveringen i prøver forud for at flytte dem til et andet område.
- Forberede en master mix indeholdende kvantitativ PCR master mix, 600 nM fremad primer, 600 nM omvendt primer, og 300 nM af sonden.
- Tilføje 7 µL af den master mix i hver brønd af et 384-godt plade.
- Tilføj 5 µL DNA-prøver i to eksemplarer, en no-skabelon kontrol og dubletter af seriefremstillede fortyndet HBV genom-holdige plasmid-baserede standard (f.eks. pCMV-HBV) spænder fra 109 kopier pr. reaktion på 102 eksemplarer pr. reaktion på hvert hul i den qPCR plade.
- Placer en selvklæbende dække over pladen og sikre, at hver godt er forseglet korrekt.
- Der centrifugeres plade for 1 min på 300 x g.
- Start qPCR køres i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. Cyklus betingelserne for real-time PCR er 95 ° C i 10 min, efterfulgt af 40 cyklusser af 95 ° C til 15 s og 60 ° C i 1 min.
- Kvantificere antallet af HBV DNA eksemplarer i de ukendte prøver efter standardkurven.
7. kvantificering af intracellulære HBV Pregenomic (pg) RNA
- Isolere total RNA fra stilladser ifølge producentens anvisninger. For at sikre komplet celle lysis, vortex hvert stillads 3 x til 30 s efterfulgt af centrifugering ved 300 x g i 1 min mellem hver vortexing. Udføre celle lysis i indeslutningsniveau III lab til at sikre virus er blevet Inaktiveringen i prøver forud for at flytte dem til et andet område.
- Transskribere cDNA fra den isolerede RNA ifølge producentens anvisninger.
- Cyklus betingelserne for retrotranscription er 25 ° C i 10 min, 37 ° C i 120 min, og 85 ° C i 5 min.
- Holde cDNA prøver ved 4 ° C for kortsigtede eller ved-20 ° C til langtidsopbevaring.
- Forberede master mix for pgRNA og RPS11 indeholdende kvantitativ PCR master mix og forward og reverse primere for pgRNA og RPS11 (brugt som husholdning gen) i en endelig koncentration på 0,2 µM.
- Tilføje 7,5 µL af den master mix og 2,5 µL cDNA pr. brønd på en 384-godt plade. Måling af RPS11 og pgRNA af hver prøve i to eksemplarer og omfatte en no-skabelon kontrol godt for begge gener.
- Placer en selvklæbende dække over pladen og sikre, at hver godt er lukket helt.
- Der centrifugeres plade for 1 min på 300 x g.
- Sæt pladen i qPCR cycler og starte qPCR køres ved hjælp af de standard kvantitativ PCR-protokol efter fabrikantens anvisninger. Cyklus betingelserne for real-time PCR er 50 ° C for 2 min, 95 ° C i 2 min., efterfulgt af 40 cyklusser af 95 ° C til 15 s og 60 ° C i 1 min.
- Beregne et udtryk for pgRNA i forhold til RPS11.
8. immunofluorescens farvning af virusantigen
- Fjern den låseringen fra brønden og fjern skafottet med pincet i en klasse II kabinet i indeslutning niveau III lab.
- Lave de celle, der indeholder stilladser med 4% PARAFORMALDEHYD i 1 mL PBS i 30 min. ved stuetemperatur i indeslutningsniveau III lab. Følgende trin kan udføres i et andet område.
- Vaske stilladser 3 x med 1 mL PBS.
- Permeabilize celler ved hjælp af 0,1% Triton-X 100 i 1 mL PBS i 1 time ved stuetemperatur.
- Vaske stilladser 3 x med 1 mL PBS.
- Blok non-specifik binding ved inkubering af stilladser med 1% BSA i 1 mL PBS i 16 timer ved 4 ° C.
- Vaske stilladser 3 x med 1 mL PBS.
- Udføre primære antistoffarvning bruger kanin anti-hepatitis B virus core antigen ved en fortynding af 1:200 i 1% BSA i 1 mL PBS til 16 h ved 4 ° C.
- Vaske stilladser 1 x med 0,1% Tween i 1 mL PBS (PBS-Tween) og 3 x med 1 mL PBS.
- Udføre sekundære antistoffarvning ved hjælp af ged anti-kanin IgG (H + L) Kors-adsorberet Alexa Fluor 594-konjugeret sekundær antistof på en fortynding af 1:2,000 i 1% BSA i 1 mL PBS i 16 timer ved 4 ° C.
- Vaske stilladser 1 x med 1 mL 0,1% PBS-Tween og 3 x med 1 mL PBS.
- Counterstain stilladser bruger DAPI i 1 mL PBS i en koncentration på 2 µg/mL i 10 min ved stuetemperatur.
- Vaske stilladser 1 x med 1 mL 0,1% PBS-Tween og 3 x med 1 mL PBS.
- Overføre stilladser til et objektglas og montere den for billeddannelse.
- Image stilladser ved hjælp af et fluorescens mikroskop.
9. humant Albumin ELISA
- Udføre denne sektion af protokollen i en klasse II kabinet afsat i indeslutningsniveau III lab hvis arbejder med smitsomme materiale.
- For at evaluere levedygtighed og metaboliske funktioner af PHH, evaluere humant albumin produktion ved ELISA.
- Frakke 96-brønd plader med 50 µL pr. brønd af gede-anti-humant antistof fortyndet 1:800 i coatingbuffer (100 mM bikarbonat/karbonat, pH 9,6). Dække pladerne og inkuberes i 2 timer ved 37 ° C eller natten over ved 4 ° C.
- Opsug belægning antistof fra pladen og vaske det 4 x med 200 µL af 0,05% PBS-Tween.
- Tilføje 200 µL blokerende buffer (1% BSA i PBS), dækker pladerne, og Inkuber i 1 time ved 37 ° C eller gemme dem ved 4 ° C i 3 måneder. Til langtidsopbevaring, tilføje 0,05% natriumazid til de blokerende buffer.
- Opsug den blokerende buffer og vaske 1 x med 200 µL af 0,05% PBS-Tween.
- Tilsæt 50 µL af tidligere fortyndede prøver pr. brønd (1: 100). Prøven fortyndingsmiddel indeholder 1% BSA i 0,05% PBS-Tween. Inkuber i 1 time ved 37 ° C eller natten over ved 4 ° C.
Bemærk: Inkuber standarderne på samme tid som prøverne. Et koncentrationsområde på 500 – 0.488 ng/mL (1:2 serielle fortyndinger) anbefales. Udføre alle serielle fortyndinger af humant albumin i stikprøven fortyndingsmiddel. - Opsug prøver fra pladen og vaske det 4 x med 200 µL af 0,05% PBS-Tween.
- Tilsæt 50 µL af HRP-konjugeret gede-anti-humant albumin antistof tidligere fortyndet 1:10,000 i prøven fortyndingsmiddel. Der inkuberes i 2 timer ved 37 ° C eller natten over ved 4 ° C.
- Opsug antistof fra pladen og vaske det 6 x med 200 µL af 0,05% PBS-Tween.
- Tilsæt 100 µL af TMB reagens og, så snart de højeste standarder er fuldt udviklede, tilføje 100 µL 1 M H2så4 for at stoppe den colorimetrisk reaktion.
- Læse absorbans ved 450 nm på en 96-brønd Pladelæser til analyse.
10. Interleukin (IL) 6 og Tumor nekrose faktorer (TNF) α produktion i 3D Co kulturer
- Udføre denne sektion af protokollen i en klasse II kabinet afsat i indeslutningsniveau III lab hvis arbejder med smitsomme materiale.
- Kvantificere IL6 og TNFα produktionen for at vurdere funktionaliteten og levedygtighed af de primære Kupffer celler. For at få produktionen af disse cytokiner af Kupffer celler, behandle cocultures med 1 µg/mL LPS (LPS) 9 d efter såning i coculture vedligeholdelse medium II for 48 h.
- På dag 11 efter såning, høst medium fra hver brønd og opbevar den ved-80 ° C.
- Måle IL6 og TNFα koncentrationen i dyrkningsmediet ved en passende analyse og i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger.
Representative Results
Vi beskriver en simpel og alsidig platform til langtidskulturer primære menneskelige Kupffer celler og/eller hepatocytter og deres infektion med HBV. Primære menneskeceller udsås på kollagen-belagt polystyren stilladser inden for en mikrofluid plade samling, som løbende perfuses celler med vækstmediet (figur 1a).
PHH, som normalt kun er stabil i en begrænset periode i konventionelle kultur systemer, kan funktionelt opretholdes i længere perioder. Humant albumin, som udskilles af funktionelle hepatocytter og betragtes som den bedste markør for evalueringen af hepatisk metabolisme, er stabilt og højt udtrykt ved 3D kulturer indtil dag 40 efter såning (figur 2). For cocultures, kan Kupffer celle funktionalitet og levedygtighed vurderes af udskillelsen af specifikke cytokiner (fx IL6 og TNFα). For at måle cytokin produktion, anbefales brug af capture-baseret detektion midler på LPS-stimulation af cocultures (figur 3).
Celler danner hepatisk microtissues, normalt senest 3 dage efter såning af PHH, demonstrere funktionelle galde canaliculi og komplet celle polarisering (figur 2). Ud over at bevare deres fysiologiske cellulære metabolisme, blive disse kulturer usædvanligt modtagelige for HBV infektion. HBV DNA og andre virale markører, i modsætning til andre systemer, kultur, bliver let påviselige fra dag 2 efter infektionen (figur 4). Ud over udskilles markører af viral infektion, hepatocyt-holdige stilladser kan hentes fra kulturer og bruges til immunofluorescens påvisning af virusantigen (f.eks. HBsAg, HBcAg) (figur 4). Hvor konventionelle hepatocyt kulturer kræver podning med mindst 500 HBV GE pr. celle og tilsætning af 2% DMSO og 4% PIND, så lidt som 0.05 HBV GE er købedygtig indlede infektion i 3D-kulturer uden kravet i DMSO eller PIND (figur 4).
Figur 1: Opsætning af 3D-leveren-on-a-chip kulturer. (en) Dette er en skematisk layout til samling af kultur plade for at sikre oprettelsen af mikrofluid omsætning. (b) dette panel viser et nærbillede af kultur brønde, herunder filtrerpapir, stillads og låseringen. (c) dette panel viser processen med plade ækvilibrering før såning kulturer. De næste to paneler viser processen med såning for (d) hepatocyt monokulturer og (e) hepatocyt/Kupffer celle cocultures. (f) dette panel viser vask trin involveret i medium ændringer. (g) dette panel viser HBV infektion set-up, herunder fjernelse af inokulum. S.M. = seeding medium, M.M. = vedligeholdelse medium. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: hepatisk microtissue dannelse og hepatocyt levedygtighed. (en) dette panel viser langsgående brightfield billeder af 3D hepatocyt monokulturer demonstrerer microtissue dannelse efter såning. (b) dette panel viser immunofluorescens billeddannelse af kulturer for kerner (blå) og humant albumin (grøn). (c) dette panel viser langsgående samlede albumin, samt pr. celle justeret albumin produktion, under 40 dage for hepatocyt monokulturer, som bestemmes af ELISA. De viste data er gennemsnit ± SD. Dette tal er tilpasset fra Ortega-Prieto et al.4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kupffer celle funktionalitet i 3D-cocultures. Disse paneler viser sekretion af (en) IL6 og (b) TNFα i hepatocyt monokulturer og hepatocyt/Kupffer celler cocultures 11 dage efter såning i svar til eksogent tilføjet LP'ER på dag 9 post såning, som bestemmes ved hjælp af menneskelige magnetisk Luminex assay. Dette tal er tilpasset fra Ortega-Prieto et al.4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: HBV infektion i leveren-on-a-chip kulturer. (en) dette panel viser immunofluorescens mikroskopi påvisning af HBcAg (rød), HBsAg (grøn) og kerner (blå) 10 dage efter infektion i kulturer med HBV. (b) dette panel viser modtagelighed kulturer for HBV-infektion ved hjælp af forskellige multiplicities af infektion, som bestemmes af en kvantificering af HBV DNA i kultur analysere. (c) dette panel viser en kvantificering af de langsgående ophobning af HBV pgRNA i forhold til husholdning gen RPS11. De viste data er gennemsnit ± SD. Dette tal er tilpasset fra Ortega-Prieto et al.4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Udfordringer i at opretholde langsigtet kulturer af PHH har drevet udviklingen af flere kultur modeller med øget funktionalitet og levetid, hver udstiller differential fordele og ulemper. Det er nu almindeligt anerkendt, at statiske 2D kulturer af PHH efterligne visse aspekter af hepatocyt biologi for meget begrænsede mængder af tid. Således micropatterned cocultures12,13, klumpformet kulturer14,15, og 3D leveren-on-a-chip kulturer16,17 erstatter hurtigt disse mere grundlæggende systemer. Især når man studerer smitsomme sygdomme, som har coevolved med deres vært at udnytte specifikke microenvironments, er kravet om at give fysiologiske miljøer baseret på de ofte udfordrende karakter af dyrkning menneske-tropic smitsomme sygdomme, herunder hepatitis C virus, HBV og malaria.
Den mest kritiske trin i udførelsen af 3D leveren-on-a-chip kulturer er kvaliteten af de først indkøbte primære celletyper. Disse celler bør testes for deres overholdelse af kapacitet og kun plateable PHH masser bør anvendes for at sikre vellykket væv dannelse og kultur generation. Selvom frisk isolerede PHH kan bruges, deres kryopræservering er normalt kompliceret og kræver særlige sats-kontrollerede frysere.
I modsætning til konventionelle statisk 2D kulturer, vært genetiske baggrund er ubetydelig med hensyn til modtagelighed for HBV infektion, og alle dermed langt testede hepatocyt donorer er stand til at etablere HBV infektion4.
Selvom patienten-afledte HBV etablerer infektioner af 3D kulturer, er det nødvendigt at udnytte PIND-fældet og saccharose pude-renset HBV når som helst bruge inducerbar HBV producent celle linjer for generation af viral inocula. Celle kultur analysere direkte anvendes på 3D leveren-on-a-chip kulturer, enten gennem tilstedeværelsen af hæmmende faktorer eller på grund af inkompatibilitet nuværende vækstfaktorer med hepatocytter, medfører ikke let infektion. Desuden, når du vælger patient-afledte virale inocula, bør kun serum anvendes, da plasma uundgåeligt koagulerer og træsko mikrofluid omsætning af kultur-platformen.
Uanset den virale inokulum bruges, er sikre cellulære levedygtighed og differentiering, samt at sikre fuldstændig fjernelse af den oprindelige HBV inokulum, nøglen til vellykket langsigtet infektion undersøgelser. Den mest bekvemme måde at gøre dette er prøveudtagning kulturer efter fjernelse af den virale inokulum, samt måling af human serum albumin niveauer i hele perioden kultur. Bemærk, på samme måde for alle andre beskrevet platforme, HBV infektion, når etableret, spredes ikke let til ikke-inficerede celler. Den underliggende mekanisme for dette er fortsat undvigende, da HBV infektion in vivo let inficerer størstedelen af hepatocytter inden for leveren.
Med hensyn til cocultures af PHH og Kupffer celler er det tilrådeligt at udføre masse tests af Kupffer celler til at evaluere IL6 og TNFα sekretion i response på LPS stimulation, da ikke alle kommercielt tilgængelige Kupffer celledonorer har en lige lydhørhed.
Vigtigere, for alle medicinske behandlingsmetoder eller oprindelige infektion af kulturer med HBV, skal det samlede volumen af brønden (1,4 mL), samt for fra mikrofluid kanal (0,2 mL), tages i betragtning ved beregningen af narkotika eller inokulum koncentrationer. For at sikre korrekt dosering, er en vask skridt med medium indeholdende HBV eller narkotika udført for at prime mikrofluid kanalen.
Den anvendte platform udnytter 600.000 PHH pr. brønd, som sikrer flerlaget hepatocytter inden for stilladser. Selv om celle nummer kan varieres, sikrer den valgte celle koncentration optimale resultater. Formatet plade holder ialt 12 stilladser, som kan opgraderes til 36 stilladser. Men på grund af mikrofluid krav, skalere op til højere godt numre er ikke muligt at dato.
Brug af disse tilgange, kan kulturer opretholdes med optimal celle ydeevne i mindst 40 dage, som hidtil, giver hidtil usete muligheder for at evaluere nye lægemiddelkandidater, samt undersøge de komplekse samspil mellem forskellige hepatiske celle befolkninger under HBV infektion.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af en igangsætter tilskud fra Det Europæiske Forskningsråd (637304), en Wellcome Trust Investigator Award (104771/Z/14/Z), og af KN-Bio innovationer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| William's E Medium, no phenol red | GIBCO | A12176-01 | |
| Hepatocyte Thaw Medium | GIBCO | CM7500 | |
| Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements | GIBCO | CM3000 | |
| Primary Hepatocyte Maintenance Supplements | GIBCO | CM4000 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Advanced DMEM | GIBCO | 12491023 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-144 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | GIBCO | 11140050 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | GIBCO | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture | SIGMA | 12106C | |
| Hydrocortisone | SIGMA | H0888 | |
| Trypan blue | Merck | T8154 | |
| Collagen from calf skin | Merck | C9791 | |
| G418 | SIGMA | G418-RO | |
| Tetracycline | SIGMA | T3258 | |
| Polyethylene glycol 8000 | SIGMA | P2139 | |
| Sucrose | SIGMA | SO389 | |
| Sodium carbonate anhydrous | SIGMA | 451614-25G | |
| Sodium bicarbonate | SIGMA | S5761 | |
| Sodium azide | SIGMA | S2002-5G | |
| Sulfuric acid, 99.999% | SIGMA | 339741 | |
| 4% Paraformaldehyde | SIGMA | 252549 | |
| Triton-X 100 | SIGMA | X100 | |
| Tween 20 | SIGMA | P1379 | |
| DAPI | SIGMA | D9564 | |
| Albumin (human) | SIGMA | A9731 | |
| Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP9701-100 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
| TaqMan Universal Master Mix II, no UNG | Applied Biosystems | 4440040 | |
| SYBR Select Master Mix | Applied Biosystems | 4472903 | |
| Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 | InvivoGen | tlrl-eklps | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kits/Consumables | |||
| Sterile membrane | CN Bio innovations | LC-SC | |
| LiverChip Perfusion cell culture plate | CN Bio innovations | LC12 | |
| LiverChip culture plate lid | CN Bio innovations | LC-SC | |
| Sterile round filter paper | CN Bio innovations | LC-SC | |
| Cell attachment scaffold | CN Bio innovations | LC-SC | |
| Retaining ring | CN Bio innovations | LC-SC | |
| Sterile plunger | CN Bio innovations | LC-ST | |
| Dneasy blood & tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Rneasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| Human Magnetic Luminex assay | R&D Systems | ||
| 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution | ThermoFisher Scientific | 34028 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher Scientific | 4368814 | |
| QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set | Qiagen | 1048147 | Containing RNA carrier |
| Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile | Millipore (Merck) | PFHYS1008 | |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Life technologies | 4309849 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Life technologies | 4311971 | |
| Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 442404 | |
| Sealing Tape for 96-Well Plates | ThermoFisher Scientific | 15036 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane | ThermoFisher Scientific | 295-3345 | |
| Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost | Fisher Scientific | FB58628 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 344058 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary cells / Cell lines | |||
| Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified | Thermo Fisher Scientific | HMCPTS | |
| Cryopreserved Human Kupffer Cells | Thermo Fisher Scientific | HUKCCS | |
| HepDE19 cell line | Haitao Guo (Indiana University, IN, USA) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers/Probes/Standards | |||
| HBV DNA forward primer | Invitrogen | 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3' | |
| HBV DNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3' | |
| HBV DNA probe | Invitrogen | 5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA | |
| pgRNA forward primer | Invitrogen | 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3' | |
| pgRNA reverse primer | Invitrogen | 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3' | |
| RPS11 forward primer | Invitrogen | 5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3' | |
| RPS11 reverse primer | Invitrogen | 5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3' | |
| pCMV-HBV | Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal) | DAKO | discontinued | Lot 10102505 |
| Human Albumin Antibody, A80-129A | Bethyl Laboratories. inc | A80-129A | |
| Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P | Bethyl Laboratories. inc | A80-229P | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | # A-11072 | Lot 1431810 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| LiverChip Vacuum pump | CN Bio innovations | LC-PN | |
| LiverChip Pneumatic Hookup | CN Bio innovations | LC-PN | |
| LiverChip platform | CN Bio innovations | LC-PN | |
| LiverChip plate washing dock | CN Bio innovations | ||
| Autoclavable metal forceps | VWR | 232-0106 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific industries | SKU: SI-0236 | |
| Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95765 | |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004500 | |
| SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow | MGE worldwide | SAM12/01010101 | |
| NUAIRE 5800 SERIES incubator | NUAIRE | NU-5841 | |
| Automated precision torgue | CN Bio innovations | ||
| Manual torque | CN Bio innovations | ||
| LiverChip compressor | CN Bio innovations | ||
| Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1 | Luminex | ||
| Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block | ThermoFisher Scientific | Millipore™ 40-285 | |
| FluoStar Optima Plate Reader | BMG Labtech | ||
| KOLVER Precision electric screwdrivers | VTECH ltd | FAB10RE/FR | |
| KOLVER Power supply | VTECH ltd | EDU1FR | |
| BAMBI VTS75D | Air Equipment | Discontinued | |
| Integra Vacuboy | INTEGRA | ||
| ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block | ThermoFisher Scientific | 4453536 |
References
- Verrier, E. R., Colpitts, C. C., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. F. Cell Culture Models for the Investigation of Hepatitis B and D Virus Infection. Viruses. 8 (9), (2016).
- Elaut, G., et al. Molecular mechanisms underlying the dedifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures. Current Drug Metabolism. 7 (6), 629-660 (2006).
- Konig, A., et al. Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes. Journal of Hepatology. 61 (4), 867-875 (2014).
- Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682 (2018).
- Allweiss, L., Dandri, M. The Role of cccDNA in HBV Maintenance. Viruses. 9 (6), (2017).
- Guo, J. T., Guo, H. Metabolism and function of hepatitis B virus cccDNA: Implications for the development of cccDNA-targeting antiviral therapeutics. Antiviral Research. 122, 91-100 (2015).
- Lucifora, J., et al. Direct antiviral properties of TLR ligands against HBV replication in immune-competent hepatocytes. Scientific Reports. 8 (1), 5390 (2018).
- Hosel, M., et al. Hepatitis B Virus Activates Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Supporting Hepatocyte Survival and Virus Replication. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (3), 339-363 (2017).
- Mazza, G., et al. Rapid production of human liver scaffolds for functional tissue engineering by high shear stress oscillation-decellularization. Scientific Reports. 7 (1), 5534 (2017).
- Hang, T. C., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G., Stolz, D. B. Lipids promote survival, proliferation, and maintenance of differentiation of rat liver sinusoidal endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (3), G375-G388 (2012).
- Hwa, A. J., et al. Rat liver sinusoidal endothelial cells survive without exogenous VEGF in 3D perfused co-cultures with hepatocytes. The FASEB Journal. 21 (10), 2564-2579 (2007).
- Khetani, S. R., Bhatia, S. N. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).
- March, S., et al. Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens. Nature Protocols. 10 (12), 2027-2053 (2015).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
- Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
- Griffith, L. G., Wells, A., Stolz, D. B. Engineering liver. Hepatology. 60 (4), 1426-1434 (2014).
- Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).
