Vurdere mobilnettet Stress og betennelser i diskret Oxytocin-sekresjon hjernen kjerner i Neonatal rotte før og etter første Colostrum fôring

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å isolere hjernen kjerner i neonatal rotte hjernen i forbindelse med første råmelk fôring. Denne teknikken tillater studiet av næringsstoffer insuffisiens stress i hjernen som modulert av enterocyte signalering.

Abstract

Målet med denne protokollen er å isolere oxytocin-reseptor rik hjernen kjerner i neonatal hjernen før og etter første råmelk fôring. Uttrykk for proteiner som er kjent for å svare på metabolske stress ble målt i hjernen-kjerner isolerer med vestlige blotting. Dette ble gjort for å vurdere om metabolske stress-indusert næringsstoffer mangel i kroppen utløst neuronal stress. Vi har tidligere vist at næringsstoffer mangel i nyfødte utløser metabolske stress i tarmen. Videre modulerer råmelk oksytosin mobilnettet stress respons, betennelse og autophagy markører i nyfødte rotte gut villi før og etter første feed. Signalisering protein markører tilordnet endoplasmatiske retikulum stress [ER Anstandsdame bindende immunglobulin protein (BiP), eukaryote oversettelse initiering faktor 2A (eIF2a), og eIF2a kinase protein kinase R (p-PKR)], og to betennelse-signalisering proteiner [kjernefysiske faktor-κB (NF-kB) og hemmer κB (IkB)], ble målt i nyfødt hjernen kjerner [kjernen av enslig skrift (NTS), paraventricular kjernen (PVN), supra-optisk kjernen (sønn), cortex (CX), striatum kjerner (STR), og mediale preoptic kjernen (MPO)] før den første feeden (unprimed av råmelk) og etter starten av sykepleie (primet med råmelk). Uttrykk for BiP/GRP78 og p-eIF2a var upregulated i unprimed og downregulated i primet NTS vev. NF-kB ble beholdt (høy) i CX, STR og MPO cytoplasma, mens NF-kB var lavere og uendret i NTS, PVN og sønn i begge betingelsene. Den kollektive BiP og p-eIF2 funn er i samsvar med stressrespons. eIf2a var fosforylert av dsRNA avhengige kinase (p-PKR) i sønn, CX, STR og MPO. Men var i NTS (og i mindre grad i PVN), eIf2a fosforylert av en annen kinase, generalen nonderepressible-2 kinase (GCN2). Stress-modulerende mekanismer tidligere observert i nyfødte gut enterocytes synes å gjenspeiles i noen OTR-rik hjernen regioner. NTS og PVN kan bruke en annen fosforylering mekanisme (under næringsstoffer mangel) fra andre regioner og være gjenstridig å virkningen av næringsstoffer mangel. Samlet tyder disse dataene på at hjernen Svar å næringsstoffer insuffisiens stress er forskjøvet med signalene fra råmelk-fylt enterocytes.

Introduction

I motsetning til vår forståelse av tidlig hjernens utvikling skjer i løpet av dager til uker postpartum, er relativt lite kjent om mylderet av dynamiske endringer forekommer i de første timene av livet i rotter. En viktig utfordring er den lille størrelsen på neonatal rotte hjernen og en forutsetning for high-tech verktøy å isolere diskret hjernen regioner eller enkeltceller. Studier vurdere ofte genet transkripsjon og ikke oversettelse^1,2, som ikke gir en solid forståelse av funksjonelle aktivert signalnettverk molekyler. Andre undersøke uttrykk med immunohistochemistry til referanse hjernen områder, som ikke tillater for kvantifisering av uttrykket nivå³. Ingen studie hittil har undersøkt aktivering av signalnettverk trasé forbundet med rotter første råmelk feed i diskret hjernen regioner, som krever rask isolasjon og offer og måling av protein uttrykk og protein fosforylering bruker Western blotting. Mens hjernen microdissection utføres på eldre og større hjerner, har vi ikke funnet en referanse utfører en ikke-enkeltcelle hjernen punch i P0 hjernen. Dette dokumentet presenterer en protokoll for å isolere begrensede områder av neonatal hjernen ved hjelp av en relativt low-tech punch teknikk og en vestlig blotting prosedyre for å måle protein uttrykk i relativt små utvalg. Denne protokollen kan være passende for forskning spørsmål som krever vurdering av protein uttrykk og post-translasjonell modifikasjoner (f.eks., fosforylering) i relativt begrensede områder små hjerner av alle arter, forutsatt at det brukeren kan visuelt identifiserer hjernen regionen rundt med en atlas og identifiserbar landemerker.

Denne teknikken ble utviklet for å forstå endringene skjer i hjernen som følge av neonatal rottene første råmelk feed, som er rik på oksytosin (OT). OT har lenge vært kjent for sin evne til å stimulere melk laktasjon og livmor sammentrekning. Men er OT nå kjent for å spille et bredt spekter av roller i regulering av mange kroppsfunksjoner og atferd⁴. For eksempel OT motsetter stress og betennelse i forbindelse med adaptive affiliative atferd⁵forsinkelser mage tømming og bremser intestinal transitt. OT reseptorer (OTR) har blitt identifisert i enteric nevroner og intestinal epitel^6,7,8. Gastrointestinale effekten av OT er spesielt viktig for barnet under tidlig barseltiden. For eksempel amming er knyttet til leveringen av betydelige mengder OT til neonatal gut^9,10, og data viser at OTR er tungt overexpressed i duodenalsår villi under melk suckling perioden⁸.

In vitro eksperimenter ved hjelp av en gut cellen linje har vist på cellenivå at oksytosin modulerer viktig molekyler i stress signalering veien^11,12 og spiller en regulerende rolle i oversettelse av proteiner ¹². disse studiene tyder på at komponenter melk, inkludert eksogene oksytosin fra mor, er viktig for den oppslåtte protein responsen i nyfødte til reduserer mobilnettet stress¹³.

I vivo og ex vivo studier har vist at råmelk OT modulerer mobilnettet stress respons, betennelse og autophagy markørene i nyfødte rotte gut villi. Nyfødte enterocytes lider betydelig mobilnettet stress på sin luminal side når tarmen er samtidig eksponert for bakterieflora fra moren i colostrum^14,15 og mange proteiner, inkludert hormoner som OT^{9 , 10 , 16}.

Effekten av OT på hjernen har vært studert¹⁷. OT signalnettverk mekanismer demonstrert i tarmen under tidlig barseltiden har imidlertid ikke vært undersøkt i hjernen. I dette papiret brukes en metode for å isolere diskret hjernen kjerner i neonatal rotte hjernestammen og hypothalamus bruker geleelektroforese å profilere isolert hjernen regioner. Det overordnede målet med denne metoden er å fange tilstanden til celle signalisering i hjernen områder så nært som mulig til fødsel, før og etter den første melken suckling, i hjernevevet med lavest glial/neuronal indeksen. Begrunnelsen for utviklingen av denne teknikken er at det tillater for rask isolering av begrenset, mikroskopiske hjernen regioner i neonatal pups med en mer homogene samling av neurons for ex vivo studier med en automatisert vestlige blotting metodikk, tilbyr svært konsistente resultater på relativt liten dissekert prøver. En svakhet på tidligere arbeid inkluderer flere brutto disseksjon (hjernen skiver eller hele hjernen) og eldre dyr^18,19. Hjernen av ung pups er utrolig dynamisk, med bølger av glial differensiering etter fødselen. For å studere hjernen endringene påvirket av pups’ første mate, er studere begrenset neuronal kjerner med reproduserbar disseksjon nødvendig.

Melk feed er vanligvis analysert for dens immunologiske og ernæringsmessige innvirkning på helse eller genet uttrykk (for eksempel i enterocytes^20,21), mens dens effekt på hjernen områder under hjernens utvikling er sjelden studert. Effekten av melk transitt i tarmen på hjernefunksjon var analysert i referanse gut cholecystokinin reseptorer vagal relé hjernestammen kjerner, men ikke intracellulær signalnettverk trasé²². Det er en omfattende litteratur på sårbarheten i utvikle neonate hjernen til underernæring mødre under graviditet²³, men stress og betennelse signalene er adressert ikke. Viktigst, utnytter det aktuelle metoden et fenomen i dag null rotte nyfødte som isolerer blod-født råmelk stimuli fra vagal relé visceral stimuli. Dette er såkalte stress hypo-respons perioden preget av umodne kjernen løpet solitarius (NTS)-hypothalamus krets umiddelbart etter fødselen^24,25 som begrenser NTS, paraventricular kjernen (PVN), og supraoptic kjernen (sønn) signaler til blod-født stimuli.

Denne metoden er nyttig for analyse av flere signalveier og begrenset relativt til nevronale celler, forutsatt at hjernevev er høstet på postnatal dag-0 i rotter, i tillegg til om mødre har blitt utfordret eller ikke av noen form for behandling under graviditet. Søppel kan bli analysert for virkningene av råmelk feed i motsetning pre fôring signalering. Når du sammenligner signaler mellom hjernen områder med fattige versus rik protein avkastning, kan denne metoden i kapillær besluttsomhet totale protein polypeptid band i kapillærene går parallelt immun-kvantifisering av protein antigener. Denne metoden gjør det mulig for kvantitative sammenligningen med vilkårlig enheter, resultatene av samme antistoffer uten standard kvantitative kurver og referanse til totalt protein per kapillær. Sammenligne resultatene av ulike antistoffer er mulig bare ved hjelp av kvantitative standard kurver.

Denne metoden tillatt for vurdering av toveis signalering oppstår mellom tarmen og hjernen, og som kan påvirke funksjonen i begge organer²⁶. Tilknytningen mellom oksytosin og mat inntak, som har vært grundig studert i årene²⁷, støtter en sammenheng mellom økt oksytosin signalering og næringsstoffer tilgjengelighet. Disse studiene støtter også converse konseptet at energi underskudd er kombinert med reduksjon i hypothalamus oksytosin signalering.

Tidligere studier av effekten av OT på hjerneaktiviteten vist at indusert gut betennelse elicited cFos transkripsjon i hypothalamus PVN og amygdala piriform cortex som var ildfaste til vagotomy²⁸. Imidlertid redusert systemisk infusjon av OT med secretin hjernen cFos reaksjon på provosert inflammatorisk reaksjon i tarmen²⁸. Dette foreslo at effekten av eksogene OT ble utført av ruter enn vagal reléer, muligens via blodbårne signalnettverk molekylene båret gjennom området postrema^6,29.

I denne studien ble de cellulære stress signalveier som har tidligere observert i tarmen vurdert i hjernen. Hypotesen var at melk komponenter kan beskytte eller utsette effekten av betennelse på gut permeabilitet til mikrobiell og andre metabolitter, og i sin tur effekter på hjernefunksjonen. De klart motsetninger i IkB versus BiP signalering funnet i villi før og etter grunning av råmelk¹³, foreslo at hjernen til nyfødte, fortsatt holder på å utvikle, føler disse råmelk-indusert gut-signaler.

Signalnettverk protein markører tidligere gut-forsøk som er tilordnet endoplasmatiske retikulum stress ble målt. De inkluderer ER Anstandsdame BiP, oversettelse initiering faktor eIF2a (som fungerer som en stress reaksjon integrator³⁰), eIF2a kinase p-PKR, og to betennelse-signalisering proteiner (NF-kB og dens inhibitor, IkB).

Seks hjernen regioner basert på deres evne hos voksne skiller eller svare på OT ble valgt. NTS, i den øvre margen, er første relésending av visceral input og får direkte signalene fra vagal sensoriske neurons i tarmen³¹ og muligens blod-født cytokiner, giftstoffer og hormoner via de tilstøtende område-postrema³². PVN, supraoptic kjernen (sønn), striatum kjerner (STR), hjernebarken (CX) og mediale preoptic kjernen (MPO) motta signalene fra tarmen via NTS.

Resultatene viste at mobilnettet stressrespons i umiddelbar barseltiden før råmelk grunning og umiddelbart etter første mate er forskjellige i NTS sammenlignet med PVN og sønn. Signalering i CX, forskjellig STR, og MPO fra PVN og sønn, også. Forskjellige beskyttende funksjoner OT vist tidligere å modulere celle stress og betennelse i tarmen er sannsynligvis kjente av deler av hjernen. Samlet indikerer data at på cellenivå, under de første timene etter fødselen, hjernen reagerer på metabolske stress forbundet med næringsstoffer mangel. Dataene viser også at omfanget og retning av modulerende effektene av råmelk feed er regionen-avhengige, og at i enkelte regioner, de gjenspeiler OT effekter vises tidligere i tarmen.

Protocol

Denne studien ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer ved Columbia University og New York statens psykiatrisk Institutt. 1. vev forberedelse Bestill tidsbestemt gravid rotter fra leverandøren. Følg tidsbestemt gravid rotter ved å observere deres voksende sklerotisert i ukene etter deres ankomst og senere ute etter pups på forventet leveringsdato ved inspiserer byrået hver 2T til levering begynner. Fjern pups med en hansker hånd av halen …

Representative Results

Representant bånd immunoreactivity i forhold til totalt protein viser at det er hjernen kjerner med svært lav høstet protein. Dette krever bruk av automatiserte Western blot teknikken, som er svært sensitive forhold til kanoniske Western blot. Denne tilnærmingen kan kjøres med fortyfold mindre protein per kapillær sammenlignet per kjørefelt i vestlige blots. Differensial effekter av råmelk grunning på BiP nivåer i hjerne…

Discussion

En teknikk for microdissection av diskrete, OTR-rik hjernen kjerner i neonatal rotte hjernen presenteres i dette dokumentet. Det er også anerkjent at neurons er høyt spesialisert, selv innenfor godt karakterisert kjerner i hjernen. Dette svært reproduserbar isolere bestemte OTR-rik kjerner gir robust hypotesetesting. Bruke automatisert vestlige blotting, ble konsekvent og reproduserbarhet resultatene ytterligere forbedret. Mens en begrensning av denne teknikken er fortsatt beskjedne hjernen punch variasjon; Denne tekn…

Materials

Bradford solution	Bio Rad
Protein lysis kit	Protein simple	CBS403	Bicine/CHAPS
WES kits	Protein simple	WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate	Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a	Cell Signaling technology	SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	2103
Rabbit anti-phospho-PKR	Millipore	Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	12297
rabbit mAb anti-GAPDH	Cell Signaling technology	2118
mouse mAb anti-phospho-IKB	Cell Signaling technology	9246
mouse mAb anti-IKB	Cell Signaling technology	4814
rabbit anti-BiP	Cell Signaling technology	3183
Rabbit anti GCN2	Cell Signaling technology	3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2	BIORBYT	T899
pregnant Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories
Punch device	WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core	0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50