Summary

सेलुलर तनाव का आकलन और असतत ऑक्सीटोसिन में सूजन-स्रावी मस्तिष्क नाभिक नवजात चूहे में पहले और बाद में पहली कोलोस्ट्रम खिला

Published: November 14, 2018
doi:

Summary

यहाँ, हम पहली कोलोस्ट्रम खिला के साथ संयोजन के रूप में नवजात चूहे मस्तिष्क में मस्तिष्क नाभिक को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद. इस तकनीक मस्तिष्क में पोषक तत्वों की कमी तनाव के अध्ययन के रूप में enterocyte संकेत द्वारा संग्राहक की अनुमति देता है ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य नवजात मस्तिष्क में ऑक्सीटोसिन रिसेप्टर रिच ब्रेन नाभिक को अलग करने से पहले और पहले कोलोस्ट्रम खिलाने के बाद है । चयापचय तनाव का जवाब करने के लिए जाना जाता प्रोटीन की अभिव्यक्ति मस्तिष्क में मापा गया था-नाभिक पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर अलग. यह आकलन करने के लिए किया गया था कि चयापचय तनाव प्रेरित शरीर में पोषक तत्व कमी न्यूरॉन तनाव ट्रिगर. हम पहले दिखा दिया है कि नवजात शिशुओं में पोषक तत्वों की कमी आंत में चयापचय तनाव में लाना । इसके अलावा, कोलोस्ट्रम ऑक्सीटोसिन सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया, सूजन, और autophagy मार्कर नवजात चूहे आंत में विल्ली से पहले और पहले फ़ीड के बाद संग्राहक । संकेत प्रोटीन मार्करों endoplasmic जालिका तनाव के साथ जुड़े [एर निगरानी बाध्यकारी immunoglobulin प्रोटीन (बिप), eukaryotic अनुवाद दीक्षा फैक्टर 2a (eIF2a), और eIF2a कळेनासे प्रोटीन कळेनासे आर (पी-PKR)], के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दो सूजन-संकेतन प्रोटीन [नाभिकीय कारक-κB (NF-kB) और अवरोध करनेवाला κB (IkB)], नवजात मस्तिष्क नाभिक में मापा गया [एकांत पथ के नाभिक (एनटीएस), paraventricular नाभिक (PVN), ऊपर अर्थ का उपसर्ग (बेटा) नाभिक, प्रांतस्था (CX), striatum नाभिक (STR), और औसत दर्जे का ऑप्टिक नाभिक (MPO)] पहले फ़ीड से पहले (कोलोस्ट्रम द्वारा प्रधानमंत्री) और नर्सिंग की शुरुआत के बाद (कोलोस्ट्रम द्वारा प्रधानमंत्री) । बिप/GRP78 और पी-eIF2a की अभिव्यक्ति प्रधानमंत्री एनटीएस ऊतक में और downregulated में अनियमित थे । nf-kb (उच्च) CX, STR, और MPO कोशिका द्रव्य में रखा गया था, जबकि nf-kb था कम और अपरिवर्तित में एनटीएस, PVN, और बेटा दोनों स्थितियों में । सामूहिक बिप और पी-eIF2 निष्कर्षों एक तनाव की प्रतिक्रिया के अनुरूप हैं । eIf2a पुत्र, CX, STR, और MPO में dsRNA आश्रित कळेनासे (पी-PKR) द्वारा phosphorylated था । हालांकि, एनटीएस में (और PVN में एक हद तक कम करने के लिए), eIf2a एक और कळेनासे, जनरल नियंत्रण nonderepressible-2 कळेनासे (GCN2) द्वारा phosphorylated था । तनाव संग्राहक पहले नवजात आंत enterocytes में मनाया तंत्र कुछ ओटीआर संपंन मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रतिबिंबित होना दिखाई देते हैं । एनटीएस और PVN अंय क्षेत्रों से (पोषक तत्वों की कमी के तहत) एक अलग फास्फारिलीकरण तंत्र का उपयोग कर सकते है और पोषक तत्वों की कमी के प्रभाव को दुर्दम्य । सामूहिक रूप से, इस डेटा पता चलता है कि पोषक तत्वों की कमी तनाव को मस्तिष्क प्रतिक्रियाओं कोलोस्ट्रम-प्रधानमंत्री enterocytes से संकेत द्वारा ऑफसेट हैं ।

Introduction

जल्दी मस्तिष्क दिनों के पाठ्यक्रम पर होने वाली विकास की हमारी समझ के विपरीत करने के लिए सप्ताह प्रसवोत्तर, अपेक्षाकृत कम गतिशील चूहों में जीवन के पहले घंटे में होने वाली परिवर्तन के असंख्य के बारे में जाना जाता है । एक प्रमुख चुनौती नवजात चूहे मस्तिष्क के छोटे आकार और उच्च तकनीक उपकरणों के लिए एक आवश्यकता असतत मस्तिष्क क्षेत्रों या एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया गया है । अध्ययन अक्सर जीन प्रतिलेखन का आकलन नहीं है और1,2अनुवाद नहीं है, जो सक्रिय संकेतन अणुओं के कार्यात्मक स्तर की एक फर्म समझ नहीं देता है । अंय अभिव्यक्ति की जांच immunohistochemistry का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क क्षेत्र है, जो अभिव्यक्ति3स्तर के ठहराव के लिए अनुमति नहीं है । तारीख करने के लिए कोई अध्ययन असतत मस्तिष्क क्षेत्रों में चूहों पहले कोलोस्ट्रम फ़ीड के साथ जुड़े संकेत रास्ते के सक्रियकरण की जांच की है, जो तेजी से अलगाव और बलिदान और प्रोटीन की अभिव्यक्ति और प्रोटीन की माप की आवश्यकता है फास्फारिलीकरण पश्चिमी का उपयोग सोख्ता. जबकि मस्तिष्क microdissection पुराने और बड़े दिमाग पर किया जाता है, हम एक P0 मस्तिष्क में एक गैर एकल सेल मस्तिष्क पंच प्रदर्शन एक संदर्भ की पहचान नहीं है । इस कागज नवजात मस्तिष्क के प्रतिबंधित क्षेत्रों को अलग एक अपेक्षाकृत कम तकनीक पंच तकनीक और एक पश्चिमी सोख्ता प्रक्रिया का उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत छोटे नमूनों में प्रोटीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है । यह प्रोटोकॉल अनुसंधान प्रश्नों के लिए उपयुक्त हो सकता है कि प्रोटीन की अभिव्यक्ति और बाद के मूल्यांकन की आवश्यकता होती है अनुवादात्मक संशोधनों (जैसे, फास्फारिलीकरण) किसी भी प्रजाति के छोटे दिमाग के अपेक्षाकृत प्रतिबंधित क्षेत्रों में, बशर्ते कि उपयोगकर्ता नेत्रहीन एक एटलस और पहचाने स्थलों के साथ ब्याज की मस्तिष्क क्षेत्र की पहचान कर सकते हैं ।

इस तकनीक को नवजात चूहों की पहली कोलोस्ट्रम फ़ीड, जो ऑक्सीटोसिन (OT) में समृद्ध है का एक परिणाम के रूप में मस्तिष्क में होने वाले परिवर्तन को समझने के लिए विकसित किया गया था । OT गया है लंबे समय से अपने दूध चलो-नीचे और गर्भाशय संकुचन को उत्तेजित करने की क्षमता के लिए जाना जाता है । हालांकि, अब ओटी कई शारीरिक कार्यों और व्यवहार4के विनियमन में भूमिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला खेलने के लिए जाना जाता है । उदाहरण के लिए, OT तनाव और अनुकूली affiliative व्यवहार5, देरी गैस्ट्रिक खाली करने के साथ संयोजन के रूप में सूजन का विरोध करता है, और आंत्र पारगमन धीमा कर देती है । ओटी रिसेप्टर्स (ओटीआर) दर्जी न्यूरॉन्स और आंतों उपकला में पहचान की गई है6,7,8. OT के गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल प्रभाव प्रारंभिक जन्मोत्तर अवधि के दौरान विशेष रूप से शिशु के लिए महत्वपूर्ण हैं । उदाहरण के लिए, स्तनपान नवजात पेट9,10के लिए ओटी की महत्वपूर्ण मात्रा के वितरण के साथ जुड़ा हुआ है, और डेटा शो है कि ओटीआर भारी ग्रहणी विल्ली में दूध पिलाती अवधि8के दौरान व्यक्त की जाती है ।

इन विट्रो प्रयोगों में एक आंत सेल लाइन का उपयोग सेलुलर स्तर है कि ऑक्सीटोसिन मार्ग11,12 सिग्नलिंग तनाव में महत्वपूर्ण अणुओं संग्राहक और प्रोटीन के अनुवाद में एक विनियामक भूमिका निभाता है पर प्रदर्शन किया है 12. इन अध्ययनों से सुझाव है कि दूध के अवयव, माता से exogenous ऑक्सीटोसिन सहित, नवजात शिशुओं में सामने आया प्रोटीन प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण है सेलुलर तनाव13कम ।

vivo में और ex vivo अध्ययनों से पता चला है कि कोलोस्ट्रम ओटी में सेलुलर तनाव की प्रतिक्रिया, सूजन, और नवजात चूहे आंत विल्ली में autophagy मार्कर ढा देती है । नवजात enterocytes उनके चमकदार पक्ष पर पर्याप्त सेलुलर तनाव पीड़ित जब आंत एक साथ कोलोस्ट्रम14में मां से microbiota को उजागर है,15 और ऐसे9 OT के रूप में हार्मोन सहित कई प्रोटीन, , 10 , 16.

मस्तिष्क पर ओटी के प्रभाव से17अध्ययन किए गए हैं । हालांकि, ओटी संकेतन तंत्र प्रारंभिक जन्मोत्तर अवधि के दौरान पेट में प्रदर्शित मस्तिष्क में अध्ययन नहीं किया गया है. इस पत्र में, नवजात चूहे brainstem और hypothalamus में असतत मस्तिष्क नाभिक अलग करने के लिए एक विधि ट्रो का उपयोग कर प्रोफ़ाइल अलग मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए प्रयोग किया जाता है । इस विधि के समग्र लक्ष्य को मस्तिष्क के क्षेत्रों में संकेत के रूप में जन्म के लिए संभव के रूप में बंद सेल की स्थिति पर कब्जा है, पहले और उसके बाद पहले दूध पिलाती, मस्तिष्क ऊतक में सबसे कम glial/ इस तकनीक के विकास के लिए तर्क है कि यह एक स्वचालित पश्चिमी सोख्ता का उपयोग कर पूर्व vivo अध्ययनों के लिए न्यूरॉन्स की एक अधिक समरूप संग्रह के साथ नवजात पिल्ले में प्रतिबंधित, सूक्ष्म मस्तिष्क क्षेत्रों के तेजी से अलगाव के लिए अनुमति देता है कार्यप्रणाली, अपेक्षाकृत छोटे विच्छेदित नमूनों पर अत्यधिक सुसंगत परिणाम प्रदान करना । पहले काम की कमी और अधिक सकल विच्छेदन (मस्तिष्क स्लाइसें या पूरे मस्तिष्क) और पुराने जानवरों18,19शामिल हैं । युवा पिल्ले के दिमाग अविश्वसनीय रूप से गतिशील हैं, जन्म के बाद glial भेदभाव की लहरों की विशेषता । आदेश में मस्तिष्क ‘ पिल्ले पहले खिला से प्रभावित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए, reproducible विच्छेदन के साथ प्रतिबंधित ंयूरॉन नाभिक अध्ययन आवश्यक है ।

दूध फ़ीड आमतौर पर अपने प्रतिरक्षा और स्वास्थ्य या जीन अभिव्यक्ति पर पोषण के प्रभाव के लिए विश्लेषण किया जाता है (उदाहरण के लिए, enterocytes20,21में), जबकि मस्तिष्क के विकास के दौरान मस्तिष्क के क्षेत्रों पर इसका प्रभाव शायद ही कभी अध्ययन किया जाता है । मस्तिष्क समारोह पर आंत में दूध पारगमन के प्रभाव आंत cholecystokinin रिसेप्टर्स वागल रिले करने के लिए संदर्भ में विश्लेषण किया गया था मस्तिष्क स्टेम नाभिक करने के लिए, लेकिन संकेतन रास्ते22intracellular करने के लिए नहीं. 23गर्भावस्था के दौरान माताओं के कुपोषण के लिए विकासशील neonate मस्तिष्क की भेद्यता पर एक विशाल साहित्य है, लेकिन तनाव और सूजन संकेतों को संबोधित नहीं कर रहे हैं । महत्वपूर्ण बात, वर्तमान विधि दिन में एक घटना का लाभ-शूंय चूहे नवजात शिशुओं कि आंत उत्तेजनाओं के वागल रिले से रक्त जनित कोलोस्ट्रम उत्तेजनाओं को अलग लेता है । यह तथाकथित तनाव hypo-जवाबदेही अवधि अपरिपक्व नाभिक tractus solitarius (एनटीएस) द्वारा विशेषता है-हाइपोथैलेमस सर्किट तुरंत जंम के बाद24,25 कि एनटीएस, paraventricular नाभिक (PVN) को प्रतिबंधित करता है, और supraoptic नाभिक (बेटा) रक्त जनित उत्तेजनाओं को संकेत ।

यह विधि कई संकेतन रास्ते के विश्लेषण के लिए उपयोगी है और अपेक्षाकृत ंयूरॉंस कोशिकाओं को प्रतिबंधित है, बशर्ते कि मस्तिष्क के ऊतकों जन्मोत्तर दिन में काटा जाता है-0 चूहों में, इसके अलावा कि माताओं को चुनौती दी गई है या नहीं उपचार के किसी भी प्रकार से गर्भावस्था के दौरान । कूड़े कोलोस्ट्रम फ़ीड के प्रभाव के लिए पूर्व बनाम सिग्नलिंग खिला का विश्लेषण किया जा सकता है । गरीब बनाम अमीर प्रोटीन उपज के साथ मस्तिष्क क्षेत्रों के बीच संकेतों की तुलना करते हैं, इस विधि में सक्षम बनाता है केशिकाओं में पॉलीपेप्टाइड बैंड के कुल प्रोटीन की केशिका दृढ़ संकल्प प्रोटीन एंटीजन के प्रतिरक्षा-quantitation के समानांतर चलाते हैं । इस विधि मात्रात्मक तुलना सक्षम बनाता है, मनमाना इकाइयों का उपयोग, मानक मात्रात्मक घटता के बिना एक ही एंटीबॉडी द्वारा प्राप्त परिणामों की और केशिका प्रति कुल प्रोटीन के संदर्भ में. विभिंन एंटीबॉडी द्वारा प्राप्त परिणामों की तुलना केवल मात्रात्मक मानक curves का उपयोग संभव है ।

इस विधि पेट और मस्तिष्क के बीच होने वाली द्वि-दिशा संकेतन के आकलन के लिए अनुमति दी और है कि दोनों अंगों में समारोह प्रभाव कर सकते हैं26. ऑक्सीटोसिन और भोजन के सेवन, जो बड़े पैमाने पर हाल के वर्षों में अध्ययन किया गया है के बीच संघ27, वृद्धि हुई ऑक्सीटोसिन संकेतन और पोषक तत्वों की उपलब्धता के बीच एक कड़ी का समर्थन करता है । इन अध्ययनों से भी बातचीत की अवधारणा का समर्थन है कि ऊर्जा घाटे हाइपोथैलेमस ऑक्सीटोसिन संकेतन में कटौती के साथ युग्मित कर रहे हैं ।

मस्तिष्क गतिविधि पर ओटी के प्रभाव के पहले अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि प्रेरित आंत सूजन हाइपोथैलेमस PVN, प्रमस्तिष्कखंड में cFos प्रतिलेखन, और piriform प्रांतस्था जो28दुर्दम्य को vagotomy गया था । हालांकि, secretin के साथ ओटी के प्रणालीगत अर्क मस्तिष्क28आंत में उत्तेजक भड़काऊ प्रतिक्रिया के लिए प्रतिक्रिया cFos की कमी हुई । यह सुझाव दिया कि exogenous OT के प्रभाव वागल रिले के अलावा अन्य मार्गों द्वारा किया गया था, संभवतः रक्त जनित संकेतन अणुओं के माध्यम से क्षेत्र postrema6,29के माध्यम से किए गए.

इस अध्ययन में, सेलुलर तनाव संकेत मार्ग है कि पहले पेट में मनाया है मस्तिष्क में मूल्यांकन किया गया । परिकल्पना की थी कि दूध घटकों की रक्षा या माइक्रोबियल और अंय चयापचयों को आंत पारगम्यता पर सूजन के प्रभाव को स्थगित कर सकते हैं, और बदले में, मस्तिष्क समारोह पर प्रभाव । IkB में स्पष्ट विरोधी मतभेद बनाम बिप विल्ली में पाया संकेतन, से पहले और13कोलोस्ट्रम द्वारा भड़काने के बाद, सुझाव दिया है कि नवजात शिशुओं के दिमाग, अभी भी विकसित करने की प्रक्रिया में, इन कोलोस्ट्रम-प्रेरित आंत संकेतों को समझ सकता है ।

संकेत प्रोटीन मार्करों पिछले आंत प्रयोगों कि endoplasmic जालिका तनाव के साथ जुड़े रहे हैं में इस्तेमाल मापा गया. वे एर निगरानी बिप, अनुवाद दीक्षा फैक्टर eIF2a शामिल है (जो एक तनाव प्रतिक्रिया30घालमेल के रूप में कार्य करता है), eIF2a कळेनासे पी-PKR, और दो सूजन संकेत प्रोटीन (NF-kB और उसके अवरोध करनेवाला, IkB) ।

छह मस्तिष्क क्षेत्रों वयस्कों में उनकी क्षमता के आधार पर गुप्त या ओटी के जवाब के लिए चुना गया । एनटीएस, ऊपरी मज्जा में स्थित है, आंत इनपुट की पहली रिले है और आंत31 में वागल संवेदी न्यूरॉन्स से प्रत्यक्ष संकेत मिलता है और संभवतः रक्त जनित साइटोकिंस, विषाक्त पदार्थों, और आसन्न क्षेत्र के माध्यम से हार्मोन-postrema३२. PVN, supraoptic नाभिक (बेटा), striatum नाभिक (एसटीआर), सेरेब्रल प्रांतस्था (CX), और औसत दर्जे का ऑप्टिक नाभिक (MPO) एनटीएस के माध्यम से आंत से संकेतन प्राप्त करते हैं ।

परिणाम से पता चला है कि तत्काल जन्मोत्तर अवधि के दौरान सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया कोलोस्ट्रम भड़काने से पहले और तुरंत बाद पहले खिला PVN और बेटे की तुलना में एनटीएस में अलग है । CX, STR, और MPO में संकेत PVN और बेटे की है कि से भिंन है, के रूप में अच्छी तरह से । कक्ष तनाव और आंत में सूजन मिलाना पहले दिखाया ओटी के विशिष्ट सुरक्षात्मक कार्यों की संभावना मस्तिष्क के कुछ क्षेत्रों द्वारा महसूस कर रहे हैं । सामूहिक रूप से, डेटा संकेत मिलता है कि सेलुलर स्तर पर, जंम के बाद पहले घंटे के दौरान, मस्तिष्क चयापचय पोषक तत्वों की कमी के साथ जुड़े तनाव का जवाब । डेटा भी पता चलता है कि हद और कोलोस्ट्रम फ़ीड के मॉडुलन प्रभाव की दिशा क्षेत्र पर निर्भर कर रहे हैं और कुछ क्षेत्रों में, वे पेट में पहले से दिखाया ओटी प्रभाव दर्पण.

Protocol

इस अध्ययन के संस्थागत पशु देखभाल और कोलंबिया विश्वविद्यालय और ंयूयॉर्क राज्य मनोरोग संस्थान में उपयोग समितियों द्वारा अनुमोदित किया गया था । 1. टिशू वडा आदेश विक्रेता से समय पर गर्भवती ?…

Representative Results

कुल प्रोटीन के सापेक्ष immunoreactivity के प्रतिनिधि बैंड बताते हैं कि बहुत कम काटा प्रोटीन के साथ मस्तिष्क नाभिक हैं । यह स्वचालित पश्चिमी दाग तकनीक है, जो विहित पश्चिमी दाग की तुलना में अति संवेदनश…

Discussion

नवजात चूहे के मस्तिष्क में असतत, ओटीआर युक्त मस्तिष्क नाभिक के microdissection के लिए एक तकनीक इस पत्र में प्रस्तुत की गई है. यह अच्छी तरह से पहचाना जाता है कि न्यूरॉन्स अत्यधिक विशिष्ट हैं, यहां तक कि मस्तिष्क मे?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

लेखकों ने इस प्रोटोकॉल को तैयार करने में उनकी सहायता के लिए Manon रेंजर और एलेक्जेंड्रा Schulz का धन्यवाद किया ।

Materials

Bradford solution Bio Rad
Protein lysis kit Protein simple CBS403 Bicine/CHAPS
WES kits Protein simple WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a Cell Signaling technology SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR Cell Signaling technology 2103
Rabbit anti-phospho-PKR Millipore Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR Cell Signaling technology 12297
rabbit mAb anti-GAPDH Cell Signaling technology 2118
mouse mAb anti-phospho-IKB Cell Signaling technology 9246
mouse mAb anti-IKB Cell Signaling technology 4814
rabbit anti-BiP Cell Signaling technology 3183
Rabbit anti GCN2 Cell Signaling technology 3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2 BIORBYT T899
pregnant Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories
Punch device WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50

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Klein, B. Y., Tamir, H., Anwar, M., Ludwig, R. J., Kaidbey, J. H., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding. J. Vis. Exp. (141), e58341, doi:10.3791/58341 (2018).

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