Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

"Lever på-Chip" kulturer av primære hepatocytter og Kupffer celler for hepatitt B-smitte

Published: February 19, 2019 doi: 10.3791/58333
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Section of Virology, Department of Medicine, Imperial College

Summary

Målet med denne protokollen er å gi en trinnvis veiledning for å utføre eksperimenter 3D "lever på-chip" infeksjon med hepatitt B-viruset.

Abstract

Til tross for den eksepsjonelle infectivity av hepatitt B-viruset (HBV) i vivo, der bare tre viral genomer kan resultere i en kronisitet eksperimentelt infiserte sjimpanser, krever mest i vitro modeller flere hundrevis til tusenvis av viral genomer per celle i for å starte en forbigående infeksjon. I tillegg kan statisk 2D kulturer av primære menneskelige hepatocytter (PHH) bare kortsiktige studier på grunn av deres raske dedifferentiation. Her beskriver vi 3D lever på-chip kulturer av PHH, i monokulturer eller cocultures med andre nonparenchymal lever-resident celler. Disse tilbyr en betydelig forbedring å studere langsiktige HBV infeksjoner med fysiologiske verten celle svar. Til rette for narkotika effekt studier og toksikologiske analyser undersøkelser i patogenesen, aktiverer disse microfluidic kultur systemer evalueringen av helbredende terapier for HBV-infeksjon å eliminere covalently lukket, rundskriv (ccc) DNA. Dette presentert metoden beskriver av PHH monokulturer og PHH/Kupffer cellekulturer co, infeksjon med renset HBV og analyse av verten svar. Denne metoden er særlig aktuelt for evaluering av langtidseffekter av HBV-infeksjon, kombinasjoner og patogenesen.

Introduction

Studiet av HBV har blitt komplisert av dårlig mottakelighet kultur systemer, krever flere hundrevis til tusenvis av HBV genomet eksemplarer per celle for å starte det infeksjon1. Videre primære menneskelige hepatocytter er generelt svært skjøre og dedifferentiate raskt under konvensjonelle kulturer2. Dette er hovedsakelig på grunn av det faktum at flat og hard plast overflater ikke etterligne de ekstracellulære naturmiljøer funnet i leveren og den generelle mangelen oksygenering kulturer i fravær av microfluidic sirkulasjon. Konvensjonelle statisk hepatocyte kulturer på kollagen belagte plater raskt dedifferentiate og miste sin mottakelighet for HBV-infeksjon3. Her beskriver vi oppsett og infeksjon av PHH dyrkes i 3D lever på-chip kulturer som er vesentlig fordel over konvensjonelle 2D statisk PHH kulturer på kollagen belagte plater på grunn av sin utvidet metabolske og funksjonelle kompetanse, tilrettelegge langsiktig kulturer av minst 40 dager4. I dette systemet, er PHH seeded på kollagen-belagt stillaser, som er kontinuerlig parfyme med vekstmediet til å levere oksygen og næringsstoffer til cellene. Selv om alternativ kultur systemer for PHH basert på komplekse cocultures murint fibroblaster eller 3D veksten i spheroids er blitt godkjent og er utsatt for HBV-infeksjon med multiplicities for smitte av 500 genomet ekvivalenter (GE) av HBV per celle, 3D lever-on-a-chip kulturer forbli eneste i vitro modell systemet utsatt til 0,05 GE av HBV per celle4. Dette er i tillegg understøttet av bruk av høye konsentrasjoner av dimethyl sulfoxide (DMSO) og polyetylenglykol (PEG) for å etablere HBV-infeksjon i disse kulturene, som er unnværlig for infeksjon av 3D lever på-chip kultur systemer 4. blant store kjennetegnene av HBV infeksjon er cccDNA bassenget, som fungerer som transcriptional malen for alle de novo-produsert virions5,6. Selv om cccDNA kan oppdages i konvensjonelle hepatocyte kulturer7,8, det er fortsatt uklart om regulering av cccDNA og noen terapeutiske metoder rettet mot sin eliminasjon er recapitulated i delvis eller helt dedifferentiated hepatocytter. Vi har vist at cccDNA er funksjonelt dannet i 3D lever på-chip kulturer, svarer til fysiologiske stimuli, og kan rettes ved å påvirke tilgjengeligheten av transcriptional maskiner til cccDNA genomet4.

Verten Svar å HBV-infeksjon i 3D lever på-chip etterligne de observert i HBV-infiserte pasienter, aktivere identifikasjon av biomarkers for infeksjon, i tillegg til terapeutisk suksess. Blant de unike funksjonene til leveren på-chip kulturer er muligheten til å evaluere langsiktige vert svar mellom PHH og andre nonparenchymal celler i leveren, inkludert Kupffer celler4, stellate celler9og leveren sinusformet endotelceller10,11. Dette gir en unik mulighet til å vurdere celle/celle interaksjoner i en kompleks 3D microenvironment.

I tillegg forenkler utvidet kultur perioden av denne plattformen evalueringen av sekvensiell medikamentelle behandlinger og deres innvirkning på HBV utholdenhet, som ikke er mulig å bruke konvensjonelle hepatocyte kultur systemer.

Denne protokollen beskriver hvordan 3D lever på-chip kulturer genereres, enten for monokulturer av PHH eller cocultures av PHH med Kupffer celler. I tillegg beskriver vi produksjon av renset HBV for lav-mangfold-av-infeksjon studier, samt påfølgende analyse av verten og viral svar.

Protocol

1. montering og balanse av plater

  1. Kontroller at både kompressoren og vakuumpumpe knyttet LiverChip plattformen er slått på. Utføre montering og balanse av platene i en klasse II kabinett.
  2. Tas aseptisk å samle microfluidic platene ved å plassere en steril membranen mellom plate base og legge til godt inneholder topplaten (figur 1a).
  3. Kontroller at sterilt membranen jevnt hviler på to pinnene av base plate, siden ujevn membran plassering kompromisser microfluidic sirkulasjonen.
  4. Legg sterilt plate lokk og stram skruene i bunnen av platen med en automatisert presisjon dreiemoment til 33 lb bruker en spiral stramme sekvens. Kontroller at alle skruene strammes opp til 35 lb bruke en manuell dreiemoment. I dette trinnet, sikre skruene strammes symmetrisk (figur 1a).
  5. Prewarm hepatocyte seeding middels inneholder Williams E medium, primære hepatocyte tining og plating kosttilskudd, 5% fosterets bovin serum (FBS) og 1 µM deksametason 37 ° c før grunning.
  6. Prime absolutt samlet platen ved å plassere den i vask dock og legge til 400 µL av hepatocyte frø medium til reservoaret side i hver brønn. Kontroller platen knepper vask dock helt.
  7. Starte flyt i oppadgående retning for 3,5 min på 1 µL/s. Vellykket funksjon microfluidic sirkulasjonen kan konstatert gjennom rød indikatorene på siden av tallerkenen (figur 1a).
  8. Når mediet pumpes til celle vekst siden av tallerkenen, sikre riktig montering av flyt kanalen, legge til en ekstra 1,2 mL hepatocyte seeding medium.
  9. Nøye overføre platen til dokkingstasjonen i en fuktet inkubator på 37 ° C og 5% CO2 og starte strømmen i oppadgående retning på en strømningshastighet på 1 µL/s 16 h (figur 1 c).
  10. Overføre platen til vask dock og eliminere bobler i brønnen av pipettering forsiktig opp og ned.
  11. Legge til en steril, runde filter papir, etterfulgt av en celle vedlegg stillaset og en låseringen, hver brønn ved hjelp av sterile pinsett. Trykk ned hver brønn med et sterilt stempelet å låse de beholde ringer og stillaser på plass (figur 1b).
  12. Sug opp alle medium og legge til 400 µL prewarmed hepatocyte seeding middels forsiktig over stillaset og starte strømmen i nedadgående retning for 3,5 min på 1 µL/s.
  13. Leveringstanken alle medium pumpes ut av reservoaret siden av platen. Dette trinnet er nødvendig å erstatte mediet i flyt kanalen.
  14. Legge til 1,4 mL hepatocyte seeding medium i hver brønn før retur platen til dokken å fullføre det totale volumet per brønn. Volumet per brønn er nå 1.6 mL (1,4 mL brønnen og 0,2 mL i flyt kanalen).

2. tining og Seeding hepatocytes for monokulturer

  1. Prewarm hepatocyte tining medium og hepatocyte seeding middels til 37 ° C før tining en flaske av PHH ifølge leverandørenes instruksjoner. Bruke en sentrifuge ved romtemperatur i dette trinnet for å unngå plutselige temperaturendringer. Utføre det tine og seeding hepatocytes i en klasse II regjering.
  2. Resuspend cellene i 1 mL av hepatocyte seeding medium og telle celler med trypan blå. Kontroller at levedyktigheten til cellene er over 90%.
  3. Holde cellene på is inntil de legges til brønnene.
  4. Overføre equilibrated og ferdigmonterte platen til vask dock og Sug opp alle medium fra brønnene.
  5. Tilsett 600.000 hepatocytter hver brønn i et 500 µL volum av hepatocyte seeding medium.
  6. Starte flyt i den nedadgående retningen på en strømningshastighet på 1 µL/s og bringe det totale volumet i brønnen til 1,6 mL ved å legge til 900 µL av hepatocyte frø medium.
  7. Overføre platen til dokkingstasjonen i en fuktet inkubator på 37 ° C og med 5% CO2.
  8. Starte flyt i den nedadgående retningen på en strømningshastighet på 1 µL/s for 8 h, etterfulgt av en flyt tilbakeføring til den oppadgående retningen på en strømningshastighet på 1 µL/s 8 h.
  9. Overføre platen til vask dock og Sug opp alle medium fra brønnene.
  10. Legge til 400 µL hepatocyte vedlikehold middels (Williams E medium med hepatocyte vedlikehold kosttilskudd og 100 nM dexamethasone) hver godt og initiere flyt i den nedadgående retningen på en strømningshastighet på 1 µL/s for 3,5 min.
  11. Sug opp alle medium fra reservoaret og legge 1,4 mL hepatocyte vedlikehold medium (figur 1 d).
  12. Erstatt medium med hepatocyte vedlikehold medium hver 48 timer. For å sikre alle medium i brønnen erstattes, kan du utføre en vask trinnet før en frisk hepatocyte vedlikehold medium.
  13. For vask trinn, overføre platen til vask dock, Sug opp alle medium fra brønnene og legge til 400 µL av vedlikehold medium.
  14. Starte flyt i den nedadgående retningen på 1 µL/s for 3,5 min. leveringstanken alle medium vises på siden reservoar av brønnene.
  15. Legge til 1,4 mL av hepatocyte vedlikehold medium, og innenfor en fuktet inkubator på 37 ° C og med 5% CO2, overføre platen til forankringsenheten og starte strømmen i oppadgående retning på en strømningshastighet på 1 µL/s 48 h (figur 1f).
    Merk: For hepatocyte monokulturer brukt som kontroller for cocultures, for å sikre kontrollerte forhold, brukes en annen type vedlikehold medium, som er spesifikk for bruk i cocultures med primær menneskelige Kupffer celler. 48 timer etter erstatter hepatocyte seeding medium med hepatocyte vedlikehold medium (dag 3 etter såing), vanlig hepatocyte vedlikehold mediet erstattes med coculture vedlikehold medium II, spesielt i monokulturer av PHH når sammenlignende å cocultures av både PHH og Kupffer celler, som middels komponentene er litt forskjellige.

3. tining og Seeding Kupffer celler og hepatocytter for co kulturer

  1. For å sikre en nøyaktig sammenligning av resultatene, alltid sammenligne PHH/Kupffer celle cocultures å PHH monokulturer
  2. For cocultures av PHH og Kupffer celler, tine en flaske Kupffer celler i avansert Dulbeccos endret Eagle's medium (AdDMEM) uten deksametason men supplert med primær hepatocyte tining og plating kosttilskudd (coculture seeding medium) ifølge leverandørenes instruksjoner. Utføre det tine og seeding Kupffer celler og hepatocytes som en klasse II regjering.
  3. Resuspend cellene i 1 mL av coculture frø medium og telle celler med trypan blå. Kontroller at levedyktigheten til cellene er over 90%.
  4. Holde cellene på is før du legger dem fordelt å unngå celleadhesjon.
  5. Følg instruksjonene i trinn 2.1-2.3 for tining hepatocytes primære menneskelig.
  6. Overføre equilibrated og ferdigmonterte platen til vask dock og Sug opp alle medium fra brønnene.
  7. Legge til 60.000 Kupffer celler og/eller 600.000 hepatocytter hver brønn i et totalt volum på 250 µL hver av coculture frø medium.
  8. Starte flyt i den nedadgående retningen på en strømningshastighet på 1 µL/s og legge 900 µL av coculture frø medium i hver brønn.
  9. Overføre platen til forankringsenheten innenfor en fuktet inkubator på 37 ° C og med 5% CO2.
  10. Starte flyt i den nedadgående retningen på en strømningshastighet på 1 µL/s for 8 h, etterfulgt av flyt tilbakeføring til den oppadgående retningen på en strømningshastighet på 1 µL/s 8 h.
  11. Overføre platen til vask dock og Sug opp alle medium fra brønnene.
  12. Legge til 400 µL coculture vedlikehold middels jeg (AdDMEM uten deksametason men supplert med hepatocyte vedlikehold kosttilskudd) til hver godt og initiere flyt i den nedadgående retningen på en strømningshastighet på 1 µL/s for 3,5 min.
  13. Sug opp alle medium fra reservoaret siden og legge til 1,4 mL coculture vedlikehold medium jeg i hver brønn.
  14. Overføre platen til dokkingstasjonen i en fuktet inkubator på 37 ° C og med 5% CO2 og starte flyt i oppadgående retning på en strømningshastighet på 1 µL/s for 48 timer.
  15. Overføre platen til vask dock og Sug opp alle medium fra brønnene. Legg til 400 µL coculture vedlikehold middels II (Williams E medium uten deksametason men supplert med 100 nM hydrocortisone og hepatocyte vedlikehold kosttilskudd) og starte strømmen i den nedadgående retningen på 1 µL/s for 3,5 min.
  16. Sug opp alle medium vises på siden reservoar av brønnene.
  17. Legge til 1,4 mL coculture vedlikehold medium II og overføre platen i dokkingstasjonen i en fuktet inkubator på 37 ° C og med 5% CO2.
  18. Starte flyt i oppadgående retning på en strømningshastighet på 1 µL/s 48 h (figur 1e).
  19. Erstatt medium hver 48t med coculture vedlikehold medium II. For å sikre alle medium i brønnen erstattes, kan du utføre en vask trinnet før en fersk medium.
  20. For å vaske, overføre platen til vask dock, Sug opp alle medium fra brønnene og legge til 400 µL coculture vedlikehold middels II.
  21. Starte flyt i den nedadgående retningen på 1 µL/s for 3,5 min. leveringstanken alle medium vises på siden reservoar av brønnene.
  22. Legg 1,4 mL coculture vedlikehold medium II og overføre platen til dokkingstasjonen i en fuktet inkubator på 37 ° C og med 5% CO2, og starte strømmen i oppadgående retning på en strømningshastighet på 1 µL/s 48 h (figur 1f).

4. produksjon av en smittsomme hepatitt B Virus for infeksjon studier

  1. Utføre denne delen av protokollen i en oppdemning nivå III lab. Gjøre såing, middels endringer, middels innsamling og virus konsentrasjon i en klasse II regjering.
  2. Kultur HBV-produserende celler (f.eks HepDE19, HepAD38) i kollagen-belagt T1000 5-lags flasker i 120 mL av komplett DMEM/F12 (10% FBS, penicillin/steptomycin, unødvendige amino syren, 500 μg/mL G418 og 1 μg/mL tetracycline) til de når 90% confluency.
  3. Endre mediet til induksjon middels (komplett DMEM uten tetracycline) for å indusere HBV produksjon.
  4. Samle det komplette middels volumet hver 48t for 12 dager etter tilbaketrekning av tetracycline og lagre det på 4 ° C.
  5. Filtrere samlet mediet gjennom et 0,45 µm flaske topp filter.
  6. Legge til sterilt pinne 8000 i fosfat-bufret saltvann (PBS) samlet mellomlang til en siste konsentrasjon av 4% w/w bland ved å snu 8 x-10 x og ruge ved 4 ° C i 16 h. sentrifuge 10.000 x g 1t på 4 ° C å samle PEG-igangsatte virus og resuspend pellet i PBS inneholder 10% FBS.
  7. Kombiner PEG-igangsatte virus fra alle høsting tidspunkt og lag på toppen av en 20% sukrose pute. Sentrifuge 140.000 x g 16 h på 4 ° C med en SW28 rotoren.
  8. Sug opp nedbryting og resuspend pellet i PBS med 10% FBS, og aliquot og lagre det på-80 ° C.
  9. Finne HBV DNA kopi nummeret i nedbryting av HBV DNA qPCR (trinn 6).

5. infeksjon av 3D kulturer med HBV

  1. Utføre infeksjoner i en klasse II CAB innenfor en oppdemning nivå III lab.
  2. 3 dager etter seeding monokulturer eller cocultures, tine antall HBV inneholder dele ved romtemperatur og fortynne den nødvendige virus dosen i 1,8 mL hepatocyte vedlikehold medium eller coculture vedlikehold medium II per brønn, henholdsvis.
  3. Denne 1,8-mL utvannet virus er tilstrekkelig for vask trinn (400 µL) og utskifting av medium i brønnen (1,4 mL). Imidlertid må nødvendig mangfoldet av infeksjon justeres kontoen for den endelige kultur mengden 1.6 mL.
  4. Overføre platen til vask dock og Sug opp alle medium fra brønnene. Legge til 400 µL av HBV-inneholder medium og starte flyt i den nedadgående retningen på 1 µL/s for 3,5 min. leveringstanken alle middels vises på siden reservoar av brønnene.
  5. Legge til 1,4 mL av HBV-inneholder vedlikehold medium/coculture vedlikehold middels II per vel og overføre platen i dokkingstasjonen i en fuktet inkubator på 37 ° C og med 5% CO2. Starte flyt i den nedadgående retningen på en strømningshastighet på 1 µL/s for 8 h, etterfulgt av en tilbakeføring til den oppadgående retningen på en strømningshastighet på 1 µL/s.
  6. 24 timer etter tillegg av HBV, overføre platen til vask dock og Sug opp alle medium fra brønnene.
  7. Vask hver i platen 3 x med den tilsvarende mediet, i henhold til kultur som beskrevet i trinn 2.12-2.14, for å eliminere leftover virus fra brønnen. I motsetning trinn 2.12-2.14, legge til 1,6 mL av medium i hver brønn kontoen til ekstra volumet prøves for å utelukke inoculum carryover (figur 1 g).
  8. Følgende fremgangsmåten vask samle 200 µL av medium fra hver brønn å bekrefte fullstendig fjerning av HBV-inoculum av kvantifisering av ekstracellulære HBV DNA.
  9. Overføre platen til forankringsenheten innenfor en fuktet inkubator på 37 ° C og med 5% CO2og starte flyt i oppadgående retning på en strømningshastighet på 1 µL/s for 48 timer.
  10. 48 timer senere, samle hele godt volumet for nedstrøms analyse, etterfulgt av tre vasker med hepatocyte vedlikehold medium som beskrevet i fremgangsmåten 2.12-2.14. Erstatt medium og vaske hver vel 3 x alle 48 timer før eksperimentelle oppsigelse.

6. kvantifisering av ekstracellulære HBV DNA

  1. Isolere totale DNA fra kultur supernatants i henhold til produsentens instruksjoner med tillegg av 1 µg av RNA i en oppdemning nivå III lab å sikre det virus inaktivering i prøvene før flyttes til et annet område.
  2. Forberede en master blanding som inneholder kvantitative PCR master mix, 600 nM frem primer, 600 nM omvendt primer, og 300 nM i sonden.
  3. Legge til 7 µL av master blandingen i hver brønn av en 384-vel plate.
  4. Legge til 5 µL av DNA-prøver i duplikat, en ingen-mal kontroll og duplikater av serielt utvannet HBV genomet inneholder plasmider-basert standard (f.eks pCMV-HBV) varierer fra 109 eksemplarer per reaksjon på 102 eksemplarer per reaksjon hver brønn av den qPCR platen.
  5. Plasser en selvklebende dekke over platen og sikre at hver også er forseglet riktig.
  6. Sentrifuge platen i 1 min på 300 x g.
  7. Starte qPCR i henhold til produsentens instruksjoner. Syklus betingelsene for sanntids PCR er 95 ° C i 10 min, etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C for 15 s og 60 ° C i 1 minutt.
  8. Kvantifisere antall HBV DNA eksemplarer i ukjent prøvene ifølge standardkurven.

7. kvantifisering av intracellulær HBV Pregenomic (pg) RNA

  1. Isolere totale RNA fra stillasene i henhold til produsentens instruksjoner. For å sikre fullstendig celle lysis, vortex hver stillas 3 x for 30 s etterfulgt av sentrifugering på 300 x g for 1 min mellom hvert vortexing. Utføre celle lysis i forvaring nivå III lab å sikre det virus inaktivering i prøvene før flyttes til et annet område.
  2. Transkribere cDNA fra den isolerte RNA i henhold til produsentens instruksjoner.
  3. Syklus betingelsene for retrotranscription er 25 ° C i 10 min, 37 ° C for 120 min, og 85 ° C i 5 minutter.
  4. Holde cDNA prøvene på 4 ° C for kortsiktige eller på 20 ° C for langtidslagring.
  5. Forberede master mikser for pgRNA og RPS11 som inneholder kvantitative PCR master mix og forover og bakover grunning for pgRNA og RPS11 (brukt som housekeeping genet) i en siste konsentrasjon av 0,2 µM.
  6. Legge til 7,5 µL av master mix og 2,5 µL av cDNA per brønn på en 384-vel plate. RPS11 og pgRNA av hvert utvalg i duplikat, og inkluderer en nei-mal kontroll for både gener.
  7. Plasser en selvklebende dekke over platen og sikre at hver også er forseglet helt.
  8. Sentrifuge platen i 1 min på 300 x g.
  9. Sett inn platen i qPCR cycler og starte qPCR bruker standard kvantitative PCR-protokoll i henhold til produsentens instruksjoner. Syklus betingelsene for sanntids PCR er 50 ° C for 2 min, 95 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 40 sykluser av 95 ° C for 15 s og 60 ° C i 1 minutt.
  10. Beregne uttrykk for pgRNA i forhold til RPS11.

8. immunofluorescence farging av Viral Antigen

  1. Fjern låseringen fra brønnen og fjerne stillaset med tang i en klasse II regjering i forvaring nivå III lab.
  2. Fastsette cellen inneholder stillasene med 4% paraformaldehyde i 1 mL av PBS i 30 min ved romtemperatur i forvaring nivå III lab. Følgende trinn kan utføres i et annet område.
  3. Vask stillasene 3 x med 1 mL av PBS.
  4. Permeabilize cellene med 0,1% Triton-X 100 i 1 mL av PBS 1t ved romtemperatur.
  5. Vask stillasene 3 x med 1 mL av PBS.
  6. Blokk uspesifisert bindingen av inkubasjonstiden for stillasene med 1% BSA i 1 mL av PBS for 16 timer på 4 ° C.
  7. Vask stillasene 3 x med 1 mL av PBS.
  8. Utføre primære antistoff flekker med kanin anti-hepatitt B virus kjerneantigen på en fortynning av 1:200 i 1% BSA i 1 mL av PBS for 16 timer på 4 ° C.
  9. Vask stillasene 1 x med 0,1% mellom 1 mL av PBS (PBS-Tween) og 3 x med 1 mL av PBS.
  10. Utføre sekundære antistoff flekker med geit anti-kanin IgG (H + L) kryss-adsorbert Alexa Fluor 594-konjugerte sekundære antistoff på en fortynning av 1:2,000 i 1% BSA i 1 mL av PBS 16 h på 4 ° C.
  11. Vask stillasene 1 x med 1 mL av 0,1% PBS-Tween og 3 x med 1 mL av PBS.
  12. Counterstain stillasene bruke DAPI i 1 mL av PBS i en konsentrasjon av 2 µg/mL for 10 min ved romtemperatur.
  13. Vask stillasene 1 x med 1 mL av 0,1% PBS-Tween og 3 x med 1 mL av PBS.
  14. Overføre stillasene et mikroskop lysbilde og montere den for bildebehandling.
  15. Bilde stillasene bruker fluorescens mikroskop.

9. menneskelige Albumin ELISA

  1. Utføre denne delen av protokollen i en klasse II regjering tildelt i forvaring nivå III lab hvis arbeider med smittestoffer.
  2. For å evaluere levedyktighet og metabolske funksjonaliteten i PHH, evaluere menneskelige albumin produksjon av ELISA.
  3. Pelsen 96-brønns plater med 50 µL per brønn geit anti-antistoff utvannet 1:800 belegg buffer (100 mM bikarbonat/carbonate, pH 9.6). Dekke platene og Inkuber for 2t på 37 ° C eller over natten på 4 ° C.
  4. Sug opp belegg antistoffer fra platen og vaske det 4 x med 200 µL på 0,05% PBS mellom.
  5. Legge til 200 µL blokkerer bufferen (1% BSA i PBS), dekker platene og ruge dem 1t på 37 ° C eller lagre dem på 4 ° C for 3 måneder. For langvarig lagring, legge til 0,05% Natriumazid blokkerer bufferen.
  6. Sug opp den blokkerende bufferen og vaske 1 x med 200 µL på 0,05% PBS mellom.
  7. Legge til 50 µL av tidligere fortynnede prøver per brønn (1: 100). Eksempel fortynner inneholder 1% BSA 0,05% PBS mellom. Inkuber 1t på 37 ° C eller over natten på 4 ° C.
    Merk: Ruge standarder samtidig som prøvene. Mange konsentrasjon av 500-0.488 ng/mL (1:2 føljetong fortynninger) anbefales. Utfør alle føljetong fortynninger av menneskelig albumin i prøven fortynner.
  8. Sug opp prøvene fra platen og vaske det 4 x med 200 µL på 0,05% PBS mellom.
  9. Legge til 50 µL HRP-konjugerte geit anti-menneskelige albumin antistoff tidligere fortynnet 1:10,000 i prøven fortynner. Inkuber for 2t på 37 ° C eller over natten på 4 ° C.
  10. Sug opp antistoffer fra platen og vaske det 6 x med 200 µL på 0,05% PBS mellom.
  11. Legge til 100 µL av TMB reagensen og så snart de høyeste standardene er fullt utviklet, legge 100 µL H 1 M2så4 stoppe kolorimetrisk reaksjonen.
  12. Lese absorbansen ved 450 nm på en 96-brønns plate leser for analyse.

10. Interleukin (IL) 6 og Tumor nekrose faktorer (TNF) α produksjon i 3D co kulturer

  1. Utføre denne delen av protokollen i en klasse II regjering tildelt i forvaring nivå III lab hvis arbeider med smittestoffer.
  2. Kvantifisere IL6 og TNFα produksjon for å vurdere funksjonaliteten og levedyktigheten til de primære Kupffer cellene. Behandle cocultures med 1 µg/mL lipopolysakkarid (LPS) 9 d etter seeding i coculture vedlikehold medium II for 48 timer for å indusere produksjon av disse cytokiner av Kupffer celler.
  3. På dag 11 etter seeding, høste mediet fra hver brønn og lagre den på-80 ° C.
  4. Måle IL6 og TNFα konsentrasjonen i kultur medium ved en riktig analyse og i henhold til produsentens instruksjoner.

Representative Results

Vi beskriver en enkel og allsidig plattform for langsiktig kultur primære menneskelige Kupffer celler og/eller hepatocytter og infeksjon med HBV. Primære menneskelige celler er seeded på kollagen-belagt polystyren stillaser innenfor en microfluidic plate assembly, som kontinuerlig perfuses cellene med vekstmediet (figur 1a).

PHH, som vanligvis bare stabil for en begrenset tid i tradisjonell kultur systemer, kan vedlikeholdes funksjonelt for lengre perioder. Menneskelige albumin, som er skilt ut av funksjonelle hepatocytter og regnes som den beste markøren for vurdering av hepatic metabolisme, uttrykkes stabilt og svært av 3D kulturer til dag 40 etter seeding (figur 2). For cocultures, kan Kupffer celle funksjonen og levedyktigheten vurderes av utskillelsen av bestemte cytokiner (f.eks IL6 og TNFα). For å måle cytokin produksjon, anbefales bruk av fange-baserte Gjenkjenningsmerknad means over LPS-stimulering av cocultures (Figur 3).

Cellene danner hepatisk microtissues, vanligvis innen 3 dager fra såing av PHH, demonstrere funksjonelle galle canaliculi og fullstendig celle polarisering (figur 2). I tillegg til å beholde sine fysiologiske cellenes stoffskifte, blir disse kulturene svært utsatt for HBV-infeksjon. HBV DNA og andre viral markører, i motsetning til andre kultur systemer, blir lett synlig fra dag 2 etter infeksjon (Figur 4). I tillegg til utskilles markører for virusinfeksjon, kan hepatocyte inneholder stillaser Hentet fra kulturer og brukes for immunofluorescence påvisning av viral antigener (f.eks HBsAg, HBcAg) (Figur 4). Hvor konvensjonelle hepatocyte kulturer krever inoculation med minst 500 HBV GE per celle og tillegg av 2% DMSO og 4% pinne, så få som 0,05 HBV GE er kjøpedyktig starte infeksjoner i 3D kulturer uten behovet av DMSO eller pinne (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: oppsett av 3D lever på-chip kulturer. (en) Dette er et skjematisk oppsett for montering av kultur plate for å sikre opprettelsen av microfluidic sirkulasjon. (b) dette panelet viser et nærbilde av kultur, inkludert den filter papir, stillaset og låseringen. (c) dette panelet viser prosessen med plate balanse før såing kulturer. De neste to panelene viser prosessen med frø for (d) hepatocyte monokulturer og (e) hepatocyte/Kupffer cocultures. (f) dette panelet viser vask trinnene involvert i middels endringer. (g) dette panelet viser HBV-infeksjon satt opp, inkludert fjerning av inoculum. S.M. = seeding medium, mm = vedlikehold medium. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: hepatisk microtissue formasjon og hepatocyte levedyktighet. (en) dette panelet viser langsgående brightfield bilder av 3D hepatocyte monokulturer demonstrere microtissue formasjon etter seeding. (b) dette panelet viser immunofluorescence imaging kulturer for kjerner (blå) og menneskelige albumin (grønn). (c) dette panelet viser langsgående totale albumin, samt per celle justert albumin produksjon, under 40 dager av hepatocyte monokulturer, som ELISA. Dataene er gjennomsnittlig ± SD. Dette tallet er tilpasset fra Ortega-Prieto et al.4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Kupffer celle funksjonalitet i 3-D cocultures. Disse skjermbildene viser utskillelsen av (en) IL6 og (b) TNFα i hepatocyte monokulturer og hepatocyte/Kupffer celle cocultures 11 dager etter seeding svar på exogenously ekstra LPS på dag 9 innlegg seeding, som bestemmes ved hjelp av menneskelig magnetiske Luminex analysen. Dette tallet er tilpasset fra Ortega-Prieto et al.4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: HBV-infeksjon i liver-on-a-chip kulturer. (en) dette panelet viser immunofluorescence mikroskopi gjenkjenning av HBcAg (rød), HBsAg (grønn) og kjerner (blå) 10 dager etter smitte av kulturer med HBV. (b) dette panelet viser mottakelighet av kulturer for HBV-infeksjon med ulike multiplicities av infeksjon, som bestemmes av en kvantifisering av HBV DNA i kultur supernatants. (c) dette panelet viser kvantifisering av langsgående akkumulering av HBV pgRNA i forhold til housekeeping genet RPS11. Dataene er gjennomsnittlig ± SD. Dette tallet er tilpasset fra Ortega-Prieto et al.4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Utfordringene i å opprettholde langsiktig kulturer av PHH har drevet utviklingen av flere kultur modeller med økt funksjonalitet og lang levetid, hver viser differensial fordeler og ulemper. Det er nå allment anerkjent at statisk 2D kulturer av PHH er mimicking visse aspekter av hepatocyte biologi for svært begrensede mengder av tid. Dermed micropatterned cocultures12,13, formet kulturer14,15, og 3D lever på-chip kulturer16,17 erstatter disse mer grunnleggende systemer. Spesielt når studere smittsomme sykdommer, som har coevolved med deres vert å utnytte spesifikk microenvironments, er behovet for å gi fysiologiske miljøer understøttet av ofte utfordrende natur dyrking menneske-tropic infeksjonssykdommer, som hepatitt C-viruset, HBV og malaria.

Det viktigste trinnet i å utføre 3D lever på-chip kulturer er kvaliteten på de opprinnelig hentet primære celletyper. Disse cellene skal testes for sin tilslutning kapasitet og bare plateable PHH mange bør brukes for å sikre vellykket vev formasjonen og kultur generasjon. Selv om ferske isolert PHH kan brukes, deres kryonisk bevaring er vanligvis komplisert og krever spesielle rate-kontrollerte frysere.

I motsetning til konvensjonelle statisk 2D kulturer, vert genetisk bakgrunnen er ubetydelig i forhold til mottakelighet for HBV-infeksjon, og alle så langt testet hepatocyte givere er kjøpedyktig opprette HBV-infeksjon4.

Selv om pasient-avledede HBV oppretter infeksjoner i 3D kulturer, er det viktig å benytte PEG-igangsatte og sukrose pute-renset HBV når bruke induserbart HBV produsent cellen linjer for generering av viral inocula. Celle kultur supernatants direkte på 3D lever på-chip kulturer, enten gjennom tilstedeværelse hemmende faktorer eller inkompatibilitet stede vekst faktorer med hepatocytter, føre ikke lett til infeksjon. I tillegg når du velger pasient-avledede viral inocula, skal bare serum brukes, siden plasma uunngåelig coagulates og tresko microfluidic sirkulasjonen av kultur-plattformen.

Uansett det viral inoculum brukes, er sikre mobilnettet levedyktighet og differensiering, samt sikre fullstendig fjerning av den første HBV-inoculum, nøkkelen til vellykket langsiktig infeksjon studier. Den mest praktiske måten å gjøre dette prøvetaking kulturer etter fjerning av viral inoculum, i tillegg til å måle menneskelige albumin i serum nivåer i hele kultur perioden. Av notatet, på samme måte som alle andre beskrevet plattformer, HBV-infeksjon, når etablert, spres lett ikke til uninfected celler. Den underliggende mekanismen for dette forblir unnvikende siden HBV-infeksjon i vivo lett infiserer flertallet av hepatocytter i leveren.

I forhold til cocultures av PHH og Kupffer celler er det tilrådelig å utføre mange tester av Kupffer celler å evaluere IL6 og TNFα sekret Grunna LPS stimulering, siden ikke alle kommersielt tilgjengelig Kupffer giverne har en lik respons.

Viktigere, for alle medikamentelle behandlinger eller innledende infeksjon av kulturer med HBV, må det totale volumet av brønnen (1,4 mL), så vel som mikrovæskekanalen (0,2 mL), tas i betraktning for beregning av narkotika eller inoculum konsentrasjoner. For å sikre riktig dosering, utføres en vask trinn med medium som inneholder HBV eller narkotika for å prime på mikrovæskekanalen.

Plattformen brukes benytter 600.000 PHH per brønn, som sikrer flerlags hepatocytter innen stillasene. Selv om celle nummer kan varieres, sikrer valgt celle konsentrasjonen optimale resultater. Plate formatet har totalt 12 stillaser, som kan oppgraderes til 36 stillaser. Microfluidic krav er skalere opp til høyere godt tall imidlertid ikke mulig å date.

Bruker disse tilnærmingene, kan kulturer opprettholdes med optimal celle ytelse for minst 40 dager, som hittil, gir enestående muligheter til å evaluere romanen narkotika kandidater, i tillegg til å studere det komplekse samspillet mellom ulike hepatic celle bestander under HBV-infeksjon.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert ved et forrett stipend fra det europeiske Research Council (637304), en Wellcome Trust etterforsker Award (104771/Z/14/Z), og CN Bio innovasjoner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
William's E Medium, no phenol red GIBCO A12176-01
Hepatocyte Thaw Medium GIBCO CM7500
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements GIBCO CM3000
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements GIBCO CM4000
DMEM/F-12 GIBCO 11320-033
Advanced DMEM GIBCO 12491023
DPBS, no calcium, no magnesium GIBCO 14190-144
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x GIBCO 11140050
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) GIBCO 15140-122
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat Inactivated, sterile-filtered, suitable for cell culture SIGMA 12106C
Hydrocortisone SIGMA H0888
Trypan blue Merck T8154
Collagen from calf skin Merck C9791
G418 SIGMA G418-RO
Tetracycline SIGMA T3258
Polyethylene glycol 8000 SIGMA P2139
Sucrose SIGMA SO389
Sodium carbonate anhydrous SIGMA 451614-25G
Sodium bicarbonate SIGMA S5761
Sodium azide SIGMA S2002-5G
Sulfuric acid, 99.999% SIGMA 339741
4% Paraformaldehyde SIGMA 252549
Triton-X 100 SIGMA X100
Tween 20 SIGMA P1379
DAPI SIGMA D9564
Albumin (human) SIGMA A9731
Fisher BioReagent Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated Fisher Scientific BP9701-100
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen P36930
TaqMan Universal Master Mix II, no UNG Applied Biosystems 4440040
SYBR Select Master Mix Applied Biosystems 4472903
Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12 InvivoGen tlrl-eklps
Name Company Catalog Number Comments
Kits/Consumables
Sterile membrane CN Bio innovations LC-SC
LiverChip Perfusion cell culture plate CN Bio innovations LC12
LiverChip culture plate lid CN Bio innovations LC-SC
Sterile round filter paper CN Bio innovations LC-SC
Cell attachment scaffold CN Bio innovations LC-SC
Retaining ring CN Bio innovations LC-SC
Sterile plunger CN Bio innovations LC-ST
Dneasy blood & tissue kit Qiagen 69506
Rneasy mini kit Qiagen 74106
Human Magnetic Luminex assay R&D Systems
1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution ThermoFisher Scientific 34028
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit ThermoFisher Scientific 4368814
QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set Qiagen 1048147 Containing RNA carrier
Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile Millipore (Merck) PFHYS1008
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode Life technologies 4309849
MicroAmp Optical Adhesive Film Life technologies 4311971
Clear Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates ThermoFisher Scientific 442404
Sealing Tape for 96-Well Plates ThermoFisher Scientific 15036
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Bottle Top Filters with PES Membrane ThermoFisher Scientific 295-3345
Fisherbrand Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost Fisher Scientific FB58628
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 38.5 mL, 25 x 89 mm Beckman Coulter 344058
Name Company Catalog Number Comments
Primary cells / Cell lines
Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified Thermo Fisher Scientific HMCPTS
Cryopreserved Human Kupffer Cells Thermo Fisher Scientific HUKCCS
HepDE19 cell line Haitao Guo (Indiana University, IN, USA)
Name Company Catalog Number Comments
Primers/Probes/Standards
HBV DNA forward primer Invitrogen 5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'
HBV DNA reverse primer Invitrogen 5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'
HBV DNA probe Invitrogen 5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA
pgRNA forward primer Invitrogen 5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'
pgRNA reverse primer Invitrogen 5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'
RPS11 forward primer Invitrogen 5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'
RPS11 reverse primer Invitrogen 5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'
pCMV-HBV Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA)
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Anti-Hepatitis B virus core antigen IgG fraction (polyclonal) DAKO discontinued Lot 10102505
Human Albumin Antibody, A80-129A Bethyl Laboratories. inc A80-129A
Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P Bethyl Laboratories. inc A80-229P
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific # A-11072 Lot 1431810
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
LiverChip Vacuum pump CN Bio innovations LC-PN
LiverChip Pneumatic Hookup CN Bio innovations LC-PN
LiverChip platform CN Bio innovations LC-PN
LiverChip plate washing dock CN Bio innovations
Autoclavable metal forceps VWR 232-0106
Vortex Genie 2 Scientific industries SKU: SI-0236
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A95765
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge Thermo Scientific 75004500
SAM-12 Medical Suction High Vacuum High Flow MGE worldwide  SAM12/01010101
NUAIRE 5800 SERIES incubator NUAIRE NU-5841
Automated precision torgue CN Bio innovations
Manual torque CN Bio innovations
LiverChip compressor CN Bio innovations
Luminex LX-200 Instrument with xPONENT 3.1 Luminex
Millipore Hand-Held Magnetic Separator Block ThermoFisher Scientific Millipore™ 40-285
FluoStar Optima Plate Reader BMG Labtech
KOLVER Precision electric screwdrivers VTECH ltd FAB10RE/FR
KOLVER Power supply VTECH ltd EDU1FR
BAMBI VTS75D Air Equipment Discontinued
Integra Vacuboy INTEGRA
ViiA 7 Real-Time PCR System with 384-Well Block ThermoFisher Scientific 4453536

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verrier, E. R., Colpitts, C. C., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. F. Cell Culture Models for the Investigation of Hepatitis B and D Virus Infection. Viruses. 8 (9), (2016).
  2. Elaut, G., et al. Molecular mechanisms underlying the dedifferentiation process of isolated hepatocytes and their cultures. Current Drug Metabolism. 7 (6), 629-660 (2006).
  3. Konig, A., et al. Kinetics of the bile acid transporter and hepatitis B virus receptor Na+/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) in hepatocytes. Journal of Hepatology. 61 (4), 867-875 (2014).
  4. Ortega-Prieto, A. M., et al. 3D microfluidic liver cultures as a physiological preclinical tool for hepatitis B virus infection. Nature Communications. 9 (1), 682 (2018).
  5. Allweiss, L., Dandri, M. The Role of cccDNA in HBV Maintenance. Viruses. 9 (6), (2017).
  6. Guo, J. T., Guo, H. Metabolism and function of hepatitis B virus cccDNA: Implications for the development of cccDNA-targeting antiviral therapeutics. Antiviral Research. 122, 91-100 (2015).
  7. Lucifora, J., et al. Direct antiviral properties of TLR ligands against HBV replication in immune-competent hepatocytes. Scientific Reports. 8 (1), 5390 (2018).
  8. Hosel, M., et al. Hepatitis B Virus Activates Signal Transducer and Activator of Transcription 3 Supporting Hepatocyte Survival and Virus Replication. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (3), 339-363 (2017).
  9. Mazza, G., et al. Rapid production of human liver scaffolds for functional tissue engineering by high shear stress oscillation-decellularization. Scientific Reports. 7 (1), 5534 (2017).
  10. Hang, T. C., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G., Stolz, D. B. Lipids promote survival, proliferation, and maintenance of differentiation of rat liver sinusoidal endothelial cells in vitro. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 302 (3), G375-G388 (2012).
  11. Hwa, A. J., et al. Rat liver sinusoidal endothelial cells survive without exogenous VEGF in 3D perfused co-cultures with hepatocytes. The FASEB Journal. 21 (10), 2564-2579 (2007).
  12. Khetani, S. R., Bhatia, S. N. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology. 26 (1), 120-126 (2008).
  13. March, S., et al. Micropatterned coculture of primary human hepatocytes and supportive cells for the study of hepatotropic pathogens. Nature Protocols. 10 (12), 2027-2053 (2015).
  14. Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease. Scientific Reports. 6, 25187 (2016).
  15. Tong, W. H., et al. Constrained spheroids for prolonged hepatocyte culture. Biomaterials. 80, 106-120 (2016).
  16. Griffith, L. G., Wells, A., Stolz, D. B. Engineering liver. Hepatology. 60 (4), 1426-1434 (2014).
  17. Domansky, K., et al. Perfused multiwell plate for 3D liver tissue engineering. Lab Chip. 10 (1), 51-58 (2010).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 144 hepatitt B virus microfluidic enhet vev kultur orgel på-chip bioteknologi hepatocytter Kupffer celler
"Lever på-Chip" kulturer av primære hepatocytter og Kupffer celler for hepatitt B-smitte
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ortega-Prieto, A. M., Skelton, J.… More

Ortega-Prieto, A. M., Skelton, J. K., Cherry, C., Briones-Orta, M. A., Hateley, C. A., Dorner, M. "Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection. J. Vis. Exp. (144), e58333, doi:10.3791/58333 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter