Summary
여기, 우리가 제시 첫 초 유 먹이와 함께에서 신생아 쥐 뇌에서 뇌 핵을 분리 하는 프로토콜. 이 기술은 뇌에 영양소 부족 스트레스 연구를 enterocyte 신호에 의해 조절 되 있습니다.
Abstract
이 프로토콜의 목표 처음 초 유 수 유 전후 신생아 뇌에서 옥 시 토 신 수용 체 부유한 두뇌 핵을 분리 하는 것입니다. 대사 스트레스에 반응으로 알려진 단백질의 식 서 부 럽을 사용 하 여 뇌 핵 격리에서 측정 했다. 이 본문에 대사 스트레스 유발 영양소 부족 신경 스트레스 발생 여부를 평가 하기 위해 수행 되었다. 우리는 이전 신생아에서 영양 부족에에서 대사 스트레스 elicits 증명 하고있다. 또한, colostrum oxytocin 신생아 쥐 직감 villi 이전 및 첫 번째 피드 후에 세포질 긴장 응답, 염증, 및 autophagy 마커를 조절 한다. 바인딩과 그물 스트레스와 관련 된 단백질 마커 신호 [응급실 보호자 바인딩 면역 글로불린 단백질 (BiP), 번역 진 핵 개시 요인 2A (eIF2a), 및 eIF2a 키 니 아 제 단백질 키 니 아 제 R (p-PKR)], 2 뿐만 아니라 염증 신호 단백질 [핵 요인-κB (NF-kB)와 억제 물 κB (IkB)], 신생아 뇌 핵에서 측정 되었다 [독방 관 (국세청), paraventricular 핵 (PVN), 위에 광학 핵 (아들), 피 (CX),가 핵 (STR), 핵 및 중간 preoptic 핵 (MPO)] 첫 번째 피드 (colostrum에 의해 unprimed) 전에 전후 간호 (colostrum 여 액)의 시작. BiP/GRP78 및 p-eIF2a의 표현 되었고 unprimed에 upregulated downregulated 끝났다 국세청 조직에. NF-kB 낮은 되었고 두 조건에서 국세청, PVN, 및 아들에서 변경 되지 않은 반면 NF-kB (높은) CX, STR, 및 MPO 세포질에서 유지 되었다. 집단 BiP 및 p-eIF2 결과 스트레스 응답 일치 하는. eIf2a는 dsRNA 종속 키 (p-PKR)에 아들, CX, STR, MPO에 phosphorylated 됩니다. 그러나,는 NTS에서 (그리고 PVN에서 낮은 정도), eIf2a 다른 키 니 아 제, 일반 제어 nonderepressible-2 키 니 아 제 (GCN2)에 의해 phosphorylated 했다. 이전에 신생아 직감 enterocytes 관찰 스트레스 조절 메커니즘 일부 OTR 부유한 두뇌 지구에서 미러링할 나타납니다. 국세청 및 PVN 다른 지역에서 (아래 영양소 결핍) 다른 인 산화 메커니즘을 활용 하 고 영양 부족의 영향을 내 화 될 수 있습니다. 공동으로,이 데이터 영양소 부족 스트레스에 두뇌 응답 enterocytes colostrum 액에서 신호에 의해 상쇄 됩니다 나왔다.
Introduction
일-하-주 산 후의 과정을 통해 발생 하는 초기 두뇌 발달의 우리의 이해는 달리 상대적으로 작은 쥐에 있는 생활의 첫 번째 시간에 발생 하는 동적 변경의 무수 한에 대 한 알려져 있다. 핵심 과제는 신생아 쥐 두뇌와 개별 뇌 영역 또는 단일 세포를 분리 하 고 하이테크 도구에 대 한 요구의 작은 크기 되었습니다. 연구는 종종 유전자 녹음 방송 그리고 번역 하지1,2, 활성화 신호 분자의 기능 수준의 확고 한 이해를 포기 하지 않는 평가 합니다. 다른 식 식 레벨3의 정량화에 대 한 허용 하지 않는 참조 뇌 영역 immunohistochemistry를 사용 하 여 검사 합니다. 날짜 없음 연구 활성화 신호 경로 쥐 첫 번째 colostrum 빠른 격리와 희생과 단백질 표정 및 단백질 인 산화 서를 사용 하 여 측정 필요 개별 두뇌 지구에서 피드와 관련 된 검사 하고있다 럽. 뇌 서 더 오래 되 고 큰 머리에 수행 하는 동안 우리가 하지 P0 두뇌에 단일 셀 뇌 펀치를 수행 하는 참조를 확인 했습니다. 이 종이 상대적으로 작은 샘플에 단백질 발현을 측정 하는 상대적으로 낮은 펀치 기술 및 절차를 더럽혀 서를 사용 하 여 신생아 두뇌의 제한 된 영역을 격리 하기 위한 프로토콜을 제공 합니다. 이 프로토콜은 포스트 번역 상 수정 단백질 식의 평가 필요로 하는 연구 질문에 대 한 적합 한 수 있습니다 (예., 인 산화) 어떤 종류의 작은 두뇌의 상대적으로 제한 된 지역에서 제공 하는 사용자는 시각적으로 아틀라스와 식별 랜드마크 관심 뇌 영역을 식별할 수 있습니다.
이 기술은 신생아 쥐 첫 초 유 먹이 옥 시 토 신 (OT)에서 풍부한 결과로 뇌에서 발생 하는 변화를 이해 하 개발 되었다. OT는 오랫동안 우유 실망 하 고 자 궁 수 축을 자극 하는 기능에 대 한 알려져 있다. 그러나, 연장 전 지금 많은 신체 기능 및 동작4의 규정에 다양 한 역할을 재생으로 알려져 있습니다. 예, OT, 스트레스와 적응 affiliative 동작5와 함께에서 염증 반대 위 비우는 지연 고 장 전송 속도가 느려집니다. OT 수용 체 (OTR) 장 신경에 장 상피6,,78확인 되었습니다. OT의 위장 효과 초기 산 후 기간 동안 유아에 특히 중요 하다. 예를 들어, 모유 수 유 신생아 용기9,10, 상당한 양의 OT의 납기와 연결 되어 있으며 데이터 표시는 OTR 기간8유아 우유 중 십이지 장 villi에 무 겁 게 overexpressed입니다.
창 자 셀 라인을 사용 하 여 생체 외에서 실험 세포 수준에서 보여준 그 oxytocin 변조 신호 통로11,12 스트레스에 중요 한 분자 및 단백질의 번역에 규제 역 12. 이러한 연구 우유, 어머니, exogenous 옥 시 토 신 등의 구성 요소는 세포 스트레스13을 줄이기 위해 신생아에 펼쳐진된 단백질 응답에서 중요 한 것이 좋습니다.
Vivo에서 그리고 생체 내 전 연구 colostrum OT 신생아 쥐 직감 villi에 세포질 긴장 응답, 염증, 및 autophagy 마커 변조 나타났습니다. 신생아 enterocytes 고통을 luminal 그들 측에 상당한 세포 스트레스 용기 colostrum14,15 및 OT9 과 같은 호르몬을 포함 하 여 수많은 단백질에 어머니 로부터 microbiota에 동시에 노출 되 면 , 10 , 16.
OT의 효과 뇌에 공부17되었습니다. 그러나, 이른 출생 후 기간 동안에 보여주었다 OT 신호 메커니즘 있다 하지 두뇌에서 연구 되었습니다. 이 종이에 신생아 쥐 brainstem에 시상 하 부 전기 이동 법을 사용 하 여 개별 뇌 핵을 분리 하는 방법 고립 된 뇌 영역을 프로 파일링 하는 데 사용 됩니다. 이 방법의 전반적인 목표는 두뇌 지역 출생, 유아, 최저 폐해/신경 인덱스와 뇌 조직에 첫 번째 우유 전후에 최대한 가까이에서 신호 하는 세포의 상태를 캡처. 이 기술 개발에 대 한 근거는 ex vivo 연구는 자동화 된 서 부 럽을 사용 하 여 신경의 더 균일 컬렉션 신생아 강아지에서 제한, 미세한 뇌 영역의 급속 한 격리에 대 한 허용 방법론, 상대적으로 작은 해 부 샘플에 매우 일관 된 결과 제공. 이전 작업의 단점에는 더 심한 해 부 (뇌 조각 또는 뇌)와 더 오래 된 동물18,19포함 되어 있습니다. 젊은 새끼의 두뇌는 매우 동적, 파도 출생 후 glial 차별화의 특징입니다. 강아지의 첫 번째 먹이 의해 영향을 하는 두뇌 변화를 공부 하기 위하여 재현 해 부와 제한 신경 핵을 공부는 필요 합니다.
두뇌 개발 뇌 영역에 미치는 영향 거의 공부 하는 반면 우유 피드 일반적으로 (예를 들어 enterocytes20,21), 건강 또는 유전자 표현에 미치는 면역과 영양 영향에 대 한 분석 이다. 뇌 기능에 용기에 우유 운송의 효과 직감 cholecystokinin 수용 체 vagal 릴레이 세포내 신호 통로22하지만 뇌 간 핵에 관하여 분석 했다. 임신23, 동안 어머니의 영양 부족에 개발 신생아 두뇌의 취약성에 광대 한 문학이 있다 하지만 스트레스와 염증 신호를 다루지 않습니다. 중요 한 것은, 현재 메서드는 내장 자극의 vagal 릴레이에서 혈액 태어난 colostrum 자극 격리 하루 0 쥐 신생아에서 현상 이용 합니다. 이것은 소위 스트레스 hypo-응답 기간 미 성숙한 핵 tractus solitarius (국세청)에 의해 특징 이다-국세청, paraventricular 핵 (PVN)을 제한 하는 출생24,25 직후 hypothalamic 회로 및 supraoptic 핵 (아들) 혈액 태어난 자극에 신호.
이 방법은 여러 신호 통로의 분석에 대 한 유용 하 고 상대적으로 제한 신경 세포는 뇌 조직 쥐, 치료의 어떤 종류 또는 어머니는 도전 여부 이외에 출생 후 하루-0에서 수확 동안에 임신. Colostrum 미리 신호 먹이 대 공급의 효과 대 한 새끼를 분석할 수 있습니다. 풍부한 단백질 수율 대 가난한 뇌 영역 사이의 신호를 비교할 때이 메서드는 모세 혈관 단백질 항 원의 면역 정량에 병렬 실행의 polypeptide 밴드의 총 단백질의 모 세관에 결정을 수 있습니다. 이 메서드는 표준 양적 곡선 없이 같은 항 체와 모 세관 당 총 단백질에 대 한 참조를 얻은 결과의 임의의 단위를 사용 하 여 양적 비교 수 있습니다. 다른 항 체에 의해 얻은 결과 비교 하는 것은 양적 표준 곡선을 사용 하 여만 가능 합니다.
이 메서드는 양방향 신호 용기와 뇌 간에 발생 함수 두 기관26에 영향을 미칠 수의 평가 대 한 허용. 광범위 하 게 공부 하고있다 최근 몇 년 동안27, oxytocin 및 음식 섭취 사이 협회 증가 oxytocin 신호 및 양분 가용성 사이의 링크를 지원 합니다. 이러한 연구도 대화 개념 적자 hypothalamic oxytocin 신호에 감소와 함께 결합 된다 에너지를 지원 합니다.
두뇌 활동에 OT의 효과의 이전 학문 유도 창 자 염증 vagotomy28내 화물 있던 hypothalamic PVN, 편도, 및 piriform 피 질에 cFos 전사 elicited 설명 했다. 그러나, secretin와 OT의 조직의 주입 뇌 cFos 응답28창 자 자극된 염증 반응으로 감소. 이 외 인 OT의 효과 vagal 릴레이, 지역 postrema6,29통해 수행 하는, 혈액을 매개로 한 신호 분자를 통해 가능 하 게 다른 경로 의해 실시 됐다 제안 했다.
이 연구에서 이전에 관찰 세포 스트레스 신호 경로 두뇌에서 평가 됐다. 가설 우유 구성 요소 보호 하거나 미생물 및 다른 대사 산물을 창 자 침투성에 염증의 영향을 지연 및 차례 차례로,에 효과 두뇌 기능 이었다. BiP colostrum13, 못쓰게 전후 villi, 있는 신호 대 IkB 명확한 대립 차이 여전히 개발 하는 과정에서 신생아의 두뇌가 colostrum 유도 직감 신호 감지 수 있습니다 제안 했다.
바인딩과 그물 스트레스와 관련 된 이전 용기 실험에 사용 하는 신호 단백질 마커를 측정 했다. 그들은 응급실 보호자 BiP, 번역 개시 인자 eIF2a (는 스트레스 응답 통합자30역할), eIF2a 키 니 아 제 p 포함-PKR, 그리고 두 염증 신호 단백질 (NF-kB와 그 억제제, IkB).
6 뇌 영역 성인 분 비 또는 OT에 응답에서 자신의 능력에 따라 선택 되었다. 국세청, 위 정도에 위치한 내장 입력의 첫 번째 릴레이 이며 직접 용기31 및 가능 하 게 혈액 태어난 cytokines, 독 소, 그리고 인접 한 지역 postrema32통해 호르몬 vagal 감각 신경 세포에서 신호를 받습니다. PVN, supraoptic 핵 (아들)가 핵 (STR), 대뇌 피 질 (CX), 그리고 중간 preoptic 핵 (MPO)는 국세청을 통해 창 자에서 신호 수신.
결과 즉시 산 후 기간 동안 colostrum 못쓰게 이전 직후 첫 번째 먹이 국세청 PVN과 아들에 비해 다른 세포 스트레스 반응을 보여주었다. CX에 신호, STR, 및 MPO 달랐다 PVN과 아들에서 뿐만 아니라. 이전 셀 스트레스와 염증에에서 변조 표시 OT의 고유 보호 기능은 가능성이 뇌의 일부 지역에 의해 감지 됩니다. 공동으로, 데이터는 세포 수준에서 출생, 후 첫 번째 시간 동안 두뇌 응답 영양소 부족와 관련 된 대사 스트레스를 나타냅니다. 데이터는 또한 피드 colostrum의 변조 효과의 방향과 범위는 지역에 따라 다릅니다 및 일부 지역에서 그들은 이전에 표시 된 OT 효과 거울을 보여줍니다.
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Protocol
이 연구는 기관 동물 관리 및 사용 컬럼비아 대학과 뉴욕 주립 정신 연구소에서 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 조직 준비
- 공급 업체에서 초과 임신 쥐를 주문.
- 따라 초과 임신 쥐 주 그들의 도착 후에 그들의 성장 인체를 관찰 하 고 그 후 찾고 새끼 예상된 배달 날짜에 감 금 소를 검사 하 여 모든 2 시간 배달 시작 될 때까지.
- Timeli는에 설명 된 대로 그들의 첫 번째 피드 unprimed 새끼 (아니 흰 우유 배는 명백한 복 부를 볼 때) 또는 (이때 흰색 위 표시 됩니다 그들의 복 부에) 끝났다 새끼에 대 한 첫 번째 피드 후 전에 그들의 꼬리에 의해 장갑 낀 손으로 새끼를 제거 네브라스카 (그림 S1)입니다.
참고: 첫 번째 colostrum 피드는 되 나 못쓰게 강아지; 따라서, 강아지 되지 않습니다 끝났다 후 초 유 액은 첫 번째 피드까지. - 신속 하 게 선명 하 고 깨끗 한 수술가 위를 사용 하 여 unanesthetized 강아지 목을 벨.
- 코에 중간 및 두개골의 윗 표면 아래로 피부를 절단 하 여 뇌를 제거 합니다. 그런 다음 집게를 사용 하 여, 부드럽게 놀 리 려 멀리 뼈 뇌 (그림 1A)를 노출 하 고 지역화 bregma, 뼈 격판덮개 제거 펜으로 표시 (그림 1B).
- 빠르게 실내 온도 (그림 1C)에 부 러 뜨 리는 혀끝에 대 한 실 온에서 polymethyl 메타 크리 레이트 뇌 형에서 전체 뇌를 놓습니다.
- 지체 없이 500 m m 두꺼운 조각 신선한 면도날을 사용 하 여 확인 합니다. Rostral 섹션 (그림 2)의 방향을 유지 하기 위해 페 트리 접시에 꼬리를 조각 하다.
- 신속 하 게 인공 뇌 척수 (실제, 1.0 m m KH2포4, 26mm NaHCO3, 118.6 m m NaCl, 3.0 m m KCl, 203.3 m m MgCl2-6 H2O) 없이 포도 당을 추가 하 고 끊임없이에 감동 28-30 ° C에서 60 분에 대 한 슬라이스를 품 어는 metabolically과 차동 초 유 액 조직 대는 unprimed 도전 쉐 하이 궤도 커
- 조직 섹션에 뇌 아틀라스33 와 해부학을 사용 하 여 펀치 하는 데 필요한 뇌 핵을 식별 합니다. 페 트리 접시에 관심의 핵이이 슬라이스를 놓고 해 현미경을 이동 합니다.
- 시각, 일단 신속 하 게 일관 되 게 가장 문제의 핵 펀치 크기 coring 도구를 사용 하 여 6 다른 핵의 4 하 고 다음으로 샘플 (그림 2) 사이 밖으로 펀치를 합니다.
참고: 나머지 뇌 조각 지금 해야한다 구멍 뇌 조직의 제거 되었습니다. 이 연구에서 우리는 사용 하 여 다음 핵 excised는 좌표 아래. 모든 앞쪽/후부 (A / P) 좌표는 (를 제외 하 고 국세청은 창포 Scriptorius에 관하여) Bregma에서. 모든 지 느 러 미/복 부 (D/V) 좌표는 (국세청, 모 수의 표면에서)를 제외 하 고 피 층의 표면에서. 다음 좌표 포함 A / P, 중간/측면 (M/L), 및 D/V m m에서: 1) 독방로 핵 (국세청, A / P, 0.4 0.8; L, ± 0.2; D/V, 0.3 (모 수의 표면)에서 2) paraventricular 핵 (PVN,-0.8; ± 0.2; 0), 3) 위에 광학 핵 (아들,-1.1; ± 1.4; 4.3), 4) 피 질 (CX, 부분 피 질 영역 1,-2.8; ± 1.5; 0.6), 5)가 핵 (STR,-0.0; ± 1.6, 1.8), 6) 중간 preoptic 핵 (MPO,-0.6; ± 0.2; 4.2). - 빠르게 60 분 (2.3 단계 참조)에 대 한 protease 억제제와 인산 가수분해 효소 억제제를 포함 하는 얼음, 단백질 추출 버퍼의 0.06 ml에서 천공된 핵 담가.
2. 단백질 추출
- 예상된 강아지 배달 하기 전에 하루에 단백질 세포 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 단백질 추출 솔루션을 준비 합니다.
- 세포의 용 해 버퍼 키트의 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제의 냉동된 (-20 ° C) 용액 (얼음)에 thaw 고 얼음에 세포의 용 해 버퍼 및 프로 테아 제/인산 가수분해 효소 억제제의 DMSO 솔루션을 놓습니다.
- 깨끗 하 고 차가운 15 mL 튜브에 세포의 용 해 버퍼의 1.85 mL를 추가 합니다. 그런 다음, 억제제의 수성 해결책의 DMSO 녹 억제제의 0.05 mL 0.1 mL를 추가 합니다. 마지막으로, 모자 하 고 간단히 소용돌이 튜브 사용까지-20 ° C에서 그것을 유지.
- 24 깨끗 한 microcentrifuge 튜브 (각 0.5 mL)는 세포 절차에 대 한 레이블을 지정 합니다. 지정 12 colostrum unprimed 그룹 (U) [6 왼쪽 (L)와 6 오른쪽 (R) 뇌 핵], 그리고 핵 약어에 따라 라벨에 대 한 뇌 당 측면, 및 조건 (예., 국세청-L-U, 국세청-R-U, 등). 초 유 액 샘플 12 관의 두 번째 그룹 레이블을 지정 합니다.
- 레이블 튜브의 두 개의 추가 세트 단계 2.4 재고 단백질 추출 물 (1.5 mL Eppendorf 스타일 튜브를 사용 하 여)에 대 한 샘플 준비 (0.5 mL 튜브를 사용 하 여)의 첫 번째 집합에 대 한에서 다. 두 개의 별도, 레이블이 냉동 상자에 (각각 100 튜브에 대 한 설계)이이 관을 유지. 한 상자 unprimed 예제 및 끝났다 샘플에 대 한 다른 사용 됩니다.
- 새끼, 전달 당일과 실제, (2.4 단계)에서 세포 절차 튜브에 aliquot 0.06 mL 세포 솔루션에에서 뇌 조각 잠복기 동안 얼음에 세포의 용 해 솔루션을 녹여 및 핵 펀치를 추가 하 고 60 분 동안 얼음에서 품 어.
- 14000 rpm (10000 x g) 냉각된 미니 원심 분리기에서 30 분 동안 incubated lysed 핵 원심 하 고 신중 하 게 발음 제대로 설정된 피 펫과 상쾌한 0.055 mL. (2.5 단계)에서 주식 사전 냉각된 1.5 mL 튜브에는 상쾌한을 전송 하 고 얼음에 넣어. 냉동 (-20 ° C)에서 단백질 재고 튜브, 전에 (2.5 단계)에서 첫 번째 견본 준비를 위한 사전 냉각된 0.5 mL 튜브에 상쾌한의 0.012 mL를 전송 하 고 얼음에 그들을 두고.
3. 모 세관에 단백질 측정을 위한 샘플 준비
- 키트를 사용 하 고 제조업체의 지시에 따라 분리 된 시 약 준비. 0.5 mL 튜브 (2.5 단계)에서 얼음의 단백질 추출 물 0.012 mL를 포함 하는 분류에 12 샘플의 각각의 마스터-혼합 시 약 0.003 mL를 추가 합니다.
- 95 ° C에가 열 블록 켜고 0.004 mL 단계 3.1 이온된 물 0.016 mL 튜브에 biotinylated 분자 무게 (MW) 사다리에서에서 준비 하는 시 약의 추가. 사다리와 샘플 변성을 사다리 튜브와 unprimed 단백질 추출 물 12 샘플 5 분 동안 95 ° C에서 열 블록에 놓고 사용까지 4 ° C에서 그들을 저장 합니다.
- 초 유 액 쥐에서 패는 핵에 대 한 샘플 준비, 단백질 추출에서 2.0을 3.2, 단계를 반복 합니다.
4. 전기 준비
- 시 약 (-80 oC에서 깊은 냉동 실에 저장) 벤치에 라벨 biotin을 해 동 하 고 제조자의 방향 다음 4 ° C에서 얼음에 단백질 검출 키트 준비.
- 과산화 수소의 0.15 mL와 luminol 0.15 mL를 혼합 하 고 자동화 된 서쪽 기계에 대 한 판의 25 우물 (행 E, 우물 1-25) 0.01 mL 로드. Streptavidin HRP의 0.008 mL에서에서 로드 키트 우물 D1으로 D25
- 웰 스 C1 C25와 B1 항 체 희석제 솔루션의 0.01 mL 로드.
- 스핀 24 단백질 샘플 및 사다리 튜브를 짧게 (2-3 초)는 minicentrifuge에서 증발된 물 아래로 풀 튜브 모자에서.
- A13, A14 A25에 우물에 12 초 유 액 샘플의 0.003 mL을 잘 a 1으로 biotinylated 사다리의 0.005 mL 웰 스 A2 12 unprimed 샘플의 0.003 mL 로드.
- 행 F 비어 두고 0.45 mL 워시 버퍼의 각 행 F. 커버의 플라스틱 뚜껑 접시 나머지 절차 동안 증발을 피하기 위해 아래 3 행에서 5 구획의 각 로드.
- 짧게 소용돌이 해 동된 biotin 라벨 시 약 및 그것의 지정 된 관; 시의 0.15 mL를 추가 그런 다음 총 단백질 재구성 에이전트의 0.15 mL를 추가 하 고 동질성을 혼합.
- 접시에서 덮개를 제거 하 고 에이전트 1 및 2의 0.01 mL 웰 스 B2 B25 로드. 접시를 커버 하 고 다양 한 솔루션에서 모든 기포를 제거 하려면 1000 x g에서 10 분 원심. 빈 접시를 사용 하 여 균형을 위한 원심 분리기에서.
5입니다. 전기 이동 법
- 접시를 회전 하는 동안 총 단백질 분석 실험을 실행 하려면 "파일"에서 드롭 다운 페이지에 나타내는 각각의 자리를 클릭 하 여 자동된 서양 기계에 연결 된 컴퓨터에서 실행된 파일을 엽니다.
- 주석을 잘 컴퓨터에서 샘플. 그런 다음 분리기 제거 덮개에서에서 접시를 제거 하 고 신중 하 게 분리 솔루션 구획에서 알루미늄 덮개를 벗기다.
- 자동된 서양 악기에 접시를 놓고, 모 세관 카트리지 상자에서 덮개를 벗기다 그것의 지정 된 장소에 카트리지를 삽입 하 고 문을 닫고.
- "실행" 버튼을 클릭 하 고 분석 결과 (이 하 "총 단백질")의 형식으로 메시지가 나타나면 예제 이름을 입력 (예를 들어 "2-13과 초 유 액 14-25" unprimed). "확인"을 클릭 하 고 나타나면 활성화 된 실행된 날짜 및 실행된 파일의 ID 번호를 적어 때 실행 종료 하는 시간.
- 실행 시작 후 (170 분)의 끝에, 악기 문, 모 세관 카트리지 제거 열고 sharps 처리에 그것을 삭제 합니다. 생물 학적 문제 처리에 접시를 삭제 합니다.
- 실행된 파일의 분석 페이지에서 분리 곡선 아이콘을 클릭 하 고 확인 모든 샘플 제대로 실행 하 고 모든 모세 혈관에 여러 단백질 곡선을 보이고 있다.
6입니다. 신호 단백질의 분석
- 레이블이 지정 된 1.5 mL 튜브에 안티 인-eIF2a (p eIF2a) 항 체는 토끼의 0.003 mL을 추가 하 고 항 체 적당 한 검출 키트에서 희석제에 0.3 ml (1: 100 희석) 일시 중단. 다음, 얼음에 그것을 유지.
- Luminol 튜브 라벨 및이 탐지 모듈 키트에서 0.15 mL luminol 그리고 과산화 수소의 0.15 mL를 추가 하 고 신선 하 고, 자동화 된 서양 접시의 E25 우물 E1으로 0.01 mL를 분배.
- D25, 하 웰 스 d 2로 토끼 항 체 안티 보조의 0.01 mL를 분배 하 고 잘 D1을 키트에서 streptavidin HRP의 0.01 mL를 추가 합니다.
- 분배는 기본 항 체 (단계 6.1)에서 우물 C2에 C25, 0.01 mL 고 웰 스 C1 및 B1 B25 ~ 항 체 희석제 2 솔루션의 0.01 mL를 추가 합니다.
- 행 F 웰 스 비어 두고 F 행 아래 3 행의 5 구획으로 워시 버퍼의 0.45 mL를 채우기.
- 짧게 스핀 3 냉장된 샘플 s, A25 a 2에서 시작 총계 단백질 분석 결과 대 한 추가 된 동일한 순서로 행 A에 각 샘플의 0.003 mL을 추가. A 1을 잘 하 여 접시 커버 biotinylated MW 사다리의 0.005 mL를 추가 합니다.
- 단계 4.8에서에서 다 격판덮개 원심. 접시를 회전 하는 동안 (자동된 서양 관련 소프트웨어 및 컴퓨터)에 새로운 실행된 파일 열고 분자 크기 분석 결과 각각 자리를 클릭 하 여 실행 하려면 "파일"에서 드롭 다운 페이지에 표시 합니다.
- 분석 결과 페이지에서 각 모 세관에 예제 이름을 입력 다음 할당 된 자리와 아래 보조 안티 토끼 항 체에 주 항 체의 이름을 입력 합니다.
- 원심 분리의 끝에,이 시간 실행된 파일에 지정 된 이름 "p-eIF2a unprimed 2-13 및 14-25 초 유 액" 이어야 한다를 제외 하 고 단계 5.3-5.5를 반복 합니다.
- 전기 이동 법 별거 후 40-43 kDa의 크기에서 항 원의 면역 반응 피크에 대 한 실행된 파일을 확인 합니다. 봉우리의이 크기는 누락, 곡선 아래 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 크기와 곡선 아래 임의의 수량 기록 됩니다 보장 피크에 MW를 추가 하려면 드롭다운 목록 내의 나타냅니다.
7. 처리 결과
- 오픈 총 단백질에 대 한 스프레드시트 파일 자동된 서쪽에서 실행 파일을 실행 하 고 ID 번호를 제공 합니다.
- 곡선 모드에서 분석 페이지에서 전체 단백질 분석 실험의 실행된 파일 열고 개별 모 세관의 모든 봉우리를 표시 합니다. 그런 다음 복사 하 고 스프레드시트에 붙여넣을 전체 모 세관에 기록 된 모든 봉우리의 곡선 아래의 영역 합계.
- 별도 열에 모 세관 숫자, 각각 뇌 핵 및 실행된 파일의 ID 번호와 함께 각 열에 대 한 단백질의 총 금액을 정렬.
- 단일 열 및 p-eIF2a 항 원에 대 한 스프레드시트를 열고, 각각 모 세관 수, 뇌 핵, 및 실행된 파일의 ID 번호의 이름을 각 모 세관-의해-측면에서 곡선 아래의 영역을 기록.
- 세 번째 스프레드시트에 총 단백질 열 (p eIF2a 곡선 수량에 평행)를 복사 하 고 p를 계산-제 3 열에 eIF2a:total 단백질 비율.
- 단계 4 ~ 6 각 뇌 핵에서에서 결과 수집 하 고, 핵의 그룹에서 그들을 주선 한 막대 그래프를 생성.
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Representative Results
총 단백질 기준으로 immunoreactivity의 대표 밴드 매우 낮은 수확된 단백질으로 뇌 핵이 다는 것을 보여줍니다. 이 정식 서쪽 오 점에 비해 매우 중요 한 자동화 된 서쪽 오 점 기술 사용을 해야 합니다. 이 방법은 모 세관 당 레인 서쪽 오 점에 비해 당 더 적은 fortyfold 단백질으로 실행할 수 있습니다.
뇌 핵에서 BiP 수준에 colostrum 못쓰게의 차동 효과
쥐 두뇌의 코로나 섹션 첫 번째 colostrum (unprimed) 수 유 전후 첫 번째 먹이 (액)를 수확 했다. 샘플 했다 분류 한 모 세관 전기 이동 법 (웨스)에 의해 고 단백질 (프로토콜 참조) 모 세관에서 총 단백질 얼룩에 대 한 키트를 사용 하 여 계량 했다. 추가 면역 모 세관 분류 자동화 된 서쪽에는 각각 단백질 항 원의 식별 제공. 그림 3A에서 대표 BiP 단백질 표정 아래 해당 총 단백질 위쪽 패널에 표시 됩니다. BiP는 응급실 보호자 단백질 이다. 그림 3B에 quantitated immunoreactivities 해당 총 단백질 상대적인 막대 그래프 제시 됩니다.
Unprimed 조직 샘플 내에서 국세청에 BiP 수준 상당히 높은 비교 했다 다른 모든 지역에 (p < 0.05, n = 4 핵). 못쓰게 colostrum와 창 자 조직의 증가 BiP unprimed 조직 (그림 3B)를 기준으로 다른 지역에 비해 국세청에 반대의 효과 했다. 못쓰게는 BiP 국세청 (그림 3B) 감소 했으며 PVN SOPT에 영향을 주지 않습니다. 그러나, 못쓰게 unprimed 조직의 상대적인 CX, STR, MPO BiP 증가. 이 데이터는 다양 한 테스트 뇌 핵에서 BiP 수준 응답 다르게 직감 못쓰게 하는 거기 아직 어떤 시연된 잡담 테스트 하는 다양 한 핵 사이 의미 합니다.
뇌 핵에서 ElF2a 및 p-elF2a 수준에 colostrum 못쓰게의 차동 효과
뇌 조직 샘플 준비, 분석, 되었고 그림 3A 와 3B에서 같이 계량. BiP 수준 (그림 3B), elF2a 및 p-elF2a 국세청에서 수준 되었다 (그림 4B 와 4c) 다른 핵 상대적인 unprimed 상태에서 상승 됩니다. BiP 수준 같이, colostrum과 창 자 조직의 못쓰게 하 국세청에 응답 다른 핵에 반대 이었다. ElF2a과 p-elF2a 국세청에서 unprimed 조직에 상대적으로 감소 되었다. 다른 모든 테스트 핵에서 elF2a 및 p-elF2a unprimed 조직 (그림 4B 와 4c) 상대적인 증가 수준을 못쓰게.
Colostrum 못쓰게 후 국세청에 PVN 키 GCN2에 의해 elF2a의 인 산화
뇌 조직 샘플 준비, 분석, 되었고 그림 3에서처럼 계량. PVN에서 고 인된 p-PKR 못쓰게 (χ2 p = 0.025), 달리 어디 증가 했다 다른 모든 지역에서. P-elF2a 반대 결과 (그림 4C), 레벨 p PKR의 국세청 (그림 5A) 끝났다 샘플 상대적인 unprimed 샘플에 낮은 했다. ElF2a의 인 산화는 일반적으로 촉매는 키 PKR 바이러스34 응답에서 및 OT 용기, 이전 시연된11로. 그러나, 사실은 p-PKR 레벨에서 매우 낮은 unprimed 끝났다 국세청 (다른 핵 그림 5A) 기준 대 강력 하 게 제안 elF2a phosphorylating에서 다른 키를 포함 해야 합니다 (그림 4C). 따라서 그것은 또한 elF2a35의 알려진된 키 때문에 국세청에 PVN GCN2 레벨 테스트 되었습니다. P-GCN2 (활성 폼)의 레벨은 국세청 및 PVN (그림 5B), 및 GCN2에 끝났다 샘플에 비해 unprimed 샘플에서 높은 (비활성 양식), p에 비해-GCN2, 반대로 PVN (그림 5C)에서 표현 했다. 국세청 (그림 5C) pGCN2 unprimed와 끝났다 국세청에서 pPKR (그림 5A)를 반대로 표현 했다. 끝났다 조직에서 p-eIF2a는 모든 다른 두뇌 지역에 보다 국세청에서 상당히 낮은 [PVN (p < 0.01), 아들 (p < 0.01), CX (p < 0.01), MPO (p = 0.02)]. 이 pPKR, 보다는 오히려 그 pGCN2, 했다 국세청에서 eIF2 억제에 대 한 책임을 나타냅니다.
Colostrum 못쓰게 억제 CX, STR, MPO에 NF-kB
그림 6A 쇼 IkB 레벨 했다 아들에 상당히 높은 unprimed 샘플 대 액 샘플. 아들, CX, STR, MPO에 IkB 수준 높은 같은 방향으로 줍니다. 그림 6 c, CX, STR, MPO NF kB 레벨 했다에서 상당히 높은 unprimed 조직 대 액. 그러나, NF-kB 레벨 끝났다 국세청 조직, colostrum이 두뇌 지역에 고유한 항 염증 효과 했다 제안에 훨씬 낮은 했다. Cytosolic NF-kB의 억제제 IkB 낮고 끝났다 샘플에서 변경 되지 않은 반면 (유지)에 더 높은 unprimed 국세청 샘플을 했다. 이 뚜렷한 항 염증 메커니즘 NF-kB 국세청에서 규제는 나왔다. 이 영양소 부족 스트레스 효과 스트레스 마커 BiP 및 p-eIF2a 모두 colostrum 못쓰게의 존재에 의해 규제 됩니다 현재 결과와 일치 (그림 3 , 4, 각각), 또한 이전 BiP 및 p-elF2a에 표시 된 연구 결과10. IkB NF-kB CX, STR, MPO와 비교 하는 국세청에서의 고유 응답에 대 한 이유는 아직 완전히 이해 되지. 그러나, 그것은 창 자에서 두뇌에 신호 릴레이, 국세청 주변 염증36에 비해 다른 뇌 영역 대 고유와 반대로 응답에서 중요 한 역할을 할 수 있는 관찰과 일치. CX, STR, MPO IkB의 수준 낮은 (그림 6A), NF-kB (그림 6 c) 같은 지역에서의 높은 수준에 비해. 이 분명히 전제 IkB 바인딩 이며 유지 NFkB cytosol, 다른 데이터를 결합 하 고 CX, STR, MPO 회귀 분석 프로그램을 사용 하 여 모든 액된 샘플을 비교 계산에에서는 NF-kB 매우 모순 하는 동안 IkB 상관 (p < 0.0001, n = 24)
그림 1: 신생아 쥐 뇌를 해 부. (A) 해 부 두뇌와 함께 표시 됩니다 뼈 제거 rostral bregma에. (B) 두뇌 선 후 나머지 뼈 격판덮개 제거 되었습니다 bregma에 그려 왔다 후 표시 됩니다. (C) 두뇌 면도날으로 슬라이스 되 직전 polymethyl 메타 크리 레이트 뇌 형에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 머리와 꼬리를 rostral 펀치 (빨간색 원)에서 배열 하는 조각. 약어: CX: 피 질, 두 정 엽; MPO: 중간 preoptic 지역; 국세청: 핵 tractus solitaries; PVN: paraventricular 핵; 아들: supraoptic 핵; 그리고 STR:가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 국세청에서 BiP/GRP78 응답 다른 핵의 반전 됩니다. (A) 패널 아래에 제시 하는 총 단백질 기준 상단 패널에서 대표 BiP 단백질 표정. 참고 다양 한 모세 혈관의 총 단백질 밀도 이기종,이 패널 B. (B) 표시에에서 단백질 당 각각 BiP 식 맞춰야 하는 데 사용 됩니다는 unprimed 샘플 (뇌 핵에서 총 단백질 상대적인 의미 BiP 블루) 초 유 액 샘플 (갈색) 대. 각 색상의 별표 지정 중요 한 차이 (p < 0.05, n = 4 핵) 다른 핵에 BiP 대 국세청에서 BiP 사이. BiP 식 unprimed 국세청에서 끝났다 샘플 대 크게 반전 STR에 (χ2 p = 0.028, n = 4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 활성 및 비활성 eIF2a (p eIF2a) 응답 colostrum 못쓰게 국세청 다른 핵의 거꾸로 unprimed 샘플 대. (A) 대표 eIF2a와 p-eIF2a 단백질 식이 상위 패널에 표시 됩니다. 총 단백질 레인 하단 패널에 표시 됩니다. (B) 표시는 unprimed 샘플 초 유 액 샘플 (갈색), 대 (블루) 및 (C) eIF2a의 비활성 형태의 뇌 핵에서 (낮은 패널 A)에서 총 단백질 상대적인 표현 4 샘플의 평균 eIF2a (p-eIF2a). 각 색상의 별표 지정 중요 한 차이 (p < 0.05, n = 4 핵) 사이 두 eIF2a 국세청에서 다른 핵에 각각 레벨 대. Unprimed 활성 eIF2a 식 국세청에서 끝났다 샘플 대는 크게 반전 CX, STR, 및 MPO (χ2 p < 0.05 n 모든 3 개의 핵 대 = 4). 오차 막대는 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 국세청 eIF2a 키 니 아 제 p-GCN2 p-eIF2 수준와 반대로 p-PKR 수준에 표현 한다. (A) p-PKR (eIF2a의 활성화 dsRNA 키)의 수준을 표현 된다 1에 반비례 colostrum 액 국세청 대 unprimed) p-PKR PVN에서의 수준 (χ2 p = 0.025) 2)의 인 산화 (후의 예상 타겟 기판 eIF2a p-eIF2a, 그림 2C). 참고 p-PKR, CX, STR, 아들과의 초 유 액 샘플 대 unprimed MPO에서의 패턴 그림 2C에서 p-eIF2a의 각 패턴을 맞는. (B) 그림 2C 에서 p-eIF2a 식의 비슷한 패턴 및 그림 3A 에서 pPRK 식의 역 패턴 활성 eIF2a 키 니 아 제 (p-GCN2)에 끝났다 국세청 샘플 다음과 대 unprimed (χ2 p = 0.028). C = 비활성 GCN2의 평균 수준. 오차 막대는 표준 오류를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: unprimed 및 초 유 액 용기 샘플에서 뇌 핵에서 NF-kB와 IkB의 세포질 표정. (A) 평균 세포질 식 IkB의 표시 된 뇌 핵에서 (에서 C 패널) 총 단백질 기준. (B) 대표 세포질 밴드 IkB 단백질의 위 패널과 하단 패널에서 각 차선에서 총 단백질 밀도에 표시 됩니다. (C) 평균 세포질 식 NF kB의 표시 된 뇌 핵에서 (D 패널)에서 총 단백질 기준. (D) NF kB 밴드의 대표 세포질 밴드 상단 패널, 하단 패널에서 각 차선에서 총 세포질 단백질 밀도에 표시 됩니다. 컬러 별표 지정 표시 샘플 간의 중요 한 차이 (p < 0.05, n = 4). Note는 세포질 NF kB 수준 높다 colostrum 액 CX, STR, 그리고 보다 MPO에 NF kB 억제제 (IkB)의 수준에 hypothalamic 핵 국세청, PVN, 그리고 아들에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: OT colostrum 액 용기와 두뇌 지역에서 신호 가설 구조 비교. (A) Colostrum OT enterocytes에 IkB 하류 신호 증가 통해 염증을 감소 OTR와 직접 상호 작용을 통해 그것의 수용 체 활성화. 단백질 번역 p 증가 의해 저해-PKR, 인 산화를 통해 elF2a 활동을 감소. 항상성 증가 BiP 유전자 식13,37을 통해 복원 됩니다. (B) Neuronal 또는 순환 OT는 두뇌의 CS, STR, MPO 지역에 그것의 수용 체 활성화는 직감으로 동일한 분자를 통해 downregulating 염증 및 단백질 번역 (패널 A 참조). Colostrum 못쓰게 두뇌의 국세청 지역에서의 (C)는 가설된 효과 별개 및 반대 패널 A와 B. GCN2, 아미노산 공급에 민감한입니다 그 증가 eIF2a 및 단백질 번역. 같은 시간에 IkB의 저급 NF-kB를 핵을 입력 하 여 염증 유발 수 있습니다. BiP 항상성 용기에서와 두뇌에 국세청에서 복원할 비슷하게 역할 note. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: 프로토콜 타임 라인을 보여주는 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이산의 서에 대 한 기술, OTR 풍부한 뇌 핵 신생아 쥐 두뇌에서이 문서에 제공 됩니다. 뇌에 잘 특징이 핵 내 에서도 매우 신경 전문는 잘 인식 된다. 특정 OTR이 풍부한 핵을 높은 재현성 이렇게 강력한 가설 테스트 수 있습니다. 자동화 된 서 부 럽을 사용 하 여, 일관성과 결과의 재현성 더 개량 되었다. 동안이 기술의 제한 겸손 뇌 펀치 다양성; 이 기술은 단일 셀, 전체 뇌 또는 뇌 조각 접근 미리를 나타냅니다. 단일 셀 접근은 매우 제한 된 스냅 촬영을 제공 하 여 복잡 한. 전체 두뇌를 사용 하 여, 어떤 결과 수 있습니다 희석 효과 뇌 영역 또는 신경 하위 유형을 제한 하는 경우. 기정 없이 뇌 조각 접근은 특히 뚜렷한 핵의 꽉 클러스터링으로 인해 본이 연구에서는 시상 하 부에 대 한 문제가 조각에서 단순한 미크론 이내 결과에 깊은 변화를 발생할 수 있습니다. 표준화 된 펀치와 현미경의 도움을 사용 하 여, 단백질 측정에 있는 가변성 감소 되었다.
이 프로토콜 내에서 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 준수의 첫 번째 피드 관련 조직 수확 타이밍, 분자 억제제 또는 자극 제를 사용할 수 있도록 단백질 추출 버퍼, 실제 뇌 조각의 외피의 최소한의 볼륨을 사용 하는 구분을 사용 하 여 포함 됩니다. 면역 전기 이동 장치입니다. 가능한 수정 등 보육에 대 한 시 약의 선택의 부 화와 unprimed 굶주림의 시간을 연장 기간을 동일한 시간에 두뇌를 비교할. 중요 한 한계 (이 아주 초기 신생아 기간) 중에 일부 비 신경 세포와 샘플 하루에 신생아의 한 쓰레기에서 준비 될 수 있는 제한 된 수의 존재를 포함 합니다. 또한,이 방식은 완전히 새끼는 태 어 났을 때에 의존 합니다. 기존의 방법에 관하여이 나가에 뇌의 유전자 발현은 일반적으로 그리고 더 편리 하 게 평가 transcriptional 수준. 그러나, 셀 신호 분석, proteomic 접근 핵심 시설 장비에 의해 실행 되는 데스크톱 자동된 악기 보다 더 비싸다입니다. 전통적인 서쪽 오 점 방법 훨씬 더 많은 단백질을 필요로, 몇 일 완료, 그리고 기술 인력에 의해 몇 가지 조작 단계를 포함 한다. 이 자동화 된 접근 요구 한다 모 세관 당 0.8 µ g 단백질, 단계 없이 수행 됩니다 모든 악기에 로드 되 면 인간의 간섭을 손과 실행을 완료 하는 데 2 시간 50 분 소요. 이 기술은 공부 쥐와 유전자 조작된 마우스 모델의 넓은 범위에 즉시 산 후 두뇌 개발을 위해 사용할 수 있습니다.
이 기술을 사용 하 여, 출산과 수 유, 사이의 매우 중요 한 기간에 특히 세포 수준에서 OT의 효과 OTR은 극대로 상피8에서 표현 할 때 조사 되었다. 신호 분자 모두 셀 라인37 에 vivo에서13, 창 자 세포에서 세포에 OT의 변조 효과 이전 시연 했다. 현재 연구에서 창 자 세포에서 관찰 된 효과 OTR에 풍부한 두뇌 지구에서 평가 됐다. BiP/GRP78 및 p-eIF2a의 표현 되었고 (스트레스에 대 한 예상된 응답 일치)에 unprimed upregulated downregulated 끝났다 국세청 조직 (스트레스에 대 한 감쇠 응답 일치), NF-kB 높은 되었고 두 조건에서 안정 된 반면 38. 식의 BiP 및 NF kB unprimed와 끝났다 조건에서 다른 테스트 영역에서 동일 했다. eIf2a는 dsRNA 종속 키 (pPKR)에 아들, CX, STR, MPO에 phosphorylated 됩니다. 그러나, 국세청, 그리고 PVN에서 낮은 정도로, 다른 키 니 아 제, 일반 제어 nonderepressible-2 키 니 아 제 (GCN2)에 의해 eIf2a phosphorylated 했다. 차이 두뇌에 신호에 가설 도식 묘사와 직감 colostrum 노출 elicited 그림 7에 표시 됩니다.
첫 번째 colostrum의 영향에 관련 된 가설을 테스트 가능한 신생아 뇌에서 개별 OTR-부자 핵에 신호 스트레스 관련 피드이 서 기술 메이크. 이 데이터 NFKB (PVN, 아들 CX, STR, 및 MPO)의 증가 cytosolic 보존에 의해 표시 된 대로 이전에 새로 태어난된 직감 enterocytes 관찰 스트레스 변조 메커니즘 OTR, 풍부한 특정 두뇌 지구에서 미러는 것이 좋습니다. 결과 또한 국세청 및 PVN 영양소 부족의 영향을 내 화 될 수 있는 다른 지역에서 다른 인 산화 메커니즘 활용을 나타냅니다. 공동으로, 데이터는 셀 신호는 뇌에 관련 된 영양소와 호르몬 부족 다음 출생 동일한 조건 하에서 용기에 신호 하는 세포와 유사한 첫 번째 시간 동안 나타냅니다. 이 데이터는 용기와 두뇌에 스트레스 변조에 대 한 출생의 때에 모유의 중요성을 지원합니다. 이러한 결과 colostrum 뇌 기능에 미치는 영향의 추가 탐사에 대 한 필요성을 밑줄.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는이 프로토콜을 준비 하 고 있는 그들의 원조에 대 한 마 농 레인저와 알 렉 산드라 슐츠를 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bradford solution | Bio Rad | ||
| Protein lysis kit | Protein simple | CBS403 | Bicine/CHAPS |
| WES kits | Protein simple | WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07) | |
| anti-mouse IgG HRP conjugate | Protein simple | ||
| Rabbit anti-phospho-eIF2a | Cell Signaling technology | SER51, 9721 | |
| mouse mAb anti-PKR | Cell Signaling technology | 2103 | |
| Rabbit anti-phospho-PKR | Millipore | Thr451, 07-886 | |
| Rabbit mAb anti-PKR | Cell Signaling technology | 12297 | |
| rabbit mAb anti-GAPDH | Cell Signaling technology | 2118 | |
| mouse mAb anti-phospho-IKB | Cell Signaling technology | 9246 | |
| mouse mAb anti-IKB | Cell Signaling technology | 4814 | |
| rabbit anti-BiP | Cell Signaling technology | 3183 | |
| Rabbit anti GCN2 | Cell Signaling technology | 3302 | |
| Rabbit mAb anti-phospho-GCN2 | BIORBYT | T899 | |
| pregnant Sprague-Dawley rats | Charles River Laboratories | ||
| Punch device | WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core | 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50 |
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