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Immunology and Infection

"जिगर पर एक चिप" हेपेटाइटिस बी वायरस के संक्रमण के लिए प्राथमिक हेपैटोसाइट्स और Kupffer कोशिकाओं की संस्कृतियों

Published: February 19, 2019 doi: 10.3791/58333
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Section of Virology, Department of Medicine, Imperial College

Summary

इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए एक कदम दर कदम गाइड करने के लिए 3 डी "जिगर पर एक चिप" हेपेटाइटिस बी वायरस के साथ संक्रमण प्रयोगों प्रदर्शन प्रदान करना है ।

Abstract

vivo में हेपेटाइटिस बी वायरस (एचबीवी) के असाधारण infectivity के बावजूद, जहां केवल तीन वायरल जीनोम प्रयोगात्मक संक्रमित चिंपांजी की एक जीर्णता में परिणाम कर सकते हैं, इन विट्रो मॉडल में सेल प्रति वायरल जीनोम के हजारों के लिए कई सैकड़ों की आवश्यकता एक क्षणिक संक्रमण शुरू करने के लिए आदेश । इसके अतिरिक्त, प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स (PHH) के स्थैतिक 2d संस्कृतियों केवल अल्पकालिक उनके तेजी से भेदभाव के कारण पढ़ाई की अनुमति देते हैं । यहां, हम PHH के 3 डी जिगर पर एक चिप संस्कृतियों का वर्णन, या तो monocultures में या अंय nonparenchymal जिगर के साथ cocultures में निवासी कोशिकाओं । ये शारीरिक मेजबान सेल प्रतिक्रियाओं के साथ दीर्घकालिक एचबीवी संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण सुधार प्रदान करते हैं । दवा प्रभावकारिता अध्ययन, विषाक्तता विश्लेषण, और रोगजनन में जांच को सुविधाजनक बनाने के अलावा, इन microfluidic कल्चर सिस्टम covalently बंद करने के उद्देश्य से एचबीवी संक्रमण के लिए उपचारात्मक उपचारों के मूल्यांकन को सक्षम, परिपत्र (सीसीसी) डीएनए । यह प्रस्तुत विधि PHH monocultures और PHH/Kupffer सेल सह संस्कृतियों, शुद्ध एचबीवी के साथ उनके संक्रमण, और मेजबान प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के सेट अप का वर्णन करता है । इस विधि एचबीवी संक्रमण, उपचार संयोजन, और रोगजनन के दीर्घकालिक प्रभावों के मूल्यांकन के लिए विशेष रूप से लागू है ।

Introduction

एचबीवी के अध्ययन के संस्कृति प्रणालियों के गरीब संवेदनशीलता से जटिल किया गया है, सेल प्रति एचबीवी जीनोम प्रतियां के हजारों के लिए कई सैकड़ों की आवश्यकता के लिए1संक्रमण शुरू करते हैं । इसके अलावा, प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स आम तौर पर असाधारण नाजुक है और तेजी से पारंपरिक संस्कृतियों2के दौरान अंतर । यह मुख्य रूप से इस तथ्य के कारण है कि फ्लैट और हार्ड प्लास्टिक सतहों प्राकृतिक extracellular जिगर के भीतर पाया वातावरण की नकल नहीं है और microfluidic संचलन के अभाव में संस्कृतियों के ऑक्सीजन की सामांय कमी है । कोलेजन पर पारंपरिक स्थैतिक hepatocyte संस्कृतियों-लेपित प्लेटें तेजी से अंतर और एचबीवी3संक्रमण के लिए अपनी संवेदनशीलता खो देते हैं । यहां, हम का वर्णन सेट अप और 3 डी जिगर में हो PHH के संक्रमण पर एक चिप संस्कृतियों, जो काफी लाभप्रद है पर पारंपरिक 2d स्थैतिक PHH संस्कृतियों पर कोलेजन-लेपित उनके विस्तारित चयापचय और कार्यात्मक क्षमता के कारण प्लेटें, सुविधा की लंबी अवधि के संस्कृतियों में कम से ४० दिन4। इस प्रणाली में, PHH कोलेजन पर वरीयता प्राप्त कर रहे है लेपित पाड़, जो लगातार विकास के माध्यम से perfused है कोशिकाओं को ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति । हालांकि murine fibroblasts या spheroids में 3d वृद्धि के जटिल cocultures के आधार पर PHH के लिए वैकल्पिक संस्कृति प्रणालियों को मांय किया गया है और एचबीवी के ५०० जीनोम समकक्षों (जीई) के संक्रमण की बहुलता का उपयोग कर संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील है एचबीवी के प्रति सेल, 3d जिगर पर एक चिप संस्कृतियों इन विट्रो मॉडल प्रणाली4सेल प्रति एचबीवी के ०.०५ जीई के लिए अतिसंवेदनशील में एकमात्र रहते हैं । यह इसके अतिरिक्त dimethyl sulfoxide (DMSO) और पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) के उच्च सांद्रता का उपयोग कर इन संस्कृतियों में एचबीवी संक्रमण स्थापित करने की आवश्यकता से टिकी है, जो 3 डी जिगर के संक्रमण के लिए औषधालय है पर एक चिप संस्कृति प्रणाली 4. एचबीवी संक्रमण के प्रमुख बानगी के अलावा cccDNA पूल, जो सभी de नोवो के लिए transcriptional टेम्पलेट के रूप में कार्य करता है-5virions उत्पादित,6. हालांकि cccDNA पारंपरिक hepatocyte संस्कृतियों में पता लगाया जा सकता है7,8, यह के रूप में स्पष्ट नहीं रहता है कि क्या cccDNA के विनियमन और किसी भी चिकित्सीय इसके उन्मूलन के उद्देश्य से दृष्टिकोण आंशिक रूप में recapitulated रहे है या पूरी तरह से विभेदित हेपैटोसाइट्स । हमें पता चला है कि cccDNA कार्यात्मक 3 डी जिगर में गठित है पर एक चिप संस्कृतियों, शारीरिक उत्तेजनाओं का जवाब है, और cccDNA जीनोम4transcriptional मशीनरी की पहुंच के साथ हस्तक्षेप द्वारा लक्षित किया जा सकता है ।

3 डी जिगर में एचबीवी संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रियाएं-पर-एक चिप एचबीवी संक्रमित रोगियों में मनाया उन नकल, संक्रमण के लिए, साथ ही चिकित्सकीय सफलता के लिए उपमार्कों की पहचान को सक्षम करने । जिगर पर एक चिप संस्कृतियों की अनूठी विशेषताओं के अलावा PHH और जिगर के भीतर अन्य nonparenchymal कोशिकाओं के बीच दीर्घकालिक मेजबान प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने की क्षमता है, सहित Kupffer कोशिकाओं4, तारामय कोशिकाओं9, और जिगर sinusoidal endothelial कक्ष10,11। यह एक जटिल 3d microenvironment में सेल/सेल इंटरैक्शन का मूल्यांकन करने का अनूठा अवसर प्रदान करता है ।

इसके अतिरिक्त, इस मंच के विस्तारित संस्कृति अवधि अनुक्रमिक दवा उपचार और एचबीवी हठ है, जो पारंपरिक hepatocyte संस्कृति प्रणालियों का उपयोग संभव नहीं है पर उनके प्रभाव के मूल्यांकन की सुविधा ।

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे 3 डी जिगर पर एक चिप संस्कृतियों उत्पंन कर रहे हैं, या तो PHH के monocultures के लिए या Kupffer कोशिकाओं के साथ PHH के cocultures के लिए । इसके अलावा, हम कम की बहुलता के लिए शुद्ध एचबीवी के उत्पादन का वर्णन-संक्रमण अध्ययन, साथ ही साथ मेजबान और वायरल प्रतिक्रियाओं के बाद के विश्लेषण ।

Protocol

1. विधानसभा और प्लेटों की Equilibration

  1. सुनिश्चित करें कि दोनों कंप्रेसर और LiverChip मंच के साथ जुड़े वैक्यूम पंप चालू कर रहे हैं. विधानसभा और एक वर्ग द्वितीय मंत्रिमंडल में प्लेटों के equilibration प्रदर्शन करते हैं ।
  2. Aseptically प्लेट बेस के बीच एक बाँझ झिल्ली रखकर और अच्छी तरह से युक्त शीर्ष प्लेट (चित्रा 1a) को जोड़ने के द्वारा microfluidic प्लेटों को इकट्ठा ।
  3. यह सुनिश्चित करें कि बाँझ झिल्ली आसानी से आधार प्लेट के दो पिन पर टिकी हुई है, के बाद से असमान झिल्ली स्थान microfluidic संचलन समझौता ।
  4. एक बाँझ प्लेट ढक्कन जोड़ें और प्लेट के आधार पर एक स्वचालित परिशुद्धता टोक़ का उपयोग कर ३३ पौंड एक सर्पिल कस अनुक्रम का उपयोग कर शिकंजा कस । सुनिश्चित करें कि सभी शिकंजा ३५ पौंड एक मैनुअल टोक़ का उपयोग करने के लिए मजबूत कर रहे हैं । इस कदम के दौरान, शिकंजा सममित (आंकड़ा 1a) कस रहे हैं सुनिश्चित करते हैं ।
  5. गर्म hepatocyte सीडिंग मध्यम से युक्त विलियंस ई मध्यम, प्राथमिक hepatocyte गल, और चढ़ाना की खुराक, 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और 1 µ एम डेक्समेतएसॉनी से पहले ३७ ° c भड़काना ।
  6. प्रधानमन्त्री ने इसे वाशिंग गोदी के भीतर रखकर पूरी तरह से इकट्ठी की हुई थाली को जोड़ने और प्रत्येक कुआं के जलाशय की ओर hepatocyte सीडिंग माध्यम के ४०० µ एल को जोड़ना । सुनिश्चित करें कि प्लेट वॉशिंग डॉक में पूरी तरह से तस्वीरें ।
  7. 1 µ एल पर ३.५ मिनट के लिए ऊपर की दिशा में आरंभ प्रवाह/ microfluidic संचलन के सफल समारोह (आंकड़ा 1a) प्लेट के पक्ष में लाल संकेतक के माध्यम से पता लगाया जा सकता है ।
  8. एक बार मध्यम प्लेट के सेल विकास की ओर पंप है, प्रवाह चैनल की सही विधानसभा सुनिश्चित करने, hepatocyte सीडिंग मध्यम के एक अतिरिक्त १.२ मिलीलीटर जोड़ें ।
  9. ध्यान से ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन के भीतर डॉकिंग स्टेशन में प्लेट हस्तांतरण और 5% सह2 और ऊपर की दिशा में आरंभ प्रवाह 1 µ एल के एक प्रवाह दर पर 16 ज (चित्रा 1c) के लिए ।
  10. धोने गोदी करने के लिए प्लेट हस्तांतरण और धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से बुलबुले को खत्म ।
  11. एक बाँझ, दौर फिल्टर कागज, एक सेल लगाव पाड़ और एक बनाए रखने की अंगूठी के बाद, एक अच्छी तरह से बाँझ संदंश का उपयोग करने के लिए जोड़ें । एक बाँझ गोताख़ोर जगह में बनाए रखने के छल्ले और पाड़ ताला (आंकड़ा 1b) के साथ एक अच्छी तरह से नीचे दबाएँ ।
  12. महाप्राण सभी माध्यम और ४०० µ एल जोड़ने से गरम hepatocyte मध्यम धीरे पाड़ पर और ३.५ मिनट के लिए नीचे की दिशा में प्रवाह आरंभ 1 µ l/
  13. महाप्राण सभी मध्यम प्लेट के जलाशय की ओर से बाहर पंप । इस चरण में प्रवाह चैनल में निहित माध्यम को प्रतिस्थापित करने के लिए आवश्यक है ।
  14. प्रति अच्छी तरह से कुल मात्रा को पूरा करने के लिए गोदी करने के लिए प्लेट लौटने से पहले एक अच्छी तरह से hepatocyte सीडिंग मध्यम के १.४ मिलीलीटर जोड़ें । प्रति कुआं मात्रा अब १.६ मिलीलीटर (१.४ मिलीलीटर में अच्छी तरह से और ०.२ मिलीलीटर प्रवाह चैनल में) है ।

2. Monocultures के लिए हेपैटोसाइट्स का गल और सीडिंग

  1. पहले से गरम hepatocyte गल मध्यम और hepatocyte सीडिंग मध्यम से ३७ ° c को ' आपूर्तिकर्ताओं के निर्देशों के अनुसार PHH की एक शीशी गल जाने से पूर्व । अचानक तापमान में परिवर्तन से बचने के लिए इस कदम के दौरान कमरे के तापमान पर एक केंद्रापसारक का प्रयोग करें । एक वर्ग द्वितीय कैबिनेट में हेपैटोसाइट्स के गल और सीडिंग का प्रदर्शन करें ।
  2. hepatocyte सीडिंग मध्यम के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और trypan नीले रंग का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना । सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं की व्यवहार्यता ९०% से ऊपर है ।
  3. कोशिकाओं को बर्फ पर रखें जब तक वे कुओं को जोड़ रहे हैं ।
  4. equilibrated और पूरी तरह से इकट्ठे प्लेट धोने गोदी करने के लिए स्थानांतरण और कुओं से सभी मध्यम महाप्राण ।
  5. जोड़ें ६००,००० हेपैटोसाइट्स प्रत्येक अच्छी तरह से एक ५०० µ एल मात्रा में hepatocyte सीडिंग मध्यम ।
  6. 1 µ एल के एक प्रवाह दर पर नीचे की दिशा में प्रवाह आरंभ करें और hepatocyte सीडिंग माध्यम के ९०० µ l को जोड़कर अच्छी तरह से १.६ मिलीलीटर में कुल मात्रा लाएं ।
  7. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन के भीतर और 5% सह2के साथ डॉकिंग स्टेशन के लिए प्लेट स्थानांतरण ।
  8. 1 µ एल के एक प्रवाह दर पर नीचे की दिशा में शुरू प्रवाह 8 एच के लिए/एस, 1 µ एल की एक प्रवाह दर पर ऊपर की दिशा में एक प्रवाह उत्क्रमण के बाद 8 ज के लिए/
  9. प्लेट को वॉशिंग डॉक में ट्रांसफर करें और सभी मीडियम को कुएं से महाप्राण ।
  10. जोड़ें ४०० µ hepatocyte रखरखाव मध्यम (विलियंस ई hepatocyte रखरखाव की खुराक और १०० एनएम डेक्समेतएसॉनी के साथ पूरक) एक अच्छी तरह से और नीचे की दिशा में 1 µ एल की एक प्रवाह दर पर प्रवाह शुरू करने के लिए ३.५ मिनट के लिए l/
  11. जलाशय से सभी मध्यम महाप्राण और hepatocyte रखरखाव मध्यम (चित्रा 1 डी) की १.४ मिलीलीटर जोड़ें ।
  12. मीडियम को hepatocyte मेंटेनेंस मीडियम से बदलें हर ४८ एच. अच्छी तरह से सभी माध्यम में सुनिश्चित करने के लिए जगह है, ताजा hepatocyte रखरखाव माध्यम के अलावा पहले एक धुलाई कदम प्रदर्शन ।
  13. वाशिंग स्टेप के लिए प्लेट को वाशिंग डॉक पर ट्रांसफर करें, कुओं से सभी मीडियम महाप्राण, और मेंटेनेंस मीडियम के ४०० µ एल जोड़ें ।
  14. 1 µ एल पर नीचे की दिशा में शुरू प्रवाह ३.५ मिनट के लिए/महाप्राण सभी माध्यम कुओं के जलाशय ओर दिखने ।
  15. hepatocyte रखरखाव के माध्यम से १.४ मिलीलीटर जोड़ें और, ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन के भीतर और 5% सह2के साथ, डॉकिंग स्टेशन में प्लेट हस्तांतरण और 1 µ एल की एक प्रवाह दर पर ऊपर की दिशा में प्रवाह आरंभ करने के लिए ४८ एच (चित्रा 1f) ।
    नोट: cocultures के लिए नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल hepatocyte monocultures के लिए, नियंत्रित शर्तों को सुनिश्चित करने के लिए, रखरखाव माध्यम का एक दूसरा प्रकार प्रयोग किया जाता है, जो प्राथमिक मानव Kupffer कोशिकाओं के साथ cocultures में उपयोग के लिए विशिष्ट है. ४८ ज hepatocyte अनुरक्षण माध्यम के साथ hepatocyte सीडिंग माध्यम की जगह (3 दिन के बाद सीडिंग), नियमित hepatocyte रखरखाव माध्यम coculture रखरखाव माध्यम द्वितीय के साथ प्रतिस्थापित किया जाएगा, विशेष रूप से monocultures के PHH में जब तुलना करने के लिए PHH और Kupffer दोनों कक्षों का cocultures, क्योंकि मध्यम घटक थोड़ा अलग होते हैं ।

3. Kupffer कोशिकाओं का गल जाना और सीडिंग करना और सह संस्कृतियों के लिए हेपैटोसाइट्स

  1. आदेश में परिणामों की एक सटीक तुलना सुनिश्चित करने के लिए, हमेशा PHH/Kupffer सेल cocultures की तुलना PHH monocultures
  2. PHH और Kupffer कोशिकाओं के cocultures के लिए, Dulbecco के बिना उन्नत AdDMEM के संशोधित ईगल के माध्यम (डेक्समेतएसॉनी) में Kupffer कोशिकाओं की एक शीशी गल लेकिन प्राथमिक hepatocyte गल और चढ़ाना की खुराक (coculture सीडिंग माध्यम) के अनुसार पूरक आपूर्तिकर्ताओं के निर्देशों के लिए । एक वर्ग द्वितीय कैबिनेट में Kupffer कोशिकाओं और हेपैटोसाइट्स के गल और सीडिंग का प्रदर्शन करें ।
  3. coculture सीडिंग मध्यम के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और trypan नीले रंग का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना । सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं की व्यवहार्यता ९०% से ऊपर है ।
  4. कोशिकाओं को बर्फ पर रखने के लिए उंहें कुओं को जोड़ने से पहले सेल आसंजन से बचने के लिए ।
  5. प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स के गल के लिए चरणों 2.1 – 2.3 में दिए गए निर्देशों का पालन करें ।
  6. equilibrated और पूरी तरह से इकट्ठे प्लेट धोने गोदी करने के लिए स्थानांतरण और कुओं से सभी मध्यम महाप्राण ।
  7. जोड़ें ६०,००० Kupffer कोशिकाओं और/या ६००,००० हेपैटोसाइट्स प्रत्येक अच्छी तरह से २५० µ एल के एक कुल मात्रा में coculture सीडिंग माध्यम के प्रत्येक ।
  8. 1 µ एल की एक प्रवाह दर पर नीचे की दिशा में प्रवाह आरंभ करें और एक अच्छी तरह से coculture सीडिंग माध्यम के ९०० µ एल जोड़ें ।
  9. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन के भीतर डॉकिंग स्टेशन में प्लेट हस्तांतरण और 5% सह2के साथ ।
  10. 8 एच के लिए 1 µ एल के प्रवाह की दर से नीचे की दिशा में शुरू प्रवाह, 1 µ एल की एक प्रवाह दर पर ऊपर की ओर की ओर प्रवाह उत्क्रमण के बाद/
  11. प्लेट को वॉशिंग डॉक में ट्रांसफर करें और सभी मीडियम को कुएं से महाप्राण ।
  12. जोड़ें ४०० µ coculture रखरखाव मध्यम मैं (डेक्समेतएसॉनी के बिना AdDMEM लेकिन hepatocyte रखरखाव की खुराक के साथ पूरक) के लिए एक अच्छी तरह से और नीचे की दिशा में शुरू प्रवाह 1 µ एल के एक प्रवाह दर पर ३.५ मिनट के लिए/
  13. जलाशय की ओर से सभी मध्यम महाप्राण और एक अच्छी तरह से coculture रखरखाव माध्यम मैं के १.४ मिलीलीटर जोड़ें ।
  14. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन के भीतर डॉकिंग स्टेशन में प्लेट स्थानांतरण और 5% सह2 के साथ और ऊपर की दिशा में आरंभ प्रवाह 1 µ एल के एक प्रवाह दर पर ४८ एच के लिए/
  15. प्लेट को वॉशिंग डॉक में ट्रांसफर करें और सभी मीडियम को कुएं से महाप्राण । जोड़ें ४०० µ coculture रखरखाव मध्यम द्वितीय के एल (डेक्समेतएसॉनी के बिना विलियंस ई मध्यम लेकिन १०० एनएम hydrocortisone और hepatocyte रखरखाव की खुराक के साथ पूरक) और नीचे की दिशा में प्रवाह आरंभ 1 µ एल पर ३.५ मिनट के लिए/
  16. महाप्राण सभी मध्यम कुओं के जलाशय की ओर दिखाई दे रहा है ।
  17. coculture रखरखाव मध्यम द्वितीय के १.४ मिलीलीटर जोड़ें और डॉकिंग स्टेशन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन के भीतर और 5% सह2के साथ प्लेट हस्तांतरण ।
  18. ४८ ज (चित्रा 1e) के लिए 1 µ एल की एक प्रवाह दर पर ऊपर की दिशा में प्रवाह आरंभ.
  19. coculture रखरखाव माध्यम द्वितीय के साथ मध्यम हर ४८ एच बदलें । अच्छी तरह से सभी माध्यम में सुनिश्चित करने के लिए जगह है, ताजा माध्यम के अलावा पहले एक धुलाई कदम प्रदर्शन ।
  20. धोने के लिए, प्लेट धोने गोदी करने के लिए स्थानांतरण, कुओं से सभी मध्यम महाप्राण, और coculture रखरखाव मध्यम द्वितीय के ४०० µ एल जोड़ें ।
  21. 1 µ एल पर नीचे की दिशा में शुरू प्रवाह ३.५ मिनट के लिए/महाप्राण सभी माध्यम कुओं के जलाशय ओर दिखने ।
  22. coculture रखरखाव मध्यम द्वितीय के १.४ मिलीलीटर जोड़ें और डॉकिंग स्टेशन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन के भीतर और 5% CO2के साथ प्लेट हस्तांतरण, और ऊपर की दिशा में आरंभ प्रवाह 1 µ एल के प्रवाह की दर पर ४८ एच (चित्रा 1f) के लिए/।

4. संक्रमण अध्ययन के लिए एक संक्रामक हेपेटाइटिस बी वायरस का उत्पादन

  1. प्रोटोकॉल के इस खंड में एक रोकथाम स्तर III प्रयोगशाला करते हैं । एक वर्ग द्वितीय कैबिनेट में सीडिंग, मध्यम परिवर्तन, मध्यम संग्रह, और वायरस एकाग्रता करते हैं ।
  2. कल्चर एचबीवी-उत्पादक कक्ष (उदा., HepDE19, HepAD38) में कोलेजन-लेपित T1000 5-परत की कुप्पी में १२० मिलीलीटर की पूरी DMEM/F12 (10% FBS, पेनिसिलिन/steptomycin, गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, ५०० μg/एमएल G418, और 1 μg/एमएल टेट्रासाइक्लिन) तक वे पहुंच ९०% तक प्रवाह ।
  3. माध्यम प्रेरण मध्यम (टेट्रासाइक्लिन के बिना पूरा DMEM) एचबीवी उत्पादन प्रेरित करने के लिए बदल जाते हैं ।
  4. 12 दिनों के बाद टेट्रासाइक्लिन की वापसी के लिए पूरा मध्यम मात्रा हर ४८ ज लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान ।
  5. एक ०.४५ µm बोतल शीर्ष फिल्टर के माध्यम से एकत्र माध्यम फिल्टर ।
  6. 4% डब्ल्यू के एक अंतिम एकाग्रता के लिए एकत्र मध्यम करने के लिए फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) में बाँझ खूंटी ८००० जोड़ें/4 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए १०,००० एक्स जी पर 16 घंटे के लिए 8 डिग्री सेल्सियस से कम-10x, और 2 ° c पर मशीन पलटना द्वारा मिक्स खूंटी-उपजी वायरस को इकट्ठा करने और resuspend 10% FBS युक्त पंजाब में गोली ।
  7. सभी कटाई के समय अंक और यह एक 20% सुक्रोज तकिया के शीर्ष पर परत से खूंटी-उपजी वायरस का मिश्रण । १४०,००० पर 16 ज के लिए एक्स जी में 4 ° c एक SW28 रोटर का उपयोग कर ।
  8. महाप्राण supernatant और 10% FBS के साथ पूरक पंजाब में गोली resuspend, और aliquot और-८० डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान.
  9. एचबीवी डीएनए qPCR (step 6) के द्वारा supernatant में मौजूद एचबीवी डीएनए कापी संख्या निर्धारित करें ।

5. एचबीवी के साथ 3 डी संस्कृतियों का संक्रमण

  1. एक वर्ग द्वितीय मंत्रिमंडल में संक्रमण एक रोकथाम स्तर III प्रयोगशाला के भीतर प्रदर्शन ।
  2. 3 दिन monocultures या cocultures बोने के बाद, एचबीवी-युक्त aliquots के कमरे के तापमान पर आवश्यक संख्या गल और hepatocyte रखरखाव मध्यम या coculture रखरखाव मध्यम द्वितीय के १.८ मिलीलीटर में आवश्यक वायरस खुराक को पतला प्रति अच्छी तरह से, क्रमशः ।
  3. यह १.८-एमएल पतला वायरस वाशिंग स्टेप (४०० µ l) और मीडियम के रिप्लेसमेंट वेल (१.४ ml) के लिए पर्याप्त है । हालांकि, संक्रमण की आवश्यकता बहुलता १.६ मिलीलीटर की अंतिम संस्कृति की मात्रा के लिए खाते में समायोजित करने की जरूरत है ।
  4. प्लेट को वॉशिंग डॉक में ट्रांसफर करें और सभी मीडियम को कुएं से महाप्राण । जोड़ें ४०० µ एल के एचबीवी-मध्यम और नीचे की दिशा में आरंभ प्रवाह 1 µ एल पर ३.५ min. महाप्राण के लिए कुओं के जलाशय की ओर दिखने सभी मध्यम ।
  5. एचबीवी-युक्त रखरखाव मध्यम/coculture रखरखाव मध्यम द्वितीय के १.४ मिलीलीटर जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन के भीतर डॉकिंग स्टेशन में प्लेट हस्तांतरण और 5% सह2के साथ । 1 µ एल के एक प्रवाह दर पर नीचे की दिशा में शुरू प्रवाह 8 एच के लिए/एस, ऊपर की दिशा में एक उत्क्रमण के बाद एक प्रवाह की दर पर 1 µ एल/
  6. 24 ज एचबीवी के जोड़ के बाद, प्लेट को वॉशिंग डॉक में ट्रांसफर करें और सभी मीडियम को कुएं से महाप्राण ।
  7. एक अच्छी तरह से धो प्लेट 3x में इसी माध्यम के साथ, के रूप में कदम में उल्लिखित संस्कृति के प्रकार के अनुसार 2.12-2.14, अच्छी तरह से बचे हुए वायरस को खत्म करने के लिए । कदम 2.12-2.14 के विपरीत, हर अच्छी तरह से में मध्यम की १.६ मिलीलीटर जोड़ने के लिए अतिरिक्त मात्रा के लिए खाते में इनोक्युलम carryover (चित्रा 1g) को बाहर करने के लिए नमूना है ।
  8. इन धुलाई चरणों के बाद, एक अच्छी तरह से extracellular एचबीवी डीएनए के ठहराव द्वारा एचबीवी इनोक्युलम के पूर्ण हटाने की पुष्टि करने के लिए माध्यम से २०० µ एल इकट्ठा ।
  9. ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified मशीन के भीतर डॉकिंग स्टेशन के लिए प्लेट हस्तांतरण और 5% CO2के साथ, और ऊपर की दिशा में आरंभ प्रवाह 1 µ एल के एक प्रवाह दर पर ४८ एच के लिए/
  10. ४८ ज बाद में, बहाव विश्लेषण के लिए पूरी तरह से मात्रा इकट्ठा, hepatocyte रखरखाव माध्यम के साथ तीन बहाकर द्वारा पीछा के रूप में 2.12-2.14 चरणों में उल्लिखित । मध्यम बदलें और एक अच्छी तरह से धो 3x हर ४८ प्रयोगात्मक समाप्ति तक एच ।

6. Extracellular एचबीवी डीएनए की ठहराव

  1. supernatants से कुल डीएनए को अलग निर्माता के निर्देश के अनुसार वाहक आरएनए के 1 µ जी के अलावा एक रोकथाम स्तर III प्रयोगशाला में नमूने में वायरस निष्क्रियता सुनिश्चित करने के लिए उन्हें एक अलग क्षेत्र में ले जाने से पहले.
  2. मात्रात्मक पीसीआर मास्टर मिक्स, ६०० एनएम आगे प्राइमर, ६०० एनएम रिवर्स प्राइमर, और जांच के ३०० एनएम युक्त मास्टर मिश्रण तैयार करें ।
  3. एक ३८४-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में मास्टर मिश्रण के 7 µ एल जोड़ें ।
  4. डुप्लिकेट में डीएनए नमूनों की 5 µ एल जोड़ें, एक नहीं, नियंत्रण टेम्पलेट, और प्रश्नपत्र पतला एचबीवी जीनोम के डुप्लिकेट-युक्त प्लाज्मिड-आधारित मानक (जैसे, pCMV-एचबीवी) 10 प्रति प्रतिक्रिया 10 से प्रत्येक की अच्छी तरह के लिए प्रतिक्रिया प्रति2 प्रतियां से लेकर qPCR प्लेट.
  5. प्लेट पर एक चिपकने वाला आवरण रखें और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अच्छी तरह से बंद है ।
  6. ३०० x जीपर 1 मिनट के लिए थाली केंद्रापसारक
  7. निर्माता के निर्देशों के अनुसार qPCR रन प्रारंभ करें । वास्तविक समय पीसीआर के लिए चक्र शर्तों 10 मिनट के लिए ९५ ° c, 15 एस के लिए ९५ ° c के ४० चक्र के बाद और ६० ° c 1 मिनट के लिए कर रहे हैं ।
  8. मानक वक्र के अनुसार अज्ञात नमूनों के भीतर एचबीवी डीएनए प्रतियां की संख्या मात्रा बढ़ाता है ।

7. ठहराव ऑफ Intracellular एचबीवी Pregenomic (pg) आरएनए

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पाड़ों से कुल आरएनए को अलग करें । आदेश में पूरा सेल lysis, भंवर 30 के लिए प्रत्येक पाड़ 3x को सुनिश्चित करने के लिए ३०० x जी पर केंद्रापसारक द्वारा पीछा प्रत्येक भंवर के बीच 1 मिनट के लिए । नमूने में वायरस निष्क्रियता सुनिश्चित करने के लिए उंहें किसी भिंन क्षेत्र में ले जाने से पहले कक्ष lysis स्तर III प्रयोगशाला में कार्य करें ।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार पृथक आरएनए से सीडीएनए टाइप करना.
  3. retrotranscription के लिए चक्र की स्थिति 10 मिनट के लिए 25 ° c, १२० मिनट के लिए ३७ ° c, और 5 मिनट के लिए ८५ ° c हैं ।
  4. सीडीएनए नमूनों को दीर्घकालिक भंडारण के लिए अल्पकालिक या कम-20 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
  5. pgRNA और pgRNA और RPS11 के लिए (गृह व्यवस्था जीन के रूप में इस्तेमाल) ०.२ µ एम के एक अंतिम एकाग्रता में मात्रात्मक पीसीआर मास्टर मिक्स और आगे और रिवर्स प्राइमरों युक्त के लिए मास्टर घोला जा सकता है तैयार ।
  6. एक ३८४ अच्छी तरह से प्लेट पर सीडीएनए के मास्टर मिश्रण और २.५ µ एल के ७.५ µ एल जोड़ें । RPS11 और डुप्लिकेट में प्रत्येक नमूने के pgRNA उपाय और दोनों जीन के लिए एक नहीं टेम्पलेट नियंत्रण अच्छी तरह से शामिल हैं ।
  7. थाली पर एक चिपकने वाला आवरण रखें और यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अच्छी तरह से बंद है ।
  8. ३०० x जीपर 1 मिनट के लिए थाली केंद्रापसारक
  9. qPCR साइकिल चालक में प्लेट डालें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार मानक मात्रात्मक पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग कर qPCR भागो शुरू करते हैं । वास्तविक समय पीसीआर के लिए चक्र की स्थिति 2 मिनट के लिए ५० ° c, 2 min के लिए ९५ ° c, 15 एस के लिए ९५ ° c के ४० चक्र के बाद और 1 मिनट के लिए ६० ° c हैं ।
  10. RPS11 के सापेक्ष pgRNA की अभिव्यक्ति की गणना करें.

8. वायरल प्रतिजन का इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग

  1. अच्छी तरह से बनाए रखने की अंगूठी निकालें और रोकथाम स्तर III प्रयोगशाला में एक वर्ग द्वितीय कैबिनेट में संदंश के साथ पाड़ को हटा दें ।
  2. सेल से युक्त मचानों को 4% paraformaldehyde के साथ तय करें 30 मिनट के लिए पंजाब के 1 मिलीलीटर में कमरे के तापमान में रोकथाम स्तर III प्रयोगशाला । निंन चरणों का पालन किसी भिंन क्षेत्र में किया जा सकता है ।
  3. पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ 3x पाड़ धो लो ।
  4. Permeabilize कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए पंजाब के 1 मिलीलीटर में ०.१% ट्राइटन-X १०० का उपयोग कर कोशिकाओं को ।
  5. पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ 3x पाड़ धो लो ।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए पंजाब के 1 मिलीलीटर में 1% BSA के साथ मचान की मशीन द्वारा गैर विशिष्ट बंधन ब्लॉक ।
  7. पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ 3x पाड़ धो लो ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए पंजाब के 1 मिलीलीटर में 1% BSA में 1:200 के एक कमजोर पड़ने पर खरगोश विरोधी हेपेटाइटिस बी वायरस कोर प्रतिजन का उपयोग प्राथमिक एंटीबॉडी दाग प्रदर्शन ।
  9. पंजाब के 1 मिलीलीटर (पंजाब के बीच) और पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ 3x में ०.१% के बीच के साथ मचान धो लो ।
  10. प्रदर्शन माध्यमिक एंटीबॉडी बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी का उपयोग दाग (एच + एल) पार-adsorbed Alexa Fluor ५९४-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी 1 के कमजोर पड़ने पर: 2000 में 1% BSA में 16 ज के लिए पंजाबियों के 1 मिलीलीटर में 4 डिग्री सेल्सियस ।
  11. ०.१% पंजाबियों के बीच 1 मिलीलीटर और पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ 3x के साथ मचान 1x धो लो ।
  12. Counterstain के कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2 µ जी/एमएल की एकाग्रता पर पंजाब के 1 मिलीलीटर में DAPI का उपयोग कर पाड़ों ।
  13. ०.१% पंजाबियों के बीच 1 मिलीलीटर और पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ 3x के साथ मचान 1x धो लो ।
  14. मचान एक खुर्दबीन स्लाइड करने के लिए स्थानांतरण और यह इमेजिंग के लिए माउंट ।
  15. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर पाड़ों छवि ।

9. मानव एल्ब्युमिन एलिसा

  1. यदि संक्रामक सामग्री के साथ काम कर रहे है एक वर्ग द्वितीय में आबंटित की कैबिनेट में प्रोटोकॉल के इस अनुभाग प्रदर्शन स्तर III प्रयोगशाला ।
  2. PHH की व्यवहार्यता और चयापचय कार्यशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, एलिसा द्वारा मानव एल्ब्युमिन उत्पादन का मूल्यांकन ।
  3. कोट ९६-अच्छी तरह से बकरी विरोधी के प्रति अच्छी तरह से ५० µ एल के साथ प्लेट मानव एंटीबॉडी कोटिंग बफर में 1:800 पतला (१०० mM बिकारबोनिट/ प्लेटों को कवर और 2 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में गर्मी ।
  4. महाप्राण प्लेट से कोटिंग एंटीबॉडी और ०.०५% पंजाबियों के बीच २०० µ एल के साथ इसे धो 4x ।
  5. बफर अवरुद्ध के २०० µ एल जोड़ें (पंजाब में 1% BSA), प्लेटों को कवर, और उन्हें ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन या 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें स्टोर. लंबी अवधि के संग्रहण के लिए, ०.०५% सोडियम azide को ब्लॉकिंग बफ़र में जोड़ें ।
  6. महाप्राण अवरुद्ध बफर और ०.०५% पंजाबियों के बीच २०० µ एल के साथ धो 1x ।
  7. (1:100) अच्छी तरह से प्रति पहले पतला नमूनों की ५० µ एल जोड़ें । नमूना मंदक 1% BSA में ०.०५% पंजाबियों के बीच शामिल हैं । 4 डिग्री सेल्सियस पर ३७ डिग्री सेल्सियस या रात में 1 घंटे के लिए मशीन ।
    नोट: नमूनों के रूप में एक ही समय में मानकों की मशीन । 500 की एकाग्रता सीमा-0.488 एनजी/एमएल (1:2 धारावाहिक कमजोर पड़ने) की सिफारिश की है । मानव एल्ब्युमिन के सभी धारावाहिक कमजोर पड़ने का नमूना मंदक में प्रदर्शन ।
  8. महाप्राण प्लेट से नमूने और ०.०५% पंजाबियों के बीच २०० µ एल के साथ इसे धो लें 4x ।
  9. Add ५० µ l के एचआरपी-संयुग्मित बकरी विरोधी मानव एल्ब्युमिन एंटीबॉडी पहले पतला 1:10000 मे नमूना मंदक. 4 डिग्री सेल्सियस पर ३७ डिग्री सेल्सियस या रात में 2 घंटे के लिए मशीन ।
  10. महाप्राण प्लेट से एंटीबॉडी को धोकर उसे ०.०५% पंजाबियों के २०० µ एल के साथ 6x ।
  11. जोड़ें १०० µ TMB रिएजेंट के एल और, जैसे ही उच्चतम मानकों को पूरी तरह से विकसित कर रहे हैं, जोड़ें १०० µ एल 1 एम एच2तो4 वर्णमिति प्रतिक्रिया को रोकने के लिए.
  12. एक ९६-विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से प्लेट रीडर पर ४५० एनएम पर अवशोषक पढ़ें ।

10. Interleukin (IL) 6 और ट्यूमर परिगलन कारकों (TNF) 3d सह संस्कृतियों में α उत्पादन

  1. यदि संक्रामक सामग्री के साथ काम कर रहे है एक वर्ग द्वितीय में आबंटित की कैबिनेट में प्रोटोकॉल के इस अनुभाग प्रदर्शन स्तर III प्रयोगशाला ।
  2. प्राथमिक Kupffer कक्षों की कार्यक्षमता और व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के लिए IL6 और TNFα उत्पादन को बढ़ाता है । Kupffer कोशिकाओं द्वारा इन साइटोकिंस के उत्पादन को प्रेरित करने के लिए, lipopolysaccharide रखरखाव माध्यम द्वितीय में ४८ एच के लिए 1 µ g/mL एलपीएस (coculture) 9 d पद सीडिंग के साथ cocultures का उपचार करें ।
  3. दिन में 11 के बाद बोने, एक अच्छी तरह से मध्यम फसल और यह-८० डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
  4. संस्कृति माध्यम में IL6 और TNFα एकाग्रता को एक उचित परख करके और निर्माता के निर्देशों के अनुसार उपाय करें ।

Representative Results

हम प्राथमिक मानव Kupffer कोशिकाओं और/या हेपैटोसाइट्स और एचबीवी के साथ उनके संक्रमण के दीर्घकालिक संस्कृति के लिए एक सरल और बहुमुखी मंच का वर्णन । प्राथमिक मानव कोशिकाओं को एक microfluidic प्लेट विधानसभा के भीतर कोलेजन लेपित polystyrene पाड़ों पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, जो लगातार वृद्धि मध्यम (आंकड़ा 1a) के साथ कोशिकाओं को perfuses ।

PHH, जो आमतौर पर पारंपरिक संस्कृति प्रणालियों में समय की एक सीमित राशि के लिए ही स्थिर रहे हैं, कार्यात्मक समय की विस्तारित अवधि के लिए बनाए रखा जा सकता है । मानव एल्ब्युमिन, जो कार्यात्मक हेपैटोसाइट्स द्वारा स्रावित है और यकृत चयापचय के मूल्यांकन के लिए सबसे अच्छा मार्कर माना जाता है, छुरा है और अत्यधिक 3 डी संस्कृतियों द्वारा दिन ४० पोस्ट-सीडिंग (चित्रा 2) तक व्यक्त की है । cocultures के लिए, Kupffer कोशिका कार्यक्षमता और व्यवहार्यता विशिष्ट साइटोकिंस के स्राव द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है (जैसे, IL6 और TNFα). cytokine उत्पादन को मापने के लिए, कब्जा आधारित का उपयोग का पता लगाने का मतलब एलपीएस पर cocultures की उत्तेजना (चित्रा 3) की सिफारिश की है.

कोशिकाओं यकृत microtissues फार्म, आमतौर पर PHH के बोने के 3 दिनों के भीतर, कार्यात्मक पित्त canaliculi और पूरा सेल ध्रुवीकरण (चित्रा 2) का प्रदर्शन । उनके शारीरिक सेलुलर चयापचय को बनाए रखने के अलावा, इन संस्कृतियों असाधारण एचबीवी संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील हो जाते हैं । एचबीवी डीएनए और अंय वायरल मार्करों, अंय संस्कृति प्रणालियों के विपरीत में, आसानी से दिन 2 पद संक्रमण (चित्रा 4) से detectable हो जाते हैं । वायरल संक्रमण के गुप्त मार्कर के अलावा, hepatocyte युक्त मचान संस्कृतियों से प्राप्त किया जा सकता है और वायरल एंटीजन (जैसे, HBsAg, HBcAg) (चित्रा 4) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया । जहां पारंपरिक hepatocyte संस्कृतियों के साथ टीका की आवश्यकता सेल प्रति कम से ५०० एचबीवी जीई और 2% DMSO और 4% के अलावा खूंटी, के रूप में कुछ के रूप में ०.०५ एचबीवी जीई के लिए 3 में संक्रमण शुरू कर रहे है डी संस्कृतियों की आवश्यकता के बिना DMSO या खूंटी (4 चित्रा) ।

Figure 1
चित्रा 1:3 के सेट-डी जिगर पर एक चिप संस्कृतियों । (क) इस संस्कृति की थाली के विधानसभा के लिए एक योजनाबद्ध लेआउट है ताकि microfluidic संचलन की स्थापना सुनिश्चित करने के लिए । (ख) यह पैनल कल्चरल वेल्स का क्लोज-अप दृश्य दिखाता है, जिसमें फिल्टर पेपर, पाड़ा और बनाए रखने की अंगूठी शामिल है । (ग) यह पैनल संस्कृतियों को बोने से पहले प्लेट equilibration की प्रक्रिया को दिखाता है. अगले दो पैनलों के लिए सीडिंग की प्रक्रिया को दिखाने के लिए (d) hepatocyte monocultures और (e) hepatocyte/Kupffer सेल cocultures । (च) यह पैनल मध्यम परिवर्तन में शामिल वाशिंग स्टेप्स को दिखाता है । (छ) यह पैनल एचबीवी संक्रमण सेट-अप दिखाता है, जिसमें इनोक्युलम को हटाना शामिल है । S.M. = सीडिंग माध्यम, M.M. = रखरखाव माध्यम. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र २: यकृत microtissue गठन आणि hepatocyte व्यवहार्यता. (क) इस पैनल से पता चलता है अनुदैर्ध्य brightfield 3d hepatocyte monocultures प्रदर्शन microtissue गठन के बाद बोने की छवियों । (ख) यह पैनल नाभिक (नीला) और मानव एल्ब्युमिन (हरा) के लिए संस्कृतियों की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग दिखाता है. (ग) इस पैनल अनुदैर्ध्य कुल एल्ब्युमिन, साथ ही सेल समायोजित एल्ब्युमिन उत्पादन के अनुसार, hepatocyte monocultures के ४० दिनों के दौरान, एलिसा द्वारा निर्धारित दिखाता है । डेटा दिखाया ± एसडी मतलब है । यह आंकड़ा ओर्टेगा-Prieto एट अल.4से अनुकूलित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3:3-डी cocultures में Kupffer कक्ष कार्यक्षमता । इन पैनलों के स्राव को दिखाते हैं (क) IL6 और (ख) TNFα में hepatocyte monocultures और hepatocyte/Kupffer सेल cocultures 11 दिनों के बाद के जवाब में सीडिंग exogenously जोड़ा एलपीएस दिन में 9 पद सीडिंग, के रूप में मानव चुंबकीय का उपयोग निर्धारित Luminex परख । यह आंकड़ा ओर्टेगा-Prieto एट अल.4से अनुकूलित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: जिगर में एचबीवी संक्रमण-एक चिप संस्कृतियों पर । (क) इस पैनल से पता चलता है इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का पता लगाने के HBcAg (लाल), HBsAg (हरा), और नाभिक (नीला) 10 दिन एचबीवी के साथ संस्कृतियों के संक्रमण के बाद. (ख) यह पैनल संस्कृतियों की संवेदनशीलता से पता चलता है कि संक्रमण की विभिन्न बहुलताओं का उपयोग करते हुए संक्रमण को एचबीवी है, जैसा कि संस्कृति supernatants में एचबीवी डीएनए के एक ठहराव द्वारा निर्धारित किया गया है. (ग) यह पैनल गृह व्यवस्था जीन RPS11 के सापेक्ष एचबीवी pgRNA के अनुदैर्ध्य संचय के ठहराव को दर्शाता है. डेटा दिखाया ± एसडी मतलब है । यह आंकड़ा ओर्टेगा-Prieto एट अल.4से अनुकूलित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

PHH की दीर्घकालिक संस्कृतियों को बनाए रखने में चुनौतियों में वृद्धि की कार्यक्षमता और दीर्घायु, प्रत्येक प्रदर्शन अंतर लाभ और नुकसान के साथ कई संस्कृति मॉडल के विकास के लिए प्रेरित किया है । अब यह व्यापक रूप से स्वीकार किया है कि PHH के स्थिर 2 डी संस्कृतियों समय की बहुत सीमित मात्रा के लिए hepatocyte जीव विज्ञान के कुछ पहलुओं नकल उतार रहे हैं । इस प्रकार, micropatterned cocultures12,13, अंडाकार आकृति संस्कृतियों14,15, और 3 डी जिगर पर एक चिप संस्कृतियों16,17 तेजी से इन अधिक बुनियादी प्रणालियों की जगह ले रहे हैं । विशेष रूप से विशिष्ट microenvironments का उपयोग करने के लिए अपने मेजबान के साथ coevolved है जो संक्रामक रोगों का अध्ययन, जब, शारीरिक वातावरण प्रदान करने के लिए आवश्यकता संवर्धन मानव-रेखा के अक्सर चुनौतीपूर्ण प्रकृति द्वारा टिकी है हेपेटाइटिस सी वायरस, एचबीवी, और मलेरिया सहित संक्रामक रोगों ।

3 डी जिगर पर एक चिप संस्कृतियों प्रदर्शन में सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रारंभिक स्रोत प्राथमिक सेल प्रकार की गुणवत्ता है । इन कोशिकाओं को उनके पालन क्षमता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए और केवल प्लेटी PHH बहुत सफल ऊतक गठन और संस्कृति पीढ़ी को सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हालांकि हौसले से अलग PHH इस्तेमाल किया जा सकता है, उनके cryopreservation आमतौर पर जटिल है और विशेष दर नियंत्रित फ्रीजर की आवश्यकता है ।

पारंपरिक स्थैतिक 2d संस्कृतियों के विपरीत, मेजबान आनुवंशिक पृष्ठभूमि एचबीवी संक्रमण के लिए संवेदनशीलता के संबंध में नगण्य है, और सभी इस प्रकार अब तक परीक्षण hepatocyte दाताओं एचबीवी संक्रमण4स्थापित करने में सक्षम हैं ।

हालांकि रोगी-व्युत्पंन एचबीवी 3 डी संस्कृतियों के संक्रमण स्थापित करता है, वायरल एचबीवी की पीढ़ी के लिए inducible inocula निर्माता सेल लाइनों का उपयोग करते हुए यह खूंटी-उपजी और सुक्रोज तकिया-शुद्ध एचबीवी का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । सेल संस्कृति supernatants सीधे 3 डी जिगर पर लागू-एक चिप संस्कृतियों, या तो निरोधात्मक कारकों की उपस्थिति या हेपैटोसाइट्स के साथ वर्तमान विकास कारकों की एक असंगति के कारण के माध्यम से, संक्रमण में आसानी से परिणाम नहीं है । इसके अतिरिक्त, जब रोगी-व्युत्पंन वायरल inocula का चयन, केवल सीरम इस्तेमाल किया जाना चाहिए, के बाद से प्लाज्मा अनिवार्य रूप से coagulates और संस्कृति मंच के microfluidic संचलन को रोकना ।

वायरल इनोक्युलम के बावजूद इस्तेमाल किया, सेलुलर व्यवहार्यता और भेदभाव, के रूप में अच्छी तरह से प्रारंभिक एचबीवी इनोक्युलम के पूर्ण हटाने को सुनिश्चित करने के लिए आश्वस्त, सफल दीर्घकालिक संक्रमण अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है । सबसे सुविधाजनक तरीका यह करने के लिए है नमूने वायरल इनोक्युलम को हटाने के बाद संस्कृतियों, साथ ही संस्कृति की अवधि में मानव सीरम एल्ब्युमिन स्तर को मापने । नोट की, इसी तरह सभी अंय वर्णित प्लेटफार्मों के लिए, एचबीवी संक्रमण, एक बार स्थापित, संक्रमित कोशिकाओं को आसानी से नहीं फैलता है । इस के लिए अंतर्निहित तंत्र vivo में एचबीवी संक्रमण के बाद से मायावी रहता है जिगर के भीतर हेपैटोसाइट्स के बहुमत को आसानी से संक्रमित ।

PHH और Kupffer कोशिकाओं के cocultures के संबंध में, यह IL6 उत्तेजना के जवाब में TNFα और एलपीएस स्राव का मूल्यांकन करने के लिए Kupffer कोशिकाओं के बहुत परीक्षण करने के लिए सलाह दी जाती है, के बाद से नहीं सभी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Kupffer सेल दाताओं एक समान जवाबदेही है.

महत्वपूर्ण बात, सभी दवा उपचार या एचबीवी के साथ संस्कृतियों के प्रारंभिक संक्रमण के लिए, अच्छी तरह से (१.४ मिलीलीटर), साथ ही microfluidic चैनल (०.२ मिलीलीटर) की कुल मात्रा, दवा या इनोक्युलम सांद्रता की गणना के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए । आदेश में सही खुराक आश्वासन देने के लिए, एचबीवी या ड्रग्स युक्त माध्यम के साथ एक धुलाई कदम के क्रम में microfluidic चैनल प्रधानमंत्री के लिए किया जाता है ।

मंच इस्तेमाल किया ६००,००० PHH प्रति अच्छी तरह से उपयोग करता है, जो पाड़ों के भीतर multilayered हेपैटोसाइट्स सुनिश्चित करता है । हालांकि सेल संख्या अलग किया जा सकता है, चुना कोशिका एकाग्रता इष्टतम परिणाम सुनिश्चित करता है । प्लेट प्रारूप में कुल 12 मचान धारण करते हैं, जिन्हें ३६ पाड़ों में अपग्रेड किया जा सकता है । हालांकि, microfluidic आवश्यकताओं के कारण, उच्च अच्छी संख्या तक स्केलिंग तिथि करने के लिए संभव नहीं है ।

इन तरीकों का उपयोग करना, संस्कृतियों को कम ४० दिनों के लिए इष्टतम सेल के प्रदर्शन के साथ बनाए रखा जा सकता है, जो, इस प्रकार अब तक, अभूतपूर्व उपंयास दवा उंमीदवारों का मूल्यांकन अवसर प्रदान करता है, साथ ही विभिंन यकृत कोशिका के बीच परिसर में खेल का अध्ययन एचबीवी संक्रमण के दौरान आबादी ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम यूरोपीय अनुसंधान परिषद (६३७३०४), एक वेलकम ट्रस्ट अन्वेषक पुरस्कार (104771/जेड/14/जेड से एक स्टार्टर अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया), और CN जैव नवाचारों द्वारा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
William's E Medium, no phenol red GIBCO A12176-01
Hepatocyte Thaw Medium GIBCO CM7500
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements GIBCO CM3000
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements GIBCO CM4000
DMEM/F-12 GIBCO 11320-033
Advanced DMEM GIBCO 12491023
DPBS, no calcium, no magnesium GIBCO 14190-144
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x GIBCO 11140050
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) GIBCO 15140-122
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture SIGMA 12106C
Hydrocortisone SIGMA H0888
Trypan blue Merck T8154
Collagen from calf skin Merck C9791
G418 SIGMA G418-RO
Tetracycline SIGMA T3258
Polyethylene glycol 8000 SIGMA P2139
Sucrose SIGMA SO389
Sodium carbonate anhydrous SIGMA 451614-25G
Sodium bicarbonate SIGMA S5761
Sodium azide SIGMA S2002-5G
Sulfuric acid, 99.999% SIGMA 339741
4% Paraformaldehyde SIGMA 252549
Triton-X 100 SIGMA X100
Tween 20 SIGMA P1379
DAPI SIGMA D9564
Albumin (human) SIGMA A9731
Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated Fisher Scientific BP9701-100
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen P36930
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG Applied Biosystems 4440040
SYBR Select Master Mix Applied Biosystems 4472903
Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 InvivoGen tlrl-eklps
Name Company Catalog Number Comments
Kits/Consumables
Sterile membrane CN Bio innovations LC-SC
LiverChip Perfusion cell culture plate CN Bio innovations LC12
LiverChip culture plate lid CN Bio innovations LC-SC
Sterile round filter paper CN Bio innovations LC-SC
Cell attachment scaffold CN Bio innovations LC-SC
Retaining ring CN Bio innovations LC-SC
Sterile plunger CN Bio innovations LC-ST
Dneasy blood & tissue kit Qiagen 69506
Rneasy mini kit Qiagen 74106
Human Magnetic Luminex assay R&D Systems
1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution ThermoFisher Scientific 34028
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit ThermoFisher Scientific 4368814
QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set Qiagen 1048147 Containing RNA carrier
Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile Millipore (Merck) PFHYS1008
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Life technologies 4309849
MicroAmp Optical Adhesive Film Life technologies 4311971
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates ThermoFisher Scientific 442404
Sealing Tape for 96-Well Plates ThermoFisher Scientific 15036
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane ThermoFisher Scientific 295-3345
Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost Fisher Scientific FB58628
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm Beckman Coulter 344058
Name Company Catalog Number Comments
Primary cells / Cell lines
Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified Thermo Fisher Scientific HMCPTS
Cryopreserved Human Kupffer Cells Thermo Fisher Scientific HUKCCS
HepDE19 cell line Haitao Guo (Indiana University, IN, USA)
Name Company Catalog Number Comments
Primers/Probes/Standards
HBV DNA forward primer Invitrogen 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'
HBV DNA reverse primer Invitrogen 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'
HBV DNA probe Invitrogen 5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA
pgRNA forward primer Invitrogen 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'
pgRNA reverse primer Invitrogen 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'
RPS11 forward primer Invitrogen 5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'
RPS11 reverse primer Invitrogen 5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'
pCMV-HBV Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA)
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal) DAKO discontinued Lot 10102505
Human Albumin Antibody, A80-129A Bethyl Laboratories. inc A80-129A
Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P Bethyl Laboratories. inc A80-229P
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific # A-11072 Lot 1431810
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
LiverChip Vacuum pump CN Bio innovations LC-PN
LiverChip Pneumatic Hookup CN Bio innovations LC-PN
LiverChip platform CN Bio innovations LC-PN
LiverChip plate washing dock CN Bio innovations
Autoclavable metal forceps VWR 232-0106
Vortex Genie 2 Scientific industries SKU: SI-0236
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge Thermo Scientific 75004500
SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow MGE worldwide  SAM12/01010101
NUAIRE 5800 SERIES incubator NUAIRE NU-5841
Automated precision torgue CN Bio innovations
Manual torque CN Bio innovations
LiverChip compressor CN Bio innovations
Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1 Luminex
Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block ThermoFisher Scientific Millipore™ 40-285
FluoStar Optima Plate Reader BMG Labtech
KOLVER Precision electric screwdrivers VTECH ltd FAB10RE/FR
KOLVER Power supply VTECH ltd EDU1FR
BAMBI VTS75D Air Equipment Discontinued
Integra Vacuboy INTEGRA
ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block ThermoFisher Scientific 4453536

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References

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इम्यूनोलॉजी और इंफेक्शन इश्यू १४४ हेपेटाइटिस बी वायरस microfluidic डिवाइस टिशू कल्चर अंग-ए-चिप इंजीनियरिंग हेपैटोसाइट्स Kupffer सेल
"जिगर पर एक चिप" हेपेटाइटिस बी वायरस के संक्रमण के लिए प्राथमिक हेपैटोसाइट्स और Kupffer कोशिकाओं की संस्कृतियों
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Ortega-Prieto, A. M., Skelton, J.… More

Ortega-Prieto, A. M., Skelton, J. K., Cherry, C., Briones-Orta, M. A., Hateley, C. A., Dorner, M. "Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection. J. Vis. Exp. (144), e58333, doi:10.3791/58333 (2019).

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