Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تقييم الإجهاد الخلوية والتهاب في نويات الدماغ إفراز الاوكسيتوسين المنفصلة في الفئران حديثي الولادة قبل وبعد التغذية اللبأ الأولى

Published: November 14, 2018 doi: 10.3791/58341
Automatic Translation
1, 1,2,3, 1, 1, 1, 4, 1,2
1Department of Psychiatry, Columbia University, 2Department of Pathology & Cell Biology, Columbia University Medical Center, 3Department of Psychiatry, Division of Molecular Imaging and Neuropathology, New York State Psychiatric Institute, 4EB Sciences

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لعزل نويات الدماغ في الدماغ الفئران حديثي الولادة بالاقتران مع تغذية اللبأ الأولى. يسمح هذا الأسلوب دراسة الإجهاد نقص المغذيات في الدماغ كما عن طريق إشارات enterocyte التضمين.

Abstract

والهدف من هذا البروتوكول عزل نويات الدماغ الغنية مستقبلات الاوكسيتوسين في الدماغ حديثي الولادة قبل وبعد التغذية اللبأ الأولى. وتم قياس التعبير عن البروتينات المعروفة للاستجابة للإجهاد الأيضي في يعزل نويات الدماغ باستخدام النشاف الغربية. وقد تم ذلك لتقييم ما إذا كان التمثيل الغذائي عدم كفاية المواد الغذائية الناجمة عن الإجهاد في الجسم تسبب الضغوط العصبية. قد أثبتنا سابقا أن نقص المغذيات في حديثي الولادة يتسبب الإجهاد الأيضي في القناة الهضمية. وعلاوة على ذلك، ينظم الاوكسيتوسين اللبأ علامات الإجهاد الخلوي استجابة والتهاب أوتوفاجي في الزوائد القناة الهضمية الفئران حديثي الولادة قبل وبعد تغذية الأولى. إشارات علامات البروتين المرتبطة بالإجهاد هيولى [ER وصي ملزم الغلوبولين المناعي البروتين (المقاضاة)، 2 ألف عامل الشروع في ترجمة حقيقية النواة (eIF2a)، و eIF2a كيناز البروتين كيناز R (ف-PKR)]، فضلا عن اثنين البروتينات [النووية عامل-κB (NF-kB) ومثبطات κB (إيكب)]، وقيست في نويات الدماغ الوليد يشير إلى التهاب [نواة المسالك الانفرادي (NTS)، نواة بارافينتريكولار (التشفيير)، ونواة البصرية أعلاه (الابن)، واللحاء (CX)، المخطط نوى (STR)، و نواة بريوبتيك الآنسي (الخطة الرئيسية للعمليات)] قبل تغذية الأولى (أونبريميد من اللبأ) وبعد بداية التمريض (أعدادا من اللبأ). كانت تعبيراً عن المقاضاة/GRP78 وف-eIF2a أوبريجولاتيد في أونبريميد ودوونريجولاتيد في معبي NTS الأنسجة. أبقى NF-كيلوبايت (عالية) في السيتوبلازم معادل، والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، والخطة الرئيسية للعمليات، بينما NF-كيلو بايت أقل ودون تغيير في NTS، التشفيير وابنه في كل الظروف. الهيئة الجماعية والنتائج eIF2 ف تتسق مع استجابة إجهاد. وكان فوسفوريلاتيد eIf2a دسرنا تعتمد كيناز (ف-PKR) في ابنه ومعادل، والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، والخطة الرئيسية للعمليات. ومع ذلك، في تي إس (وإلى حد أقل في التشفيير)، كان فوسفوريلاتيد eIf2a بآخر كيناز، كيناز نونديريبريسيبلي--2 الرقابة العامة (GCN2). آليات تحوير الإجهاد لوحظ سابقا في القناة الهضمية الوليد انتيروسيتيس يبدو أن تكون متطابقة في بعض مناطق المخ الغنية OTR. NTS والتشفيير قد تستخدم إليه الفسفرة مختلفة (تحت عوز المغذيات) من مناطق أخرى ويكون مقاوم لتأثير نقص المغذيات. مجتمعة، هذه البيانات تشير إلى أن استجابات الدماغ لنقص المغذيات الإجهاد تقابلها إشارات من انتيروسيتيس معبي اللبأ.

Introduction

وعلى النقيض من فهمنا لتطور الدماغ المبكر التي تحدث على مدى أيام إلى أسابيع بعد الولادة، يعرف سوى القليل نسبيا هو حول عدد كبير التغيرات الدينامية في الساعات الأولى من الحياة في الفئران. وقد يشكل تحديا رئيسيا صغر حجم الدماغ الفئران حديثي الولادة وشرط لأدوات التكنولوجيا العالية لعزل مناطق الدماغ منفصلة أو الخلايا المفردة. وكثيراً ما تقيم الدراسات الجينات النسخ والترجمة لا1،2، التي لا تعطي فهم راسخ للمستويات الوظيفية لتنشيط الجزيئات مما يشير إلى. آخرون دراسة التعبير باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري لمناطق الدماغ المرجعية، التي لا تسمح للتقدير الكمي ل مستويات التعبير3. أي دراسة لتاريخ درست تفعيل إشارات المسارات المرتبطة مع اللبأ أول الفئران آر في مناطق الدماغ منفصلة، الأمر الذي يتطلب العزلة السريع والتضحية وقياس التعبير البروتين والبروتين الفسفرة استخدام الغربية النشاف. بينما يتم تنفيذ ميكروديسيكشن الدماغ على أقدم وأكبر العقول، أننا لم نحدد إشارة أداء لكمه الدماغ غير وحيدة الخلية في دماغ P0. وتعرض هذه الورقة على بروتوكول لعزل المناطق المقيدة في الدماغ حديثي الولادة باستخدام تقنية لكمه منخفضة نسبيا والغربية النشاف الداخلي لقياس التعبير البروتين في عينات صغيرة نسبيا. هذا البروتوكول قد تكون مناسبة للأسئلة البحثية التي تتطلب تقييم التعبير البروتين وتعديلات بوستترانسلاشونال (مثلاً.، الفسفرة) في مناطق محدودة نسبيا من العقول الصغيرة من أي الأنواع، شريطة يمكن تحديد المستخدم بصريا منطقة الدماغ للفائدة مع أطلس ومعالم محددة.

تم تطوير هذه التقنية لفهم التغيرات التي تحدث في الدماغ نتيجة الأولى اللبأ الفئران حديثي الولادة آر، وهي غنية في الاوكسيتوسين (OT). أوراسكوم تليكوم معروفا منذ فترة طويلة لقدرته على حفز انكماش الحليب السماح لأسفل والرحم. ومع ذلك، بعد التمديد يعرف الآن بالقيام بمجموعة واسعة من الأدوار في تنظيم العديد من وظائف الجسم والسلوكيات4. على سبيل المثال، بعد التمديد تعارض الإجهاد والتهاب بالاقتران مع السلوكيات التكيفية أفيلياتيفي5ويؤخر إفراغ المعدة، ويبطئ العبور المعوي. قد حددت بعد التمديد مستقبلات (OTR) في الخلايا العصبية المعوية وظهاره الأمعاء6،،من78. آثار الجهاز الهضمي OT تكتسي أهمية خاصة للرضع خلال فترة ما بعد الولادة المبكرة. على سبيل المثال، الرضاعة الطبيعية يرتبط بتسليم كميات كبيرة من الأراضي المحتلة إلى القناة الهضمية المواليد9،10، وتظهر البيانات أن OTR هو أوفيريكسبريسيد بشدة في الزوائد الإثناعشرية خلال لبن الرضاعة فترة8.

وقد أثبتت تجارب في المختبر باستخدام خط خلية القناة الهضمية على المستوى الخلوي أن الاوكسيتوسين ينظم الجزيئات الهامة في الضغط مما يشير إلى مسار11،12 وتقوم بدور تنظيمي في ترجمة بروتينات 12-تشير هذه الدراسات إلى أن مكونات الحليب، بما في ذلك الاوكسيتوسين خارجية من الأم، ذات أهمية في الاستجابة البروتين تكشفت في حديثي الولادة للحد من الإجهاد الخلوي13.

وقد أظهرت الدراسات في فيفو و السابقين فيفو أن ينظم اللبأ بعد التمديد على علامات الإجهاد الخلوي استجابة والتهاب أوتوفاجي في الزوائد القناة الهضمية الفئران حديثي الولادة. انتيروسيتيس حديثي الولادة يعانون الإجهاد الخلوية كبيرة من جانبهم لومينال عندما يتعرض في نفس الوقت القناة الهضمية الحجمية من الأم في اللبأ14،15 والبروتينات العديدة، بما في ذلك الهرمونات مثل ت9 , 10 , 16.

وقد آثار بعد التمديد على الدماغ درس17. ومع ذلك، لم تدرس آليات إرسال الإشارات OT تظاهروا في الأمعاء خلال فترة ما بعد الولادة المبكرة في الدماغ. في هذه الورقة، استخدمت طريقة لعزل نويات الدماغ منفصلة في الدماغ الفئران حديثي الولادة وتحت المهاد استخدام التفريد تعريف المناطق المعزولة من المخ. والهدف العام لهذا الأسلوب لالتقاط حالة الخلية إشارات في مناطق الدماغ في أقرب وقت ممكن للولادة، قبل وبعد الحليب الأولى هي ترضع، في أنسجة المخ مع أدنى مؤشر الدبقية/العصبية. والأساس المنطقي لتطوير هذا الأسلوب أنه يتيح لعزل مناطق الدماغ مقيد، المجهرية في المواليد الجراء السريع مع مجموعة أكثر تجانساً من الخلايا العصبية السابقين فيفو الدراسات النشاف غربي الآلي باستخدام المنهجية، وتقديم نتائج متسقة عالية في عينات تشريح صغيرة نسبيا. قصور عمل مسبق يشمل المزيد من التشريح الإجمالي (شرائح المخ أو الدماغ كله) وكبار السن الحيوانات18،19. أدمغة الشباب الجراء الديناميكية بشكل لا يصدق، يتميز بموجات تمايز الدبقية بعد الولادة. من أجل دراسة تغيرات الدماغ تتأثر بتغذية الجراء الأولى، دراسة نويات الخلايا العصبية مقيد بتشريح استنساخه ضروري.

عادة يتم تحليل الأعلاف الحليب لأثره التغذوية والمناعية على الصحة أو مورثة تعبير (على سبيل المثال، في انتيروسيتيس،من2021)، بينما نادراً ما يتم دراسة تأثيره على مناطق الدماغ أثناء نمو الدماغ. وقد تم تحليل أثر العابر الحليب في الأمعاء على وظيفة المخ إشارة إلى ترحيل تحفيزه من سيكريتين من القناة الهضمية مستقبلات إلى نوى جذع الدماغ، لكن ليس إلى داخل الخلايا مما يشير إلى مسارات22. هناك مؤلفات واسعة على ضعف الدماغ الوليد إلى سوء تغذية الأمهات أثناء الحمل23، ولكن لم يتم التصدي لإشارات الإجهاد والتهاب. الأهم من ذلك، يأخذ الأسلوب الحالي ميزة ظاهرة في الأطفال حديثي الولادة الفئران يوم الصفر يعزل المحفزات اللبأ ولد الدم من ترحيل تحفيزه للمحفزات الحشوي. هذا هو فترة هيبو-استجابة الإجهاد ما يسمى تتميز بنواة غير ناضجة tractus solitarius (NTS)-دارة طائي فورا بعد الولادة24،25 يقيد NTS، نواة بارافينتريكولار (التشفيير)، و نواة سوبراوبتيك (الابن) إشارات إلى المنبهات ولد الدم.

هذه الطريقة مفيدة لتحليل مسارات إشارات متعددة ومقيد نسبيا للخلايا العصبية، شريطة أن يتم حصاد أنسجة المخ في 0 يوم الولادة في الفئران، بالإضافة إلى ما إذا كان قد طعن فيها الأمهات أو لا بأي نوع من العلاج أثناء فترة الحمل. يمكن تحليل ليتر لآثار اللبأ آر مقابل قبل تغذية الإشارات. عند مقارنة الإشارات بين مناطق الدماغ مع الفقراء مقابل الغلة البروتين الغنية، يتيح هذا الأسلوب في شعري تحديد مجموع البروتين من العصابات ببتيد في الشعيرات الدموية بموازاة كوانتيتيشن المناعية المستضدات البروتين. هذا الأسلوب يتيح المقارنة الكمية، استخدام وحدات التعسفي، من النتائج التي تحققت بالضد نفسه دون منحنيات كمية قياسية وإشارة إلى مجموع البروتين الشعرية. مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها من أجسام مختلفة من الممكن فقط استخدام المنحنيات القياسية الكمية.

يسمح هذا الأسلوب لتقييم الإشارات التي تحدث بين الأمعاء والدماغ، والتي يمكن أن يؤثر على وظيفة في كل الأجهزة26ثنائي الاتجاه. الرابطة بين المدخول الاوكسيتوسين والأغذية، التي درست على نطاق واسع في السنوات الأخيرة27، يدعم ارتباط بين مما يشير إلى زيادة الاوكسيتوسين وتوافر المغذيات. هذه الدراسات أيضا دعم مفهوم كونفيرس الطاقة هذا العجز تقترن بتخفيضات في إشارات الاوكسيتوسين طائي.

أظهرت دراسات سابقة من أثر بعد التمديد على نشاط الدماغ أن التهاب الأمعاء المستحث أثارت النسخ الماليين في القشرة طائي التشفيير واللوزة، والكمثرى وصهر لقطع المبهم28. مع ذلك، انخفض الجهازية ضخ OT مع سيكريتين استجابة الدماغ الماليين لاستفزاز رد فعل التهابات في القناة الهضمية28. هذا يشير إلى أن تأثير OT خارجية نفذه طرق خلاف مرحلات تحفيزه، ربما عن طريق جزيئات الإشارات المنقولة عن طريق الدم من خلال6،postrema المنطقة29.

في هذه الدراسة، تم تقييم مسارات الإجهاد الخلوية مما يشير إلى أنه قد لوحظ سابقا في القناة الهضمية في الدماغ. وكان الفرضية القائلة بأن مكونات الحليب قد حماية أو أرجاء تأثير الالتهاب على نفاذية الأمعاء إلى الايضات الميكروبية وغيرها، وفي المقابل، آثار على الدماغ الدالة. الاختلافات واضحة معادية في إيكب مقابل إشارات المقاضاة وجدت في الزوائد، قبل وبعد فتيلة من اللبأ13، اقترح أن العقل المدبر لحديثي الولادة، لا تزال عملية تطوير، قد معنى هذه الإشارات القناة الهضمية الناجمة عن اللبأ.

وقيست علامات البروتين إرسال الإشارات المستخدمة في التجارب السابقة في القناة الهضمية المرتبطة بالإجهاد هيولى. وهي تشمل وصي ER المقاضاة، eIF2a عامل بدء الترجمة (الذي يخدم integrator استجابة إجهاد30)، eIF2a كيناز فروبيه باكستانية، وهما البروتينات مما يشير إلى التهاب (NF-كيلو بايت وما المانع، إيكب).

وقد تم اختيار ست مناطق المخ استناداً إلى قدرتها في البالغين لإفراز أو الاستجابة إلى الأراضي المحتلة. NTS، يقع في لب العلوي، يتم ترحيل أول من المدخلات الحشوي ويستقبل إشارات مباشرة من الخلايا العصبية الحسية تحفيزه في القناة الهضمية31 وربما الدم ولد السيتوكينات والسموم، والهرمونات عبر postrema المنطقة المتاخمة32. التشفيير، نواة بريوبتيك الآنسي (الخطة الرئيسية للعمليات) وقشرة الدماغ (CX)، نواة سوبراوبتيك (الابن) والمخطط نوى (STR) تلقي إشارات من القناة الهضمية عن طريق تي إس.

وأظهرت النتائج أنه استجابة الإجهاد الخلوي خلال فترة ما بعد الولادة مباشرة قبل فتيلة اللبأ، ومباشرة بعد التغذية الأولى يختلف في NTS بالمقارنة مع التشفيير وابنه. إشارات في CX، تقارير عن المعاملات المشبوهة، والخطة الرئيسية للعمليات تختلف عن التشفيير وابنه، كذلك. يرجح أن هي لمست الوظائف الحمائية متميزة للتمديد هو موضح سابقا تعدل خلية الإجهاد والتهاب في القناة الهضمية ببعض المناطق في الدماغ. جماعياً، وتشير البيانات إلى أنه على المستوى الخلوي، خلال الساعات الأولى بعد الولادة، والدماغ يستجيب للإجهاد الأيضية المرتبطة بنقص العناصر الغذائية. وتظهر البيانات أيضا أن مدى واتجاه آثار تحوير اللبأ آر لا تعتمد على المنطقة وأنها مرآة في بعض المناطق، وآثار بعد التمديد هو موضح سابقا في القناة الهضمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أقر هذه الدراسة برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجان في جامعة كولومبيا ومعهد الطب النفسي الدولة نيويورك.

1-إعداد الأنسجة

  1. ترتيب توقيت الفئران الحوامل من المورد.
  2. اتبع الفئران الحوامل موقوت بمراقبة على البطن المتزايد في الأسابيع بعد وصولهم وبعد ذلك تبحث عن الجراء على تاريخ التسليم المتوقع بتفتيش القفص كل ح 2 حتى يبدأ التسليم.
  3. إزالة الجراء مع جهة القفاز بذيلها قبل إطعام الأولى الجراء أونبريميد (لا بطن الحليب الأبيض الظاهر عند عرض البطن) أو بعد الموجز الأول للحصول على الجراء معبي (عند هذه النقطة بيضاء في المعدة سوف تكون مرئية على البطن) كما هو موضح في تيميلي ني (S1 الشكل).
    ملاحظة: يسمى تغذية اللبأ أول فتيلة ألجرو؛ وهكذا، جرو أونبريميد حتى الأعلاف الأولى، بعد ذلك فتجهز اللبأ.
  4. بسرعة قطع رأس ألجرو أونانيسثيتيزيد استخدام مقص حاد، والعمليات الجراحية نظيفة.
  5. إزالة الدماغ بقطع الجلد أسفل خط الوسط والسطح العلوي من الجمجمة إلى الآنف. ثم، باستخدام الملقط، لطف نقب بعيداً العظام لكشف الدماغ (الشكل 1A) وترجمة بريجما، وضع علامة عليه بواسطة قلم كما تتم إزالة لوحات العظام (الشكل 1B).
  6. سرعة وضع الدماغ كله في بولي ميثاكريلات الدماغ العفن في درجة حرارة الغرفة كورونال تشريح في درجة حرارة الغرفة (الشكل 1).
  7. دون تأخير، جعل 500 مم سميكة الشرائح باستخدام شفرة حلاقة جديدة. وضع الشرائح روسترال إلى والذيلية في طبق بتري للحفاظ على التوجه لأقسام (الشكل 2).
  8. إضافة السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام؛ 1.0 مم خ2ص4، 26 مم NaHCO3مم 118.6 كلوريد الصوديوم، 3.0 ملم بوكل، مم 203.3 مجكل2-6 ح2س) دون الجلوكوز بسرعة واحتضان الشرائح لمدة 60 دقيقة في 28-30 درجة مئوية، مع التحريك باستمرار على شاكر مداري أيضي وخلطات الطعن في أونبريميد مقابل معبي اللبأ الأنسجة.
  9. تحديد نويات الدماغ المطلوبة للكمه استخدام أطلس الدماغ33 والمعالم التشريحية على قسم الأنسجة. ضع هذه الشريحة مع الأنوية للفائدة في طبق بتري ونقله إلى مجهر تشريح.
  10. مجرد تصور، بسرعة لكمه من أصل 4 من 6 أنوية مختلفة باستخدام أداة المستخدمة، وتحديد حجم أفضل لكمه النواة في السؤال ودائما بين العينات (الشكل 2).
    ملاحظة: سيكون شريحة الدماغ المتبقية الآن إلى ثقب حيث تمت إزالة أنسجة المخ. في هذه الدراسة، ونحن اقتطعت الأنوية التالية استخدام دون الإحداثيات. جميع الأمامي/الخلفي (A/P) تكون الإحداثيات من بريجما (باستثناء NTS، والإشارة إلى سكريبتوريوس القصب الهندي). جميع الإحداثيات (D/V) الظهرية/البطني من سطح القشرة (باستثناء NTS، الذي من على سطح الأرض للب). تتضمن الإحداثيات التالية A/ف والانسي/الجانبي (M/L) د/V في مم: 1) نواة المسالك الانفرادي (NTS، A/P، 0.4 إلى 0.8؛ L، ± 0.2؛ D/V، 0.3 (من على سطح الأرض للب)، 2) نواة بارافينتريكولار (التشفيير،-0.8؛ ± 0.2؛ 0)، 3) نواة البصرية أعلاه (الابن،-1.1؛ ± 1.4؛ 4.3)، 4) اللحاء (CX، منطقة اللحاء الجزئية 1،-2.8; ± 1.5؛ 0.6)، 5) نويات المخطط (STR,-0.0; ± 1.6؛ 1.8)، و 6) بريوبتيك الآنسي نواة (الخطة الرئيسية للعمليات،-0.6؛ ± 0.2؛ 4.2).
  11. سرعة تزج الأنوية لكمات في 0.06 مل من البروتين المثلج، استخراج العازلة التي تحتوي على مثبطات البروتياز ومثبطات الفوسفاتيز لمدة 60 دقيقة (راجع الخطوة 2، 3).

2. استخراج البروتين

  1. إعداد الحل استخراج البروتين باستخدام طقم تحلل البروتين (جدول المواد) في اليوم قبل الولادة المتوقعة ألجرو.
  2. ذوبان الجليد (على الجليد) حل مثبطات البروتياز والفوسفاتيز مجموعة المخزن المؤقت تحلل مائي المجمدة (-20 درجة مئوية) ووضع المخزن المؤقت لتحلل وحل [دمس] من مثبطات البروتياز/فوسفاتاسيس على الجليد.
  3. إضافة مل 1.85 من المخزن المؤقت لتحلل في أنبوب نظيف والمثلج 15 مل. ثم إضافة 0.1 مل من محلول مائي من مثبطات و 0.05 مل من مثبطات حله [دمس]. وأخيراً، كاب ودوامه الأنبوب بإيجاز وإبقائه في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. قم بتسمية أنابيب ميكروسينتريفوجي نظيفة 24 (0.5 مل في كل) للإجراء تحلل. أنابيب 12 المعين في الدماغ للفريق أونبريميد اللبأ (U) [اليسار 6 (L) و 6 أنوية المخ (ص) الحق]، والتسمية وفقا لاختصار النوى، الجانب، وشرط (على سبيل المثال. تي إس-L يو، تي إس-آر يو، إلخ). قم بتسمية المجموعة الثانية من أنابيب 12 للعينات التي تجهز اللبأ.
  5. قم بتسمية مجموعتين إضافيتين من الأنابيب كما فعلت في الخطوة 2، 4 لمستخلصات البروتين المخزون (باستخدام أنابيب 1.5 مل ايبندورف الطراز) والمجموعة الأولى من إعداد نموذج (باستخدام أنابيب 0.5 مل). تبقى هذه الأنابيب في اثنين مربعات تجميد منفصلة، والمسمى (كل منها مصمم لأنابيب 100). سيتم استخدام مربع واحد للعينات أونبريميد والآخر لعينات معبي.
  6. ذوبان الجليد الحل تحلل على الجليد في اليوم الذي يتم تسليم الجراء، وحين تفرخ شرائح المخ في قام، الكوة مل 0.06 تحلل الحل في إجراء تحلل أنابيب (من الخطوة 2، 4) وإضافة نويات اللكمات واحتضانها في الجليد لمدة 60 دقيقة.
  7. الطرد المركزي نواة ليسيد المحتضنة لمدة 30 دقيقة في أجهزة الطرد مركزي المصغر تبريد عند 14000 دورة بالدقيقة (10,000 س ز) وعناية نضح مل 0.055 من المادة طافية مع ماصة تعيين بشكل صحيح. نقل المادة طافية في أنابيب يبرد قبل 1.5 مل الأسهم (من الخطوة 2، 5) ووضعها على الجليد. قبل التجميد (في-20 درجة مئوية) أنابيب مخزون البروتين ونقل 0.012 مل من المادة طافية في أنابيب يبرد قبل 0.5 مل لإعداد نموذج أولى (من الخطوة 2، 5) وتركها على الجليد.

3-نموذج إعداد لقياس البروتين في شعري

  1. استخدام أدوات وإعداد الكواشف لفصل وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. إضافة 0.003 مل كاشف مزيج الرئيسي لكل من العينات 12 مل 0.5 المسمى أنابيب (من الخطوة 2، 5) على الجليد التي تحتوي على مل 0.012 من مستخلصات البروتين.
  2. قم بتشغيل كتلة التدفئة إلى 95 درجة مئوية وإضافة 0.004 مل الكاشف إعدادها في الخطوة 3، 1 إلى سلم بيوتينيلاتيد وزن جزيئي (ميغاواط) في أنبوب مع مل 0.016 من المياه. أن تؤذي بسلم وعينات ووضع الأنبوب سلم والعينات 12 من مستخلصات البروتين أونبريميد في كتلة الحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  3. كرر الخطوات 2.0 إلى 3.2، من استخراج البروتين لإعداد عينة، الأنوية لكمات من الفئران معبي اللبأ.

4-التفريد إعداد

  1. ذوبان الجليد البيوتين وسم كاشف (المخزنة في التجميد العميق في-80 سج) على مقاعد البدلاء وإعداد أدوات الكشف عن البروتين على الجليد في 4 درجات مئوية اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  2. مزيج 0.15 مل لومينول مع 0.15 مل بيروكسيد وتحميل مل 0.01 إلى 25 بئرا (صف ه، الآبار 1-25) من لوحة للإله الغربية الآلي. تحميل مل 0.008 من ستريبتافيدين-برنامج الصحة الإنجابية من عدة آبار D1 إلى D25
  3. تحميل 0.01 مل الحل مادة جسم في الآبار C1 إلى ج 25 و B1.
  4. تدور 24 بروتين العينات وسلم أنابيب بإيجاز (2-3 ثوان) في مينيسينتريفوجي إلى تجمع أسفل المياه المتبخرة من قبعات الأنبوبة.
  5. تحميل مل 0.003 من عينات أونبريميد 12 بئرا A2 A13 ومل 0.003 من عينات 12 معبي اللبأ في آبار A14 إلى A25 ومل 0.005 في سلم بيوتينيلاتيد إلى A1 جيدا.
  6. اترك صف و فارغة وتحميل مل 0.45 من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في كل من المقصورات 5 في كل من 3 صفوف أسفل الصف واو غطاء اللوحة مع لها غطاء بلاستيكي لتجنب التبخر أثناء الإجراءات المتبقية.
  7. باختصار دوامة البيوتين المذابة وسم الكاشف وإضافة 0.15 مل الكاشف أنبوب المعينة؛ ثم إضافة إلى ذلك 0.15 مل عامل إعادة تشكيل البروتين الكلي ومزجها بالتجانس.
  8. إزالة الغطاء من اللوحة وتحميل مل 0.01 من وكلاء 1 و 2 في الآبار B2 إلى B25. تغطية اللوحة والطرد المركزي أنه لمدة 10 دقيقة في 1,000 ز x لإزالة أي فقاعات الهواء من الحلول المختلفة. استخدام صفيحة فارغة في أجهزة الطرد المركزي للتوازن.

5-التفريد

  1. بينما هو الغزل اللوحة، فتح ملف تشغيل في الكمبيوتر المرفقة بالجهاز الآلي الغربية بالإشارة في صفحة قائمة منسدلة من "ملف" لتشغيل مقايسة بروتين الكلي والنقر فوق بقعة منها.
  2. إضافة تعليق توضيحي العينات بشكل جيد في الكمبيوتر. ثم إزالة اللوحة من أجهزة الطرد المركزي إزالة الغطاء وتقشر بعناية الغطاء الألومنيوم من المقصورات الحل الانفصال.
  3. ضع اللوحة في الصك الغربية الآلي وتقشر الغطاء من مربع خرطوشة الشعرية وإدراج الخرطوشة في مكانها المعين وإغلاق الباب.
  4. انقر فوق الزر "تشغيل"، وعند مطالبتك بذلك بنوع من التحليل ("مجموع البروتين")، اكتب اسم العينات (على سبيل المثال، "أونبريميد 2-13 وتجهز اللبأ 14-25"). انقر فوق "موافق"، وعند مطالبتك بواسطة تاريخ تشغيل المنشط ورقم معرف لتشغيل الملف، قم بتدوين الوقت عندما ينتهي التشغيل.
  5. في نهاية التشغيل (170 دقيقة بعد البدء)، فتح الباب الصك وإزالة خرطوشة الشعرية وتخلص منه إلى التخلص من الأدوات الحادة. تجاهل اللوحة في التصرف في هذه المسألة البيولوجية.
  6. انقر فوق رمز الانفصال المنحنيات في صفحة تحليل ملف التشغيل، والتحقق من أن جميع العينات قد تعمل بشكل صحيح، ويتم عرض متعددة البروتين المنحنيات في جميع الشعيرات الدموية.

6-تحليل الإشارات البروتينات

  1. في أنبوب مسمى 1.5 مل، أضف 0.003 مل لأرنب المضادة للأجسام المضادة والرمات-eIF2a (ف-eIF2a) وتعليق في 0.3 مل (تخفيف 1: 100) في جسم مادة من أدوات الكشف المناسبة. ثم إبقائه على الجليد.
  2. تسمية أنبوب لومينول وإضافة 0.15 مل من لومينول و 0.15 مل من بيروكسيد من هذه المجموعة الوحدة النمطية لكشف والاستغناء عن 0.01 مل إلى الآبار E1 إلى E25 صفيحة الغربية طازجة وتلقائية.
  3. الاستغناء عن 0.01 مل الثانوي المضادة لجسم الأرنب في آبار D2 إلى D25، وإضافة 0.01 مل من ستريبتافيدين-برنامج الصحة الإنجابية من الطقم إلى D1 جيدا.
  4. الاستغناء عن 0.01 مل جسم الأولية (من الخطوة 6، 1) في آبار C2 إلى ج 25، وإضافة 0.01 مل من محلول 2 مادة جسم إلى الآبار C1 و B1 إلى B25.
  5. ترك الآبار و صف فارغ وتعبئة مل 0.45 من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في المقصورات 5 من 3 صفوف أسفل الصف و.
  6. باختصار تدور العينات مبردة 3 s، وإضافة مل 0.003 من كل عينة إلى صف أ بنفس الترتيب الذي تم إضافتهم مقايسة البروتين الكلي، بدءاً من A2 إلى A25. إضافة مل 0.005 في سلم ميغاواط بيوتينيلاتيد جيدا A1 وتغطية اللوحة.
  7. الطرد المركزي في اللوحة كما فعلت في الخطوة 4، 8. بينما هو الغزل اللوحة، فتح ملف تشغيل جديد (في البرامج المرتبطة بالغربية الآلية والكمبيوتر) وتشير في صفحة قائمة منسدلة من "ملف" لتشغيل مقايسة حجم جزيئي بواسطة النقر فوق بقعة منها.
  8. في الصفحة المقايسة، اكتب أسماء العينة في كل شعري، ثم اكتب اسم جسم الأولية في المكان المخصص وجسم الأرنب المضادة الثانوي أقل من ذلك.
  9. في نهاية للطرد المركزي، كرر الخطوات 5، 3 – 5.5، إلا ينبغي أن يكون الاسم المعطى لتشغيل الملف هذه المرة "ف-eIF2a أونبريميد 2 – 13 وتجهز اللبأ 14 – 25".
  10. بعد فصل التفريد، التدقيق في ملف التشغيل لقمم مفاعليه المناعية المستضدات في أحجام كاتشين 40 – 43. حيث ميغاواط قمم هذه المساحة مفقودة، انقر بالزر الأيمن أسفل المنحنى وتشير إلى داخل القائمة المنسدلة إضافة ميغاواط إلى الذروة، مما يضمن أن يتم تسجيل حجم وكمية التعسفي أسفل المنحنى.

7-معالجة النتائج

  1. تشغيل ملف فتح تشغيل ملف جدول بيانات للبروتين الكلي في الغربية الآلي وتوفير رقم معرف.
  2. فتح ملف التشغيل مقايسة البروتين الكلي في صفحة التحليل في وضع منحنى ووضع علامة على كل قمم في الشعيرات الدموية الفردية. ثم نسخها ولصقها في جدول البيانات ومجموع المناطق الواقعة تحت المنحنى من جميع الذروة المسجلة في شعري كامل.
  3. في عمود منفصل، ترتيب المبلغ الإجمالي للبروتين لكل عمود مع الأرقام الشعرية، أسماء نوى الدماغ كل منهما، وأرقام معرف من ملفات التشغيل.
  4. فتح جدول بيانات مستضد eIF2a ف، وفي عمود مفرد، وسجل المنطقة تحت المنحنى من كل الشعرية جنبا بجنب مع كل منها عدد الشعيرات الدموية، اسم نواة المخ، ورقم معرف ملف التشغيل.
  5. نسخ العمود مجموع البروتين (الموازية لكميات منحنى ف-eIF2a) في جدول ثالث وحساب فنسب البروتين eIF2a:total في عمود ثالث.
  6. تجميع النتائج من الخطوات من 4 إلى 6 لكل نواة الدماغ وترتيبها في مجموعات من النوى، وإنشاء رسم بياني شريطي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عصابات إيمونوريكتيفيتي بالنسبة إلى مجموع البروتين الممثل تظهر أن هناك نويات الدماغ مع البروتين المقطوع منخفضة جداً. وهذا يتطلب استخدام هذا الأسلوب الآلي لطخة غربية، وحساسة للغاية مقارنة بوصمة عار الغربية المتعارف عليه. يمكن تشغيل هذا النهج مع فورتيفولد البروتين أقل للشعرية مقارنة بكل حارة في البقع الغربية.

الآثار التفاضلية فتيلة اللبأ على مستويات المقاضاة في نويات الدماغ

كانت تحصد المقاطع الاكليلية من أدمغة الفئران قبل اللبأ أول التغذية (أونبريميد) وبعد الرضاعة الأولى (معبي). كان مجزأ نماذج بالتفريد الشعرية (بشأن المياه والتصحاح البيئي)، وكانت كمية البروتينات استخدام عدة لتلطيخ البروتين الكلي في شعري (انظر البروتوكول). قدم إضافية تجزئة الشعرية محصنة في الغربية الآلي تحديد المستضدات البروتين كل منهما. في الشكل 3 ألف، يظهر التعبير البروتين الهيئة التمثيلية في اللوحة العلوية، مع البروتين المجموع المطابق هو موضح أدناه. من المقاضاة بروتين وصي ER. في الشكل 3 (ب)، التي قدمها إيممونوريكتيفيتيس كوانتيتاتيد شريط الرسوم البيانية المتعلقة بالبروتين الكامل المطابق.

داخل عينات الأنسجة أونبريميد، مستويات المقاضاة في NTS كانت إلى حد كبير أعلى بالمقارنة مع جميع المناطق الأخرى (p < 0.05، n = 4 نوى). فتيلة لانسجة القناة الهضمية مع اللبأ أثر معاكس في NTS، بالمقارنة مع زيادة المقاضاة في مناطق أخرى، بالنسبة للأنسجة أونبريميد (الشكل 3B). فتيلة انخفض المقاضاة في NTS (الشكل 3B) ولم يؤثر على التشفيير وسبت. ومع ذلك، زادت فتيلة المقاضاة في معادل، والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، والخطة الرئيسية للعمليات بالنسبة للأنسجة أونبريميد. هذه البيانات يعني أن مستويات المقاضاة في نويات الدماغ اختبار مختلف يستجيب بشكل مختلف فتيلة القناة الهضمية والتي هناك لم تبين أي عبر الحديث بين الأنوية المختلفة اختبار.

الآثار التفاضلية فتيلة اللبأ على مستويات ElF2a و elF2a ف في نويات الدماغ

وأعدت عينات أنسجة المخ، وتحليلها، وكمياً كما هو موضح في الشكل 3 ألف و 3 باء. كما مع مستويات المقاضاة (الشكل 3B)، elF2a و elF2a ف مستويات في NTS كانت مرتفعة في حالة أونبريميد بالنسبة إلى الأنوية الأخرى (الشكل 4 باء و جيم 4). كما أظهر مع مستويات المقاضاة، كانت الاستجابة في NTS إلى فتيلة لانسجة القناة الهضمية مع اللبأ معاكس في نويات أخرى. تم تخفيض مستويات elF2a و elF2a ف في NTS بالنسبة للأنسجة أونبريميد. في جميع الأنوية الأخرى المختبرة، فتيلة زيادة مستويات في elF2a و elF2a ف بالنسبة للأنسجة أونبريميد (الشكل 4 باء و جيم 4).

الفسفرة elF2a حسب كيناز GCN2 في NTS والتشفيير بعد فتيلة اللبأ

وأعدت عينات أنسجة المخ، وتحليلها، وكمياً كما هو مبين في الشكل 3. فتيلة ف روبية باكستانية المتوفى في التشفيير (χ2 ف = 0.025)، خلافا في جميع المناطق الأخرى حيث أنه زاد. خلافا elF2a ف المستويات النتائج (الشكل 4)، من فروبيه باكستانية كانت منخفضة في عينات أونبريميد بالنسبة إلى عينات معبي في NTS (الشكل 5A). الفسفرة elF2a هو عادة حفزت على كيناز روبية باكستانية ردا على فيروسات34 ، وبعد التمديد في القناة الهضمية، كما تبين سابقا11. ومع ذلك، تقترح حقيقة أن مستويات فروبيه باكستانية كانت منخفضة للغاية في أونبريميد مقابل NTS معبي (بالنسبة إلى سائر النوى، الشكل 5A) بشدة أن كيناز أخرى يجب أن تشارك في فوسفوريلاتينج elF2a (الشكل 4). تبعاً لذلك، تم اختبار مستويات GCN2 في NTS والرمز لأنها أيضا كيناز معروفة elF2a35. مستوى ف-GCN2 (النموذج النشط) كانت أعلى في عينات أونبريميد مقارنة بعينات معبي في NTS والتشفيير (الشكل 5 (ب))، و GCN2 (النموذج غير نشط)، بالمقارنة مع ف-GCN2، وأعرب عكسيا في التشفيير (الشكل 5). وأعرب pGCN2 في NTS (الشكل 5) عكسيا على بكر (الشكل 5A) في NTS أونبريميد ومعبي على حد سواء. في الأنسجة معبي، ف-eIF2a كان أقل بكثير في NTS من كافة المناطق الأخرى في المخ [التشفيير (ف < 0.01) والابن (ف < 0.01)، CX (ف < 0.01)، والخطة الرئيسية للعمليات (p = 0.02)]. يشير هذا إلى أن pGCN2 وليس بكر، كانت مسؤولة عن تثبيط eIF2 في NTS.

فتيلة اللبأ يمنع NF-كيلو بايت في معادل، والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، والخطة الرئيسية للعمليات

يظهر الشكل 6A أن IkB المستويات كانت أعلى بكثير في ابن أونبريميد عينات عينات مقابل جاهزة. مستويات إيكب في الخطة الرئيسية للعمليات والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، ابن ومعادل اتجاها أعلى في نفس الاتجاه. في الشكل 6، كانت أعلى بكثير في مستويات NF-كيلو بايت في معادل، والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، والخطة الرئيسية للعمليات معبي مقابل أونبريميد الأنسجة. ومع ذلك، كانت مستويات NF-كيلو بايت أقل بكثير معبي NTS الأنسجة، مما يوحي بأن اللبأ أثرا للالتهابات متميزة في هذه المنطقة من الدماغ. NF سيتوسوليك-كيلو بايت كان عينات تي إس أونبريميد (المحتجزة) في أعلى، في حين كانت لها المانع IkB منخفضة ودون تغيير في عينات معبي. وهذا يوحي بأن إليه متميزة للالتهابات هو تنظيم NF-كيلو بايت في NTS. أثر الإجهاد نقص المغذيات هذا يتسق مع النتائج الحالية التي تشدد على علامات المقاضاة ف-eIF2a على حد سواء وينظم ووجود فتيلة اللبأ (الشكلان 3 و 4، على التوالي)، كما هو موضح في السابق المقاضاة وف-elF2a 10من النتائج التي توصل إليها. والسبب في استجابة متميزة إيكب ونف كيلوبايت في NTS بالمقارنة مع معادل، والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، والخطة الرئيسية للعمليات لا بعد تماما المفهوم. ومع ذلك، أنها تتفق مع ملاحظة أن تي إس، والتبديلات إشارات من الأمعاء إلى المخ، قد تلعب دوراً حاسما في الاستجابة بشكل فريد ومعاكس مقابل مناطق الدماغ الأخرى مقارنة بالتهاب الطرفية36. وكانت مستويات إيكب في معادل، والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، والخطة الرئيسية للعمليات المنخفضة (الشكل 6A)، مقارنة بمستويات عالية من NF-كيلو بايت في نفس المناطق (الشكل 6). وبينما هذا الاستنتاج يبدو أنه يتناقض مع فرضية أن إيكب هو ملزم والاحتفاظ NFkB في سيتوسول، حساب مختلفة من البيانات التي يجمع ويقارن معبي جميع العينات في معادل، والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، والخطة الرئيسية للعمليات يظهر تحليل الانحدار باستخدام ذلك NF-ك. بايت عالية يرتبط مع إيكب (ف < 0.0001، n = 24)

Figure 1
رقم 1: تشريح الدماغ الفئران حديثي الولادة- (أ) تشريح الدماغ ويرد مع إزالة العظام روسترال إلى بريجما. (ب) الدماغ ويرد بعد أن تم وضع خط في بريجما، بعد التي أزيلت لوحات العظام المتبقية. (ج) يرد الدماغ في بولي ميثاكريلات الدماغ العفن قبل يجري شرائح مع شفرة حلاقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الدماغ شرائح مرتبة من روسترال إلى والذيلية مع اللكمات (دوائر حمراء)- المختصرات: CX: اللحاء، والفص الجداري؛ الخطة الرئيسية للعمليات: منطقة بريوبتيك الآنسي؛ NTS: نواة tractus سوليتاريس؛ التشفيير: نواة بارافينتريكولار؛ الابن: سوبراوبتيك نواة؛ والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة: المخطط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: هو مقلوب استجابة المقاضاة/GRP78 في NTS إلى نويات أخرى. (أ) التعبير البروتين المقاضاة الممثل في اللوحة العلوية بالنسبة إلى مجموع البروتين المعروضة في لوحة أدناه. علما أن كثافة البروتين الكلي في الشعيرات الدموية المختلفة غير المتجانسة، وتستخدم هذه لتحقيق التكافؤ في التعبير المقاضاة كل منهما كل البروتين في لوحة (ب) (ب) الموضح هو المقاضاة يعني بالنسبة إلى مجموع البروتين في نويات الدماغ (عينات أونبريميد الأزرق) مقابل عينات معبي اللبأ (براون). تعيين العلامات نجمية ألوان كل منها اختلافات كبيرة (ف < 0.05، n = 4 أنوية) بين المقاضاة في NTS مقابل المقاضاة في الأنوية الأخرى. التعبير المقاضاة في أونبريميد مقلوب إلى حد كبير لتلك التي في شارع مقابل عينات معبي في NTS (χ2 ف = بين 0.028، n = 4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: eIF2a النشطة وغير النشطة (ف-eIF2a) واستجابة فتيلة اللبأ مقابل أونبريميد عينات في NTS مقلوب إلى نويات أخرى. (أ) ممثل eIF2a eIF2a ف البروتين التعبيرات وتظهر في لوحات العلوي. وتعرض الفريق أقل الحارات مجموع البروتين. (ب) الموضح هو eIF2a يعني 4 عينات أعربت نسبة إلى مجموع البروتين (من الفريق A) أقل في نويات الدماغ عينات أونبريميد (الأزرق) مقابل عينات معبي اللبأ (براون)، و (ج) الشكل غير نشط من eIF2a (ف-eIF2a). تعيين العلامات نجمية ألوان كل منها اختلافات كبيرة (ف < 0.05، n = 4 أنوية) بين كل أشكال eIF2a في NTS مقابل مستوى كل منهما في الأنوية الأخرى. التعبير eIF2a النشطة في أونبريميد مقلوب إلى حد كبير لتلك التي في معادل، والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، والخطة الرئيسية للعمليات مقابل عينات معبي في NTS (χ2 ف < 0.05 مقابل جميع الأنوية الثلاث، n = 4). أشرطة الخطأ تمثل الخطأ القياسي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: NTS تعرب عن eIF2a كيناز ف-GCN2 في اتفاق مع مستوى ف-eIF2 وعكسيا بمستوى ف-PKR- (أ) مستوى فروبيه باكستانية (كيناز دسرنا المنشط من eIF2a) هو المعرب عنها في أونبريميد مقابل NTS معبي اللبأ عكسيا إلى 1) مستوى ف-PKR في التشفيير (χ2 ف = 0.025) و 2) استهدفت به المتوقعة eIF2a الركيزة بعد الفسفرة لها (إلى ف-eIF2a، الشكل 2). ملاحظة أن نمط فروبيه باكستانية في الابن، CX والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة والخطة الرئيسية للعمليات في أونبريميد مقابل معبي اللبأ عينات يناسب كل أنماط ف-eIF2a من الرقم 2. (ب) المنشط eIF2a كيناز (ف-GCN2) في أونبريميد مقابل NTS معبي العينات يتبع نمطاً مماثلاً من التعبير eIF2a ف من الشكل 2 ونمط معكوس التعبير برك من الشكل 3 ألف (χ2 ف = بين 0.028). ج = متوسط مستويات GCN2 غير نشط. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ القياسي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: تعبير هيولى NF-كيلو بايت وإيكب في نويات الدماغ من عينات الأمعاء أونبريميد وتجهز اللبأ. (أ) يعني هيولى التعبير عن إيكب بالنسبة لمجموع البروتين (من لوحة ج) في نويات الدماغ المشار إليه. (ب) ممثل عصابات هيولى من البروتين IkB ترد في اللوحة العلوية وكثافة البروتين الكلي في الممرات كل منهما في اللوحة السفلي. (ج) يعني هيولى التعبير NF-كيلو بايت بالنسبة إلى مجموع البروتين (من لوحة د) في نويات الدماغ المشار إليه. (د) ممثل عصابات هيولى العصابات NF-كيلو بايت ترد في اللوحة العلوية وكثافة مجموع البروتين هيولى في الممرات كل منهما في اللوحة السفلي. تعيين العلامات النجمية الملونة اختلافات كبيرة بين العينات المشار إليها (ف < 0.05، n = 4). ملاحظة أن هيولى كيلوبايت NF-مستويات أعلى في تجهز اللبأ CX والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، والخطة الرئيسية للعمليات من نويات طائي NTS والتشفيير وابنه في خلاف مع مستويات مثبطات NF-كيلو بايت (إيكب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: مقارنة التخطيطي الافتراض OT إشارات في مناطق الأمعاء والدماغ معبي اللبأ- (A) "اللبأ بعد التمديد" في انتيروسيتيس ينشط مستقبلات لها عن طريق التفاعل المباشر مع OTR، الحد من الالتهابات عن طريق زيادة إيكب يشير إلى المصب. تحول دون ترجمة البروتين بزيادة فروبيه باكستانية، مما يقلل من نشاط elF2a عن طريق الفسفرة. يتم استعادة التوازن عن طريق زيادة التعبير الجيني المقاضاة13،37. نيورونال (ب) أو بعد التمديد الدورة الدموية ينشط مستقبلات لها في مناطق الدماغ، وخدمات العملاء، والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، والخطة الرئيسية للعمليات دوونريجولاتينج التهاب والبروتين الترجمة عن طريق الجزيئات نفسها كالقناة الهضمية (انظر لوحة). (ج) المفترضة آثار فتيلة اللبأ في منطقة NTS في الدماغ مميزة والعكس من تلك الموجودة في لوحات ألف وباء GCN2، وحساسة لتوريد حمض أميني، يزيد من الترجمة eIF2a والبروتين. في الوقت نفسه، تسمح مستويات منخفضة من IkB NF-كيلو بايت لإدخال النواة والحث على التهاب. ملاحظة أن أعمال المقاضاة وبالمثل لاستعادة التوازن في الأمعاء الغليظة وفي تي إس في الدماغ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Supplementary Figure
التكميلية الرقم 1: التخطيطي عرض المخطط الزمني البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تقنية ميكروديسيكشن من المنفصلة، الغنية OTR نويات الدماغ في الدماغ الفئران حديثي الولادة هو المعروضة في هذه الورقة. من المعروف جيدا أن الخلايا العصبية هي درجة عالية من التخصص، حتى داخل نواة تتسم جيدا في الدماغ. ويمكن هذا النهج استنساخه بدرجة عالية لعزل محددة الغنية OTR نوى اختبار الفرضية قوية. استخدام النشاف الغربية الآلي، الاتساق وإمكانية تكرار نتائج نتائج تم تحسينها. رغم وجود قيود على هذا الأسلوب ما زال تقلب لكمه الدماغ متواضعة؛ هذا الأسلوب يمثل تقدما أكثر من خلية واحدة، والدماغ كله أو النهج شريحة الدماغ. النهج خلية واحدة معقدة بتقديم لقطات إضافية محدودة للغاية. استخدام الدماغ كله، قد تضعف أي نتائج إذا كان التأثير يقتصر على منطقة المخ أو الخلايا العصبية من النوع الفرعي. يمكن إدخال نهج شريحة الدماغ دون ميكروديسيكشن التغير العميق في النتائج في إطار مجرد ميكرون في شريحة، ومشكلة خاصة لتحت المهاد في هذه الدراسة، بسبب ضيق تجميع نواة متميزة. استخدام لكمه موحدة ومساعدة المجهر، تم تخفيض التغير في قياسات البروتين.

وهناك العديد من الخطوات الحاسمة ضمن هذا البروتوكول. وهذه تشمل التقيد بتوقيت الحصاد الأنسجة فيما يتعلق بتغذية أول واستخدام حجم المخزن المؤقت لاستخراج البروتين، حضانة شرائح المخ في قام الحد أدنى بحيث يمكن استخدام مثبطات الجزيئية أو المنشطات، واستخدام حساسة جهاز الغرواني الكهربي المناعي. وتشمل التعديلات الممكنة اختيار الكواشف للحضانة ومدة الحضانة وتمديد وقت المجاعة أونبريميد لمقارنة أدمغة في أوقات مماثلة. وتشمل أوجه القصور الهامة وجود بعض الخلايا غير العصبية (حتى خلال هذه الفترة حديثي الولادة المبكرة جداً) وعدد محدود من العينات التي يمكن إعدادها من القمامة واحد من الأطفال حديثي الولادة في يوم واحد. وعلاوة على ذلك، أن هذا النهج تعتمد اعتماداً كلياً على عندما يولدون في الجراء. فيما يتعلق بالأساليب القائمة، التعبير الجيني في الدماغ في هذا العصر هو عادة أكثر سهولة تقييم والمستوى النسخي. بيد للخلية مما يشير إلى التحليل، النهج البروتين الذي ينفذه معدات المرافق الأساسية أكثر تكلفة من الأدوات المؤتمتة سطح المكتب. طريقة لطخة غربية التقليدية يتطلب أكثر بكثير من البروتين، ويأخذ عدة أيام لإكمال، وينطوي على عدة خطوات التلاعب بالقوى العاملة الفنية. ويتطلب هذا النهج الآلي البروتين 0.8 ميكروغرام لكل شعري، بمجرد تحميلها في الصك كل الخطوات التي تتم دون الإنسان أيدي التدخل ويأخذ 2 و 50 دقيقة لإكمال التشغيل. يمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة تطور الدماغ بعد الولادة مباشرة في الفئران ومجموعة واسعة من نماذج الماوس محوره وراثيا.

باستخدام هذا الأسلوب، آثار التمديد على المستوى الخلوي، على وجه التحديد في فترة حرجة للغاية بين الولادة والرضاعة، وتم التحقيق عندما أقصى محسوباً OTR في ظهارة8. تحوير آثار التمديد على الخلية إشارات الجزيئات في خلايا القناة الهضمية، سواء في الخلية خط37 و المجراة في13، أظهرت سابقا. في هذه الدراسة، تم تقييم التأثيرات التي لوحظت في خلايا القناة الهضمية في مناطق المخ الغنية في OTR. كان التعبير عن المقاضاة/GRP78 و eIF2a ف أوبريجولاتيد في أونبريميد (متسقة مع استجابة المتوقعة للتأكيد) ودوونريجولاتيد معبي NTS الأنسجة (تمشيا مع استجابة الموهنة للتأكيد)، في حين كان NF-كيلو بايت عالية ومستقرة في كل الظروف 38-تعبيرات للمقاضاة و NF-كيلوبايت هي نفسها في المناطق الأخرى تم اختبارها في الظروف أونبريميد ومعبي على حد سواء. وكان فوسفوريلاتيد eIf2a دسرنا تعتمد كيناز (بكر) في ابنه ومعادل، والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، والخطة الرئيسية للعمليات. ومع ذلك، في تي إس، وإلى حد أقل في التشفيير، كان فوسفوريلاتيد eIf2a بآخر كيناز، كيناز نونديريبريسيبلي--2 الرقابة العامة (GCN2). تصور التخطيطي الافتراض باختلافات في الإشارات في الدماغ والأمعاء وآثار التعرض اللبأ ويرد في الشكل 7.

وهذا يجعل الأسلوب ميكروديسيكشن من الممكن لاختبار الفرضيات المتعلقة بالتأثير اللبأ الأولى تتغذى على المتصلة بالإجهاد إشارات في نويات الغنية OTR منفصلة في الدماغ الولدان. هذه البيانات تشير إلى أن آليات تحوير الإجهاد لوحظ سابقا في القناة الهضمية المولود الجديد انتيروسيتيس تنعكس في مناطق محددة من الدماغ الغنية في OTR، كما يتضح من زيادة الاحتفاظ سيتوسوليك نفكب (التشفيير ومعادل الابن والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة والخطة الرئيسية للعمليات). كما تشير النتائج إلى أن تي إس والتشفيير الاستفادة من إليه الفسفرة مختلفة من المناطق الأخرى التي قد تكون الصهر إلى أثر نقص المغذيات. جماعياً، وتشير البيانات إلى أن الخلية إشارات في المخ المرتبطة بعدم كفاية المواد الغذائية والهرمونية خلال الساعات الأولى الولادة التالية مماثلة للخلية الإشارات في القناة الهضمية نفس الظروف. وتدعم هذه البيانات أهمية حليب الأم في وقت الولادة لتعديل الضغط في الأمعاء والدماغ. وتؤكد هذه النتائج الحاجة إلى مزيد من الاستكشاف لتأثير اللبأ على وظيفة المخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون الحارس مانون وشولتز ألكسندرا لمساعدتها في إعداد هذا البروتوكول.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bradford solution Bio Rad
Protein lysis kit Protein simple CBS403 Bicine/CHAPS
WES kits Protein simple WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a Cell Signaling technology SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR Cell Signaling technology 2103
Rabbit anti-phospho-PKR Millipore Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR Cell Signaling technology 12297
rabbit mAb anti-GAPDH Cell Signaling technology 2118
mouse mAb anti-phospho-IKB Cell Signaling technology 9246
mouse mAb anti-IKB Cell Signaling technology 4814
rabbit anti-BiP Cell Signaling technology 3183
Rabbit anti GCN2 Cell Signaling technology 3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2 BIORBYT T899
pregnant Sprague-Dawley rats Charles River Laboratories
Punch device WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).
  2. Okabe, A., et al. Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex. Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).
  3. Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain. Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).
  4. Carter, C. S. Oxytocin and Human Evolution. Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).
  5. Sippel, L. M., et al. Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities. Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).
  6. Agnati, L. F., et al. Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine". Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).
  7. Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice. American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).
  8. Welch, M. G., et al. Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium. Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).
  9. Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin. Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).
  10. Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis. Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).
  11. Klein, B. Y., et al. Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells. Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).
  12. Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut. Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).
  13. Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi. Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).
  14. Donnet-Hughes, A., et al. Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education. Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).
  15. Perez, P. F., et al. Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells? Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).
  16. Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. Concentrations and origin of oxytocin in breast milk. Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).
  17. Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol. Systematic Reviews. 5 (1), 205 (2016).
  18. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).
  19. Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain. Frontiers in Neuroscience. 10, 504 (2016).
  20. Hansson, J., et al. Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development. Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).
  21. Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period. Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).
  22. Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits. Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).
  23. Johannes, G., Sarnow, P. Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites. RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).
  24. Rinaman, L. Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).
  25. Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness. Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).
  26. Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality. Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70 (2013).
  27. Blevins, J. E., Ho, J. M. Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).
  28. Welch, M. G., et al. Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons. Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654 (2010).
  29. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  30. Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases. Scientific Reports. 6, 32886 (2016).
  31. Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts. Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).
  32. Shapiro, R. E., Miselis, R. R. The central neural connections of the area postrema of the rat. Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).
  33. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1997).
  34. Nayak, R., Pintel, D. J. Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA. Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).
  35. Zaborske, J. M., et al. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).
  36. Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).
  37. Klein, B. Y., et al. Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).
  38. Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. NF-kappaB in the nervous system. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271 (2009).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 141، نقص المغذيات، نواة tractus solitarius (NTS)، التشديد على الاستجابة، نونديريبريسيبلي المراقبة العامة 2 (GCN2)، النووي عامل كيلوبايت (NF كيلو بايت)، 2 ألف عامل الشروع في ترجمة حقيقية النواة (eIF2a)
تقييم الإجهاد الخلوية والتهاب في نويات الدماغ إفراز الاوكسيتوسين المنفصلة في الفئران حديثي الولادة قبل وبعد التغذية اللبأ الأولى
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Klein, B. Y., Tamir, H., Anwar, M.,… More

Klein, B. Y., Tamir, H., Anwar, M., Ludwig, R. J., Kaidbey, J. H., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding. J. Vis. Exp. (141), e58341, doi:10.3791/58341 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter