Summary
在这里, 我们提出了一个方案, 以分离脑核在新生大鼠大脑与第一初乳喂养。这项技术允许研究由肠细胞信号调节的大脑营养功能不足应激。
Abstract
该方案的目标是在首次初乳喂养前后分离新生儿大脑中富含催产素受体的大脑细胞核。已知对代谢应激有反应的蛋白质的表达是在脑核分离株中使用西方印迹进行的。这样做是为了评估代谢应激引起的体内营养功能不全是否引发神经元应激。我们以前已经证明, 新生儿营养不足会引起肠道的代谢压力。此外, 初乳催产素可调节新生大鼠肠道绒毛首次进食前后的细胞应激反应、炎症和自体吞噬标志物。与内质网应力相关的信号蛋白标记 [er 伴侣结合免疫球蛋白蛋白 (bip)、真核翻译起始因子 2a (eif2a) 和 eif2a 激酶蛋白激酶 r (p-pkr)] 以及2炎症信号蛋白 [核因子-b (nf-kb) 和抑制剂 b (ikb)], 在新生脑核 [孤立道 (nts)、旁细胞核 (pvn)、超视核 (son)、皮层 (cx)、纹状体 (str) 和在第一次喂养 (初乳未启动) 之前和护理开始后 (由初乳启动) 之前的内侧视前细胞核 (mpo)。在未启动和下调的 nts 组织中, bip-grp78 和 pe-eif2a 的表达得到了抑制。nf-行在 cx、str 和 mpo 细胞质中保留 (高), 而 nf-kob 在 nts、pvn 和 son 中均较低且不变。集体 bip 和 p-eif2 的发现与应激反应是一致的。eif2a 在 son、cx、str 和 mpo 中由 dsrna 依赖性激酶 (p-pkr) 磷酸化。然而, 在 nts (在较小程度上在 pvn 中), eif2a 被另一种激酶磷酸化, 一般控制非接触-2 激酶 (gcn2)。以前在新生儿肠道细胞中观察到的压力调节机制似乎反映在一些富含 otr 的大脑区域。nts 和 pvn 可利用其他地区不同的磷酸化机制 (营养不足下), 并可耐火性的营养不足的影响。综合来看, 这些数据表明, 大脑对营养功能不全应激的反应被来自牛初启动的肠细胞的信号所抵消。
Introduction
与我们对产后白天至几周大脑早期发育的理解不同, 对老鼠生命最初几个小时发生的无数动态变化的了解相对较少。一个关键的挑战是新生大鼠大脑体积小, 以及需要高科技工具来分离离散的大脑区域或单个细胞。研究通常评估基因转录, 而不是翻译1,2, 这不能使一个坚实的理解功能水平的激活信号分子。另一些人使用免疫组织化学来检查表达, 以参考大脑区域, 这不允许量化表达水平3。到目前为止, 还没有研究过与大鼠在离散大脑区域的第一初乳饲料相关的信号通路的激活, 这需要用西方方法快速分离和牺牲和测量蛋白质表达和蛋白质磷酸化杂交。虽然大脑微解剖是在年龄较大的大脑上进行的, 但我们还没有确定在 p0 大脑中进行非单细胞脑拳的参考。本文提出了一种利用相对低技术的打孔技术和西方印迹技术分离新生儿大脑受限区域的方法, 以测量相对较小样本中的蛋白质表达。该协议可能适用于需要评估任何物种小大脑的相对受限区域的蛋白质表达和翻译后修饰 (例如磷酸化) 的研究问题, 前提是用户可以通过地图集和可识别的地标直观地识别感兴趣的大脑区域。
这项技术是为了了解新生大鼠的第一牛初乳饲料所发生的变化而开发的, 这种饲料富含催产素 (ot)。长期以来, ot 一直以其刺激牛奶脱床和子宫收缩的能力而闻名。然而, ot 现在被认为在调节许多身体功能和行为方面发挥着广泛的作用.例如, ot 反对压力和炎症, 再加上适应性从属行为5, 延迟胃排空, 减缓肠道转运。ot 受体 (otr) 已被鉴定在肠内神经元和肠道上皮 6, 7,8.ot 对婴儿产后早期的胃肠道效应尤为重要。例如, 母乳喂养与向新生儿肠道9、10 提供大量 ot 有关, 数据显示, 在牛奶乳汁期间, otr 在十二指肠绒毛中严重过度表达.
利用肠道细胞系进行的体外实验在细胞水平上证明, 催产素调节了压力信号通路11、12中的重要分子, 并在蛋白质的转化中发挥了调控作用12. 这些研究表明, 牛奶的成分, 包括来自母亲的外源性催产素, 对新生儿展开的蛋白质反应非常重要, 以减少细胞压力 13.
体内和体外研究表明, 牛初乳 ot 调节新生大鼠肠道绒毛的细胞应激反应、炎症和自体吞噬标志物。当肠道同时暴露在14天初乳14、15 和许多蛋白质中的母亲的微生物群中时, 新生儿肠细胞的腔侧承受着巨大的细胞压力, 其中包括 ot9等激素,10,16岁
ot 对大脑的影响已经研究了17。然而, 在产后早期肠道中显示的 ot 信号机制还没有在大脑中得到研究。本文采用电泳方法对新生大鼠脑干和下丘脑离散脑核进行了隔离。这种方法的总体目标是捕捉大脑区域的细胞信号状态, 尽可能接近出生, 在第一次牛奶乳汁之前和之后, 在胶质神经元指数最低的脑组织中。开发这项技术的理由是, 它可以快速分离新生幼崽中受限制的、微观的大脑区域, 并使用西方的自动印迹进行更均匀的神经元收集, 用于体外研究方法, 在相对较小的解剖样本上提供高度一致的结果。先前工作的一个缺点包括更多的严重解剖 (大脑切片或整个大脑) 和年龄较大的动物 18,19。幼崽的大脑是令人难以置信的动态, 具有出生后的胶质分化波。为了研究幼崽首次进食对大脑变化的影响, 有必要研究具有可重复解剖的受限神经元核。
牛奶饲料通常被分析它的免疫学和营养对健康或基因表达的影响 (例如, 在肠细胞20,21), 而它的影响对大脑区域在脑子发展过程中很少被研究。结合肠道胆囊激素受体对脑干核的迁移, 而不是细胞内信号通路 22, 分析了牛奶在肠道中的转运对大脑功能的影响。关于发育中的新生儿大脑在怀孕 23岁期间容易营养不良, 母亲营养不良的文献很多, 但压力和炎症信号没有得到解决。重要的是, 目前的方法利用了一种现象, 在一天零大鼠新生儿分离血液出生的牛初乳刺激从迷迷神经中继的内脏刺激。这就是所谓的应力低反应期, 其特征是出生后立即未成熟的孤束核 (nts)-下丘脑电路 24, 25 限制 nts, 室旁核 (pvn),超视核 (son) 信号到血液出生的刺激。
这种方法对于分析多种信号通路和相对限于神经元细胞是有用的, 前提是在大鼠产后第0天采集脑组织, 以及母亲是否受到任何形式的治疗在怀孕期间。可以分析垃圾对初乳饲料与预喂养信号的影响。当比较大脑区域与蛋白质产量低或丰富的蛋白质产量之间的信号时, 这种方法使毛细血管内确定毛细血管中多肽带的总蛋白与蛋白质抗原的免疫定量平行。该方法可以使用任意单位对没有标准定量曲线的相同抗体获得的结果进行定量比较, 并参照每毛细管的总蛋白。只有使用定量的标准曲线, 才有可能对不同抗体获得的结果进行比较。
这种方法可以评估肠道和大脑之间发生的双向信号, 这可以影响两个器官26的功能.催产素与食物摄入之间的联系,近年来已被广泛研究 27, 支持增加催产素信号和营养供应之间的联系。这些研究也支持相反的概念, 即能量不足与下丘脑催产素信号的减少相结合。
早期对 ot 对大脑活动的影响的研究表明, 诱导的肠道炎症引起下丘脑 pvn、杏仁核和梨形皮质的 cfos 转录, 可难治性于迷走神经切开术28。然而, 全身输注 ot 与分泌物减少脑 cfos 反应引起的炎症反应在肠道28。这表明外源 ot 的作用是通过迷速继电器以外的途径进行的, 可能是通过 6,29后携带的血液传播信号分子进行的。
在这项研究中, 对此前在肠道中观察到的细胞应激信号通路进行了大脑评估。假设是, 牛奶成分可以保护或推迟炎症对肠道对微生物和其他代谢物的渗透性的影响, 进而对大脑功能的影响。在13例牛初乳启动前后发现的 ikb 与 bi-p 信号的明显拮抗差异表明, 仍在发育过程中的新生儿大脑可能会感觉到这些牛初乳诱导的肠道信号。
测量了以往肠道实验中使用的与内质网应力相关的信号蛋白标记。它们包括 er 伴侣 bip、翻译起始因子 eif2a (用作应激反应积分器30)、eif2a 激酶 p-pkr 和两种炎症信号蛋白 (nf-kb 及其抑制剂 ikb)。
根据成人分泌或反应 ot 的能力, 选择了六个大脑区域。nts 位于上髓质, 是内脏输入的第一个中继, 通过相邻的区域后雷马32接收来自肠道内迷变神经感觉神经元的直接信号, 可能还有血液出生的细胞因子、毒素和激素.pvn、视上核 (son)、纹状体核 (str)、大脑皮层 (cx) 和内侧视前核 (mpo) 通过 nts 接收来自肠道的信号。
结果表明, nts 在初乳启动前和首次喂养后立即发生的产后细胞应激反应与 pvn 和 son 不同。cx、str 和 mpo 中的信令也不同于 pvn 和 son。先前显示的调节肠道细胞压力和炎症的 ot 的独特保护功能很可能是大脑某些区域所能感觉到的。总体而言, 数据表明, 在细胞水平上, 在出生后的最初几个小时内, 大脑会对与营养功能不足相关的代谢压力做出反应。数据还显示, 牛初乳饲料调节效果的范围和方向是区域依赖性的, 在一些地区, 它们反映了以前在肠道中显示的 ot 效应。
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Protocol
这项研究得到了哥伦比亚大学动物护理和使用机构委员会和纽约州精神病研究所的批准。
1. 组织制备
- 从供应商处订购怀孕的老鼠。
- 跟随定时怀孕的老鼠, 观察它们到达后的几周内生长的腹部, 然后在预期的分娩日期通过每2小时检查一次笼子, 直到分娩开始, 寻找幼崽。
- 在未引物的幼崽 (在观察腹部时没有明显的白色乳腹) 之前, 或在为前提狗 (此时在它们的腹部可以看到白色的胃) 的第一次喂养之后, 用戴手套的手抓住幼崽的尾巴, 然后将它们的腹部看到(图 s1)。
注: 第一个初乳饲料被称为启动小狗;因此, 小狗在第一次饲料之前是不准备的, 之后它们被牛初吸。 - 使用锋利、干净的手术剪刀快速斩首未麻醉的小狗。
- 通过将头骨中线和顶部表面的皮肤切割到鼻子来切除大脑。然后, 使用钳子轻轻撬开骨头, 露出大脑 (图 1B), 并将其定位, 在取出骨板时用笔将其标记为 "bregma" (图 1 b)。
- 在室温下快速将整个大脑放置在聚甲基丙烯酸甲酯脑模中, 以便在室温下进行冠状切片 (图 1c)。
- 使用新鲜的剃须刀片, 立即制作500毫米厚的薄片。将切片在培养皿中与尾端一起放置, 以保持切片的方向 (图 2)。
- 在不葡萄糖的情况下快速添加人工脑脊液 (acsf; 1.0mm kh po4, 26 mm nahco 3, 118.6 mm nacl, 3.0 mm kcl, 203.3 mmmmmmmgcl 2-6h2o),并在28-30 下孵育切片 60分钟, 在2-30°c 下不断搅拌眼眶振动台对代谢和差异的挑战是未启动的组织与牛耳吸体组织。
- 识别大脑核, 需要打孔使用大脑地图集33和解剖地标上的组织部分。将这个切片与感兴趣的细胞核放在培养皿中, 并将其移动到解剖显微镜上。
- 一旦可视化, 使用取心工具快速打出6个不同原子核中的 4个, 选择大小以最好地打孔有问题的原子核, 并在样品之间保持一致 (图 2)。
注意: 剩下的大脑切片现在将有一个脑组织被切除的洞。在这项研究中, 我们使用下面的坐标切除了以下原子核。所有前后路 (a) 坐标均来自布雷马 (nts 除外, 它参照了卡拉穆斯·斯伯里图)。所有背腹侧 (d/v) 坐标都来自皮层表面 (nts 除外, nts 是从髓质表面)。以下坐标包括阿普、内侧侧向 (m/l) 和 dm:1) 孤立道核 (nts, a/p, 0.4 至 0.8;l, ±0.2;dv, 0.3 (来自髓质的表面), 2) 副室核 (pvn,-0.8; ±0.2; 0), 3) 超视核 (son,-1.1; ±1.4; 4.3), 4) 皮层 (cx, 部分皮层面积 1,-2.8; ±1.5; 0.6), 5) 纹状体核 (str, 0.0; ±1.6; 1.8) 和 6) 内侧视前核 (mpo,-0.6; ±0.2; 4.2)。 - 快速将被打孔的细胞核浸泡在 0.06 ml 的冰凉、含有蛋白酶抑制剂的蛋白质提取缓冲液和磷酸酶抑制剂中, 时间为 60分钟 (见步骤 2.3)。
2. 蛋白质提取
- 在预期的小狗交付前一天, 使用蛋白质裂解试剂盒 (材料表) 准备蛋白质提取溶液。
- 解冻 (冰上) 裂解蛋白酶和磷酸酶抑制剂的蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冷冻 (-20°c) 水溶液, 并将蛋白酶磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液和 dmso 溶液放在冰上。
- 在干净、冰冷的15毫升管中加入1.85 毫升的裂解缓冲液。然后, 加入 0.1 ml 的水溶液的抑制剂和0.05 毫升的 dmso 溶解抑制剂。最后, 盖上盖子, 短暂旋涡管, 并将其保持在-20°c, 直到使用。
- 标签24清洁微离心管 (每个0.5 毫升) 的裂解过程。为牛初乳未引物组 (u) [6个左 (l) 和6个右 (r) 脑核] 指定每个大脑12个管, 并根据核心首字母缩写词、侧面和条件 (例如, nts-l-u、nts-r-u等) 进行标记。为第二组12管贴上牛初乳底漆样品的标签。
- 标记两套额外的管, 如步骤2.4 所做的股票蛋白提取物 (使用 1.5 ml eppendorf 风格的管) 和第一套样品制备 (使用 0.5 ml 管)。将这些管子放在两个单独的、有标签的冷冻箱中 (每个都是为100个管设计的)。一个盒子将用于未装药的样品, 另一个盒子将用于底漆的样品。
- 在小狗交付的当天在冰上解冻裂解溶液, 在 acsf 中孵育脑切片时, 将 aliquot 0.06 ml 裂解溶液放入裂解程序管 (从步骤2.4 开始) 中, 并在冰中添加细胞核和孵育60分钟。
- 在 14000 rpm (10, 000 x g) 的冷却微型离心机中离心孵育的裂解核 30分钟, 并用适当设置的移液器仔细地抽吸 0.055 ml 的上清液。将上清液转移到预冷 1.5 ml 库存管 (从步骤2.5 开始), 并将其放在冰上。在冷冻 (在-20°c) 之前, 将 0.12 ml 的上清液转移到 0.5 ml 预冷管中, 用于第一次样品制备 (从步骤2.5 开始), 并将其留在冰上。
3. 毛细管内蛋白质测定的样品制备
- 使用试剂盒, 并根据制造商的指示准备分离试剂。在含有0.012 毫升蛋白质提取物的冰上的 0.5 ml 标记管 (从步骤2.5 中) 中的12个样品中, 分别加入 0.003 ml 的主混合试剂。
- 将加热块打开至 95°c, 并将步骤3.1 中制备的试剂在具有0.016 毫升去离子水的管内的生物素化分子量 (mL) 阶梯中加入 0.004 ml。为了使梯子和样品变性, 将梯子管和12个未引物蛋白提取物样品放在95°c 的热块中 5分钟, 并将其保存在 4°c, 直到使用。
- 重复步骤2.0 至 3.2, 从蛋白质提取到样品制备, 从牛初引物大鼠的细胞核。
4. 电泳准备
- 解冻工作台上的生物素标签试剂 (储存在- 80°c 的深冰柜中), 并按照制造商的指示, 在4°c 的冰上制备蛋白质检测试剂盒。
- 将0.15 毫升的发光醇与0.15 毫升的过氧化物混合, 并将 0.01 ml 混合成25口井 (e 排, 1-25 口), 用于自动化的西方机器。将链球菌-hrp 从试剂盒装入 d1 至 d25 井中, 重量为0.008 毫升
- 将抗体稀释液的0.01 毫升加载到 c1 至 c25 和 b1 的井中。
- 将24个蛋白质样本和梯子管短暂旋转 (2-3秒), 在微型离心机中将蒸发的水从管盖中倒下来。
- 将12个未底漆样品的0.003 毫升装入 a2 至 a13 井, 将12个牛初修复样品的 0.003 ml 装入 a14 至 a25 井, 将生物素化阶梯的 0.005 ml 装入 a1 井。
- 将 f 排空载0.45 毫升的洗涤缓冲液放入 f 排以下3行的5个隔间中的每一个. 用塑料盖覆盖板, 以避免在剩余的过程中蒸发。
- 将解冻后的生物素标记试剂简要旋涡, 并在指定管中加入0.15 毫升的试剂;然后在其中加入0.15 毫升的总蛋白试剂, 并将其混合到均匀性。
- 从板材上取下盖子, 将剂1和2的 0.01 ml 装入 b2 至 b25 井。将板材盖上, 以 1, 000 x 克的速度将其盖上 10分钟, 以去除各种溶液中的气泡。在离心机中使用一个空盘子来平衡。
5. 电泳
- 在平板旋转时, 在自动西方机器连接的计算机中打开一个运行文件, 方法是在 "文件" 的下拉页中指示运行总蛋白质检测, 然后单击相应的位置。
- 在电脑上用注释好样品。然后, 从离心机上取下板, 取下盖子, 小心地从分离溶液隔间上剥落铝盖。
- 将板材放入自动化的西方仪器中, 从毛细管墨盒盒上剥下盖子, 将墨盒插入指定位置, 然后关上门。
- 单击 "run" 按钮, 当提示检测的类型 ("总蛋白") 时, 键入样品的名称 (例如, "未启动2-13 和牛初引物 14-25")。单击 "确定", 当运行文件的激活运行日期和 id 号提示时, 记下运行结束的时间。
- 在运行结束时 (启动后 170分钟), 打开仪表门, 取出毛细管墨盒, 并将其丢弃到锐器处理中。丢弃在生物物质处理中的板材。
- 单击运行文件的分析页中的分离曲线图标, 并检查所有样本是否都已正常运行, 是否在所有毛细血管中显示了多个蛋白质曲线。
6. 信号蛋白分析
- 在标记的 1.5 ml 管中, 加入0.003 毫升的兔抗磷-eif2a (p-eif2a) 抗体, 并将其悬浮在抗体稀释剂中的 0.3 ml (1:100 稀释) 中, 从合适的检测试剂盒中提取。然后, 把它放在冰上。
- 标记发光管, 并在此检测模块套件中添加 0.15 ml 的发光醇和 0.15 ml 过氧化物, 并将 0.01 ml 放入新鲜的自动化西方板的 e1 至 e25 井中。
- 将二级抗家兔抗体0.01 毫升放入 d2 至 d25 井中, 从试剂盒中加入0.01 毫升的链球菌-hrp。
- 将原代抗体的0.01 毫升 (从步骤 6.1) 放入 s2 至 c25 井, 并在 c1 和 b1 至 b25 口子中加入0.01 毫升抗体稀释剂2溶液。
- 将行 f 井留空, 并将0.45 毫升的洗涤缓冲液填充到 f 行下方3行的5个隔间中。
- 将冷藏样品短暂旋转 3秒, 并按从 a2 到 a25 的总蛋白测定中添加的相同顺序将每个样品添加 0.003 ml 到行 a。加入0.005 毫升的生物素化 mL 梯子, 使 a1 井覆盖板。
- 按照步骤4.8 中的步骤进行离心。在旋转的时候, 打开 (在与西方相关的自动化软件和计算机中) 一个新的运行文件, 并在 "文件" 的下拉页面中通过单击相应的位置来运行分子大小分析。
- 在检测页中, 在每个毛细管中键入样本名称, 然后在分配的位置和其下方的二级抗兔抗体中键入原代抗体的名称。
- 在离心结束时, 重复步骤 5.3-5.5, 但这次给运行文件的名称应该是 "在未启动的2-13 和牛初启动14-25 上的 p-eif2a"。
- 电泳分离后, 检查 40–43 kda 大小的抗原免疫反应峰的运行文件。如果缺少此大小的峰值的 mw, 请右键单击曲线下方, 并在下拉列表中指示将 mw 添加到峰值, 从而确保记录曲线下方的大小和任意数量。
7. 处理结果
- 打开电子表格文件, 在自动西方运行文件中运行总蛋白, 并提供 id 号。
- 在曲线模式的分析页上打开总蛋白检测的运行文件, 并标记单个毛细血管中的所有峰值。然后, 将它们复制并粘贴到电子表格中, 并将整个毛细管中记录的所有峰曲线下的区域求和。
- 在单独的列中, 用毛细管数、各自大脑核的名称以及运行文件的 id 号排列每个列的蛋白质总量。
- 打开 p-eif2a 抗原的电子表格, 并在单个列中记录每个毛细管的曲线下的区域及其各自的毛细管数、大脑细胞核名称和运行文件的 id 号。
- 将总蛋白质列 (与 p-eif2a 曲线量平行) 复制到第三个电子表格中, 并计算第三个电子表格中的 p-eif2a: 总蛋白质比率。
- 收集每个大脑核的步骤4到6的结果, 将它们排列成原子核组, 并生成条形图。
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Representative Results
免疫反应带相对于总蛋白质表明, 有大脑细胞核的收获蛋白很低。这就需要使用西方的自动印迹技术, 与典型的西方印迹相比, 这种技术非常敏感。与西方印迹中的每车道相比, 这种方法可以用每毛细管少四倍的蛋白质运行。
初乳启动对脑核 bip 水平的差异效应
大鼠大脑的冠状部分是在第一次初乳喂养 (未启动) 之前和第一次喂养 (底漆) 之后采集的。用毛细管电泳 (wes) 对样品进行分馏, 并使用毛细管内总蛋白染色试剂盒对蛋白质进行定量 (见《议定书》)。在自动西方上进行额外的免疫毛细血管分馏, 提供了相应蛋白质抗原的鉴定。在图 3 a 中, 具有代表性的 bip 蛋白表达显示在上面的面板中, 相应的总蛋白如下所示。bip 是 er 伴侣蛋白。在图3b 中, 定量免疫反应是通过相对于相应总蛋白质的条形图呈现的。
在未引物组织样本中, nts 中的 bip 水平明显高于所有其他区域 (p & lt; 0.05, n = 4个细胞核)。与其他地区的 bip 增加相比, 初乳对肠道组织的启动有相反的效果 (图 3b)。启动降低了 nts 中的 bip (图 3b), 对 pvn 和 sept 没有影响。然而, 相对于未启动的组织, 启动增加了 cx、str 和 mpo 中的双磷。这一数据表明, 在各种被测试的大脑核中, bip 水平对肠道启动的反应不同, 在被测试的各种细胞核之间还没有任何被证明的交叉对话。
初乳启动对脑核 elf2a 和 p-elf2a 水平的差异效应
脑组织样本的制备、分析和量化, 如图 3 a 和3A所示。与 bip 水平 (图 3b) 一样, nts 中的 elf2a 和 pelf2a 水平在未启动条件下相对于其他原子核 (图 4b和4B) 升高。如 bip 水平所示, nts 对初乳对肠道组织启动的反应与其他细胞核的反应相反。相对于未启动的组织, nts 中 elf2a 和 p-elf2a 的水平都有所下降。在所有其他被测试的细胞核中, 相对于未启动的组织, 启动的 elf2a 和 pelf2a 的水平都有所增加 (图 4b和4B)。
初乳后 nts 和 pvn 中激酶 gcn2 对 elf2a 的磷酸化
脑组织样本的制备、分析和量化, 如图 3所示。在 pvn 中启动死亡 p-pkr ( 2 p = 0.025), 与增加 p-pkr 的所有其他区域不同。与 p-elf2a 的结果 (图 4c) 相反, 与 nts 中的底漆样本相比, p-pkr 的含量较低.elf2a 的磷酸化通常由其激酶 pkr 催化, 以应对病毒34和肠道中的 ot, 如先前所示,11。然而, p-pkr 水平在未启动 nts 中的含量非常低 (相对于其他核,图 5a) 这一事实强烈地表明, 另一种激酶必须参与磷酸化 elf2a (图 4c)。因此, gcn2 水平在 nts 和 pvn 中进行了测试, 因为它也是已知的 elf2a35 激酶.与 nts 和 pvn 中的底漆样品 (图 5b) 相比, 未底漆样品中的 p-gcn2 (活性形式) 水平较高, gcn2 (非活性形式) 与 p-gcn2 相比, pvn 中的 pcn2 (非活性形态) 呈负向表达 (图 5B)。nts 中的 pgcn2 (图 5c) 在未底漆和底漆 nts 中与 pGCN2 (图 5C) 成反比。在底漆组织中, p-eif2a 在 nts 中明显低于所有其他大脑区域 [pvn (p & lt; 0.01)、son (p & lt; 0.01)、cx (p & lt; 0.01) 和 mpo (p = 0.02)]。这表明 pgcn2 而不是 pGCN2 是 nts 中 eif2 抑制的原因。
牛初乳在 cx、str 和 mpo 中抑制 nf-kob
图 6a显示, 与引物样本相比, son 未引物样本中的 ikb 水平明显较高。son、cx、str 和 mpo 中的 ikb 水平在同一方向上呈更高的趋势。在图6c 中, cx、str 和 mpo 中的 nf-kob 水平在底漆组织和未启动组织中显著高于。然而, nf-kob 水平明显较低的启动 nts 组织, 这表明初乳有明显的抗炎作用, 这个大脑区域。在未引物的 nts 样品中, 细胞性 nf-kob 较高 (保留), 而其抑制剂 ikb 在引物样品中较低且不变。这表明, 一个独特的抗炎机制是调节 nts 的 nf-kb。这种营养功能不足的应激效应与目前的研究结果一致, 即压力标志物 bip 和 pe-eif2a 都是由牛初乳起爆的存在调节的 (分别为图 3和图4), 也显示在以前的 bip 和 p-elf2a 中。结果10。与 cx、str 和 mpo 相比, ikb 和 nf-行在 nts 中的不同响应的原因尚不完全清楚。然而, 与周围炎症36相比, 从肠道向大脑传递信号的 nts 在独特和相反的反应中可能发挥至关重要的作用, 这与观察是一致的.cx、str 和 mpo 中的 ikb 水平较低 (图 6a), 而在同一区域的 nf-行 (图 6A) 水平较高。虽然这一发现显然与 ikb 在细胞溶胶中结合和保留 nfkb 的前提相矛盾, 但使用回归分析对 cx、str 和 mpo 中所有引物样本进行组合和比较的数据的不同计算表明, nf-行 b 高度与 ikb 相关 (p & lt; 0.0001, n = 24)
图 1: 解剖新生大鼠大脑.(a) 解剖的大脑与骨头被摘除到 bregma。(b) 在布雷格马划一条线后, 大脑就会显示出来, 之后剩余的骨板被取出。(c) 在用剃须刀片切片之前, 大脑被显示在聚甲基丙烯酸甲酯脑模具中。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 用拳打脚踢 (红色圆圈) 排列从左旋到尾端的脑片.缩写: cx: 皮层, 顶叶;mpo: 内侧视前区域;nts: 独核;pvn: 室旁核;son: 视上核;和 str: 纹状体。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: nts 中的 bip/grp78 响应与其他原子核的响应相反.(a) 代表 bip 蛋白表达在上部面板相对于总蛋白在下面的面板中提出。请注意, 不同毛细血管中的总蛋白质密度是异质的, 这些蛋白密度用于平衡面板 b. (b) 显示的每个蛋白质各自的双磷表达, 即未引物样本大脑核中总蛋白的平均 bip (蓝色) 相对于牛初乳底漆样品 (棕色)。不同颜色的星号在 nts 中与其他原子核中的双聚值之间有显著差异 (p & lt; 0.05, n = 4 原子核)。nts 中未引物样本中的双磷表达与 str 中的双磷表达显着反转 ( 2 p = 0.028, n = 4)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: nts 中对初乳启动的活性和非活性 eif2a (p-eif2a) 响应与反转到其他核的未启动样品的反应.(a) 代表性的 eif2a 和 p-eif2a 蛋白表达在上层板中显示。总蛋白质通道显示在下面的面板。(b) 显示的是4个样本中相对于总蛋白质 (来自较低层 a) 在未引物样本 (蓝色) 与牛初引物样本 (棕色) 的大脑核中表达的平均 eif2a, 以及 (c) eif2a 的非活性形式 (pe-eif2a)。不同颜色的星号表示 nts 中的 eif2a 形式与其他原子核中的不同水平之间存在显著差异 (p & lt; 0.05, n = 4 原子核)。nts 中未引物样品中的活性 eif2a 表达与 cx、str 和 mpo 中的表达显著反转 ( 2 p & lt; 0.05 与所有三个原子核, n = 4)。错误条表示标准错误。请点击这里查看此图的较大版本.
图5:nts 表示 eif2a 激酶 p-gcn2 符合 p-eif2 水平, 与 p-pkr 水平相反.(a) eif2a 的 p-pkr (eIF2a 的激活 dsrna 激酶) 的水平在未启动基的和螺杆底漆的 nts 中反向表示为 1) pvn 中的 p-pkr水平 (2 p = 0.025), 2) 其预期的目标底物 eif2a 在磷酸化后 (pe-eif2a,图 2c)。请注意, 未基和低强基样本的 son、cx、str 和 mpo 中的 p-pkr 模式与图2c 中的 p-eif2a 的相应模式一致. (b) 未准备好的 nts 样本中激活的 eif2a 激酶 (p-gcn2) 遵循图 2c中的 p-eif2a 表达式的类似模式和图3 a 中 pprk 表达式的逆模式 (2 p = 0.028)。c = 非活动 gcn2 的平均水平。错误条表示标准错误。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: 未引物和牛初引皮肠道样本在脑核中 nf-kob 和 ikb 的细胞质表达.(a) ikb 相对于总蛋白 (来自 c 组) 在指核的平均细胞质表达。(b) ikb 蛋白的代表性细胞质带显示在上层板和在下面板的各自车道上的总蛋白密度。(c) nf-kb 相对于总蛋白 (来自 d 组) 在指核的平均细胞质表达。(d) nf-行波段的代表性细胞质带出现在下板各自车道的上部板和细胞质总蛋白密度中。彩色星号表示所示样本之间的显著差异 (p & lt; 0.05, n = 4)。请注意, 在牛初引物 cx、str 和 mpo 中, 细胞质 nf-kob 水平高于下丘脑核 nts、pvn 和 son, 与 nf-kob 抑制剂 (ikb) 的水平不一致。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7:两 "例图比较了牛初引脚肠道和大脑区域中的假设 ot 信号.(a) 肠细胞中的牛初乳 ot 通过与 otr 的直接相互作用激活其受体, 通过增加 ikb 下游信号来减少炎症。增加 p-pkr 抑制蛋白质转化, 通过磷酸化降低 elf2a 活性。通过增加 bip 基因表达 13,37 恢复稳态。(b) 神经或循环 ot 激活其在大脑 cs、str 和 mpo 区域的受体, 通过与肠道相同的分子抑制炎症和蛋白质翻译 (见 a 组)。(c) 在大脑 nts 区域的牛初乳启动的假设效应与 a 和 b. gcn2 面板中的假设效应不同, 后者对氨基酸供应敏感, 增加了 eif2a 和蛋白质的翻译。同时, 较低的 ikb 水平使 nf-kob 进入细胞核并诱发炎症。请注意, bip 同样作用, 以恢复肠道和 nts 在大脑中的稳态。请点击这里查看此图的较大版本.
补充图 1: 显示协议时间线的原理图.请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
本文介绍了一种在新生大鼠脑内对离散、富 or 脑核进行微解剖的技术。人们公认, 神经元是高度专业化的, 即使在大脑中的良好特征的细胞核内也是如此。这种高重现性的方法可以分离出特定的富含 otr 的原子核, 从而能够进行可靠的假设检验。利用西方的自动印迹, 进一步提高了结果的一致性和重现性。虽然这种技术的局限性仍然是适度的大脑冲床变异性;这项技术代表了比单细胞、整个大脑或大脑切片方法的进步。单细胞方法是复杂的提供非常有限的捕捉。使用整个大脑, 任何发现可能会被稀释, 如果效果被限制在大脑区域或神经元亚型。没有微解剖的脑片方法会在切片中的仅仅微米内引入深刻的结果变异性, 这在本研究中对下丘脑来说尤其有问题, 因为不同核的聚类紧密。使用标准化的冲床和显微镜的帮助, 减少了蛋白质测量的变异性。
此协议中有几个关键步骤。这些措施包括坚持组织收获的时间相对于第一个饲料, 使用最少的蛋白质提取缓冲液量, 在 acsf 中培养脑片, 以便分子抑制剂或兴奋剂可以使用, 并使用敏感的免疫电泳装置。可能的修改包括选择用于孵育的试剂和孵育的持续时间, 以及延长未准备饥饿的时间, 以便在相同的时间比较大脑。重要的限制包括存在一些非神经元细胞 (即使在这个非常早期的新生儿时期) 和数量有限的样本, 可以从一个孩子的新生儿在一天内准备。此外, 这种方法完全取决于幼崽何时出生。关于现有的方法, 这个年龄大脑中的基因表达通常在转录水平上进行更方便的评估。然而, 对于细胞信号分析, 核心设备执行的蛋白质组学方法比桌面自动化仪器更昂贵。传统的西方印迹方法需要更多的蛋白质, 需要几天才能完成, 并涉及技术人力的几个操作步骤。这种自动化的方法需要0.8 微克的蛋白质每个毛细管, 一旦加载到仪器中, 所有步骤都是在没有人的手干扰的情况下执行的, 需要2小时50分钟才能完成运行。该技术可用于研究大鼠产后立即发育和广泛的基因操纵小鼠模型。
利用这一技术, 研究了 ot 在细胞水平上的影响, 特别是在出生和喂养之间的非常关键的时期, 当 otr 在上皮8中最大表达时.以前已经证明了 ot 对37细胞中和体内13细胞中细胞信号分子的调节作用。在本研究中, 在富含 otr 的大脑区域评估了在肠道细胞中观察到的影响。bip-grp78 和 p-eif2a 的表达在未启动的 (与预期的应力反应一致) 中被放大, 并在启动的 nts 组织中被抑制 (与对应力的衰减反应一致), 而 nf-行在这两种情况下都是高而稳定的38. 在其他测试区域, 在未启动和启动条件下, bip 和 nf-kb 的表达相同。eif2a 在 son、cx、str 和 mpo 中由 dsrna 依赖性激酶 (ppkr) 磷酸化。然而, 在 nts 中, 在较小程度上在 pvn 中, eif2a 被另一种激酶磷酸化, 一般控制非接触-2 激酶 (gcn2)。图 7描述了牛初乳暴露引起的大脑和肠道信号信号的假设差异示意图。
这种微解剖技术可以测试与新生儿大脑中富含 ofr 的离散核中的第一个初乳饲料对压力相关信号的影响有关的假设。这一数据表明, 以前在新生肠道肠细胞中观察到的应力调节机制反映在富含 otr 的特定大脑区域, 如 nfkb (pvn、son cx、str 和 mpo) 的细胞质保留量增加就表明了这一点。结果还表明, nts 和 pvn 利用不同的磷酸化机制, 从其他地区, 可能是难治性的营养不足的影响。总体而言, 数据表明, 在相同条件下, 大脑中与分娩后最初几个小时的营养和激素功能不全相关的细胞信号类似于肠道中的细胞信号。这一数据支持了母乳在出生时对肠道和大脑压力调节的重要性。这些结果突出表明, 需要进一步探讨初乳对大脑功能的影响。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢马农·游侠和亚历山大·舒尔茨在编写本议定书方面提供的协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bradford solution | Bio Rad | ||
| Protein lysis kit | Protein simple | CBS403 | Bicine/CHAPS |
| WES kits | Protein simple | WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07) | |
| anti-mouse IgG HRP conjugate | Protein simple | ||
| Rabbit anti-phospho-eIF2a | Cell Signaling technology | SER51, 9721 | |
| mouse mAb anti-PKR | Cell Signaling technology | 2103 | |
| Rabbit anti-phospho-PKR | Millipore | Thr451, 07-886 | |
| Rabbit mAb anti-PKR | Cell Signaling technology | 12297 | |
| rabbit mAb anti-GAPDH | Cell Signaling technology | 2118 | |
| mouse mAb anti-phospho-IKB | Cell Signaling technology | 9246 | |
| mouse mAb anti-IKB | Cell Signaling technology | 4814 | |
| rabbit anti-BiP | Cell Signaling technology | 3183 | |
| Rabbit anti GCN2 | Cell Signaling technology | 3302 | |
| Rabbit mAb anti-phospho-GCN2 | BIORBYT | T899 | |
| pregnant Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories | ||
| Punch device | WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core | 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50 |
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