Evaluación de estrés celular y la inflamación en discretos núcleos de cerebro secretoras de oxitocina en la rata Neonatal antes y después de la primera alimentación de calostro

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para aislar los núcleos cerebrales en el cerebro de rata neonatal en conjunto con la primera alimentación de calostro. Esta técnica permite el estudio del estrés de la escasez de nutrientes en el cerebro como modulado por señales del enterocyte.

Abstract

El objetivo de este protocolo es aislar núcleos de ideas ricos de receptores de oxitocina en el cerebro neonatal, antes y después de la primera alimentación de calostro. La expresión de proteínas conocidas para responder al estrés metabólico se midió en aislamientos de núcleos cerebrales mediante Western blot. Esto se hizo para determinar si la insuficiencia de nutrientes inducida por el estrés metabólica en el cuerpo desencadena estrés neuronal. Previamente hemos demostrado que la insuficiencia de nutrientes en los recién nacidos provoca estrés metabólico en el intestino. Además, la oxitocina calostro modula marcadores de autofagia, la inflamación y la respuesta de estrés celular en villi de intestino de rata recién nacido antes y después de la primera alimentación. Señalización de marcadores de proteínas asociados con el estrés del retículo endoplásmico [ER acompañante inmunoglobulina proteína (BiP), traducción en eucariotes iniciación factor 2A (eIF2a) y eIF2a quinasa quinasa proteína R (p-PKR)], así como dos inflamación-señalización proteínas [factor nuclear-κB (NF-kB) y κB inhibidor (IkB)], se midieron en núcleos del cerebro del recién nacido [núcleo del tracto solitario (NTS), núcleo paraventricular (PVN), núcleo supra óptico (hijo), cortex (CX), núcleos del estriado (STR), y núcleo preóptica medial (MPO)] antes de la primera alimentación (sin imprimación por el calostro) y después del comienzo del oficio de enfermera (preparado por el calostro). Expresión de BiP/GRP78 y p-eIF2a era upregulated en unprimed y regulada en tejido preparado de NTS. NF-kB se mantuvo (alto) en el citoplasma CX, STR y MPO, mientras que NF-kB era baja y sin cambios en NTS, PVN e hijo en ambas condiciones. El colectivo BiP y p-eIF2 los resultados son consistentes con una respuesta de estrés. eIf2a se fosforila por kinasa dependiente de dsRNA (p-PKR) en el hijo, CX, STR y MPO. Sin embargo, en las noches (y en menor medida en PVN), eIf2a se fosforila por otra quinasa, control general nonderepressible-2 (GCN2). Los mecanismos de modulación de estrés observados previamente en los enterocitos del intestino del recién nacido parecen espejarse en algunas regiones del cerebro ricas en OTR. El NTS y PVN pueden utilizar un mecanismo de fosforilación diferentes (bajo deficiencia de nutrientes) de otras regiones y refractaria a los efectos de la escasez de nutrientes. Colectivamente, estos datos sugieren que las respuestas cerebrales a la tensión de la escasez de nutrientes se compensan con señalización de enterocitos calostro preparado.

Introduction

En contraste con nuestra comprensión del desarrollo temprano del cerebro que ocurre en el transcurso de días-a-semanas después del parto, relativamente poco se sabe acerca de la miríada de cambios dinámicos que ocurren en las primeras horas de vida en ratas. Un desafío clave ha sido el pequeño tamaño del cerebro de rata neonatal y un requisito para herramientas de alta tecnología aislar regiones discretas del cerebro o las células. Estudios a menudo evaluación gene transcripción y traducción no^1,2, que no da una comprensión firme de los niveles funcionales de moléculas de señalización activadas. Otros examinan la expresión usando immunohistochemistry para referencia regiones del cerebro, que no permite la cuantificación de los niveles de expresión³. Ningún estudio hasta la fecha ha estudiado la activación de la señalización de vías asociadas con calostro primera ratas de alimentación en regiones discretas del cerebro, que requiere rápido aislamiento y sacrificio y medición de la expresión de la proteína y fosforilación de la proteína mediante Western borrar. Mientras que el microdissection del cerebro se realiza en los cerebros más viejos y más grandes, no hemos identificado una referencia realizando un golpe sola célula cerebral en un cerebro de P0. Este papel presenta un protocolo para aislar regiones restringidas del cerebro neonatal utilizando una técnica de perforación relativamente baja y un procedimiento de Western blot para medir la expresión de proteínas en muestras relativamente pequeñas. Este protocolo puede ser conveniente para las preguntas de investigación que requieren la evaluación de la expresión de proteínas y modificaciones postraduccionales (por ej., fosforilación) en regiones relativamente restringidas de pequeños cerebros de cualquier especie, siempre que el usuario puede identificar visualmente la región cerebral de interés con un atlas y puntos de referencia identificables.

Esta técnica fue desarrollada para entender los cambios que ocurren en el cerebro como resultado de calostro primera las ratas neonatales de la alimentación, que es rico en oxitocina (OT). OT ha sido mucho tiempo conocido por su capacidad para estimular contracción uterina y de bajada de leche. Sin embargo, OT ahora se sabe que desempeñan una amplia gama de papeles en la regulación de muchas funciones corporales y conductas⁴. Por ejemplo, OT se opone a la tensión y la inflamación en relación con los comportamientos de adaptación afiliativo⁵, retrasa el vaciamiento gástrico y disminuye el tránsito intestinal. Se han identificado receptores de OT (OTR) en las neuronas entéricas y epitelio intestinal^6,7,8. Los efectos gastrointestinales de los OT son particularmente importantes para el niño durante el período postnatal temprano. Por ejemplo, lactancia materna se asocia con la entrega de cantidades significativas de OT para el intestino neonatal^9,10, y los datos muestran que el OTR es overexpressed fuertemente en vellosidades duodenales durante la leche lactantes período⁸.

In vitro los experimentos usando una línea celular de tripa han demostrado a nivel celular que la oxitocina modula moléculas importantes en la tensión de señalización vía^11,12 y juega un papel regulador en la traducción de proteínas ¹². estos estudios sugieren que los componentes de la leche, incluyendo oxitocina exógena de la madre, son importantes en la respuesta de la proteína desdoblada en recién nacidos para reducir el estrés celular¹³.

Estudios in vivo y ex vivo han demostrado que el calostro OT modula los marcadores de autofagia, la inflamación y la respuesta de estrés celular en villi de intestino de rata recién nacida. Enterocitos recién nacidos sufren estrés celular substancial en su lado luminal cuando el intestino está expuesto simultáneamente a microbiota de la madre en el calostro^14,15 y numerosas proteínas, incluyendo las hormonas como OT^{9 , 10 , 16}.

Los efectos de la OT en el cerebro han sido estudiados¹⁷. Sin embargo, los mecanismos de señalización de OT demostrados en el intestino durante el periodo postnatal temprano no han sido estudiados en el cerebro. En este trabajo, un método para aislar los núcleos cerebrales discretas en el tallo cerebral de rata neonatal y el hipotálamo mediante electroforesis se utiliza para las regiones del cerebro aislado de perfil. El objetivo general de este método es capturar el estado de señalización en áreas del cerebro lo más cerca posible al nacimiento, antes y después de la primera leche de cochinillo, en el tejido cerebral con el índice más bajo de glial/neuronal de la célula. El fundamento para el desarrollo de esta técnica es que permite el rápido aislamiento de las regiones del cerebro restringido, microscópico en cachorros neonatales con una colección más homogéneo de neuronas ex vivo estudios mediante un Western Blot automatizados metodología, ofreciendo resultados muy consistentes en muestras relativamente pequeñas disecadas. Un defecto de trabajo previo incluye más disección bruta (rebanadas de cerebro o todo el cerebro) y mayores de^18,de animales¹⁹. El cerebro de los cachorros jóvenes es increíblemente dinámico, con olas de diferenciación glial después del nacimiento. Para estudiar cambios en el cerebro influenciados por primera alimentación de los cachorros, es necesario estudiar restringidos núcleos neuronales con disección reproducible.

Leche alimentación generalmente se analiza para su impacto inmunológico y nutricional para la salud o gene expresión (por ejemplo, en los enterocitos^20,21), mientras que raramente se estudia su efecto en las áreas del cerebro durante el desarrollo del cerebro. Se analizó el efecto del tránsito de la leche en el intestino en función del cerebro en referencia a gut colecistoquinina receptores vagales relé núcleos del vástago de cerebro, pero no de caminos señalización intracelular²². Existe una vasta literatura sobre vulnerabilidad del cerebro en desarrollo de recién nacido a la desnutrición de las madres durante el embarazo²³, pero no se abordan las señales de estrés y la inflamación. Importante, aprovecha el método actual de un fenómeno en recién nacidos de la rata de día cero que aísla los estímulos calostro nacido sangre del relais vagal de los estímulos viscerales. Éste es el período de hypo respuesta llamado estrés caracterizado por inmaduros núcleo del tractus solitarius (NTS)-circuito hipotalámico inmediatamente después del nacimiento^24,25 que restringe el NTS, núcleo paraventricular (PVN), y núcleo supraóptico (SON) las señales a los estímulos nacidos de sangre.

Este método es útil para el análisis de múltiples vías de señalización y relativamente restringida a las células neuronales, siempre que el tejido cerebral se cosecha en el día-0 postnatal en ratas, además de si las madres han sido impugnadas o no por cualquier tipo de tratamiento durante el embarazo. Camadas pueden ser analizadas para los efectos del calostro versus la alimentación señalización de alimentación. Al comparar las señales entre las áreas del cerebro con pobres versus rendimiento proteína rica, este método permite en capilar determinación de proteína total de las bandas polipeptídicas paralelas a inmune-cuantificación de antígenos de la proteína de los capilares. Este método permite la comparación cuantitativa, utilizando unidades arbitrarias, de los resultados obtenidos por el mismo anticuerpo sin curvas cuantitativas estándar y de referencia para proteína total por tubo capilar. Comparar resultados obtenidos por los diferentes anticuerpos es posible sólo mediante curvas estándar cuantitativas.

Este método permite la evaluación de la señalización que ocurre entre el intestino y el cerebro y que puede afectar a la función en ambos órganos²⁶bidireccional. La asociación entre la oxitocina e ingesta de alimentos, que ha sido extensamente estudiada en años recientes²⁷, respalda un vínculo entre la oxitocina mayor señalización y disponibilidad de nutrientes. Estos estudios apoyan también el concepto de converse esa energía déficit está acoplado con la reducción en la señalización hipotalámica oxitocina.

Estudios anteriores del efecto de la OT en la actividad cerebral demostraron que inflamación intestinal inducida produce transcripción cFos en corteza piriforme, PVN y amígdala hipotalámica que era refractaria a la vagotomía²⁸. Sin embargo, la infusión sistémica de OT con secretina disminuyó la respuesta cerebral de cFos a la reacción inflamatoria provocada en la tripa²⁸. Esto sugiere que el efecto de la OT exógena se llevó a cabo por rutas diferentes relés vagales, posiblemente a través de moléculas de señalización transmitidos por la sangre por el área postrema^6,29.

En este estudio, se evaluaron las vías de señalización del estrés celular previamente observadas en el intestino que en el cerebro. La hipótesis fue que los componentes de la leche pueden proteger o diferir el efecto de la inflamación en la permeabilidad del intestino a metabolitos microbianos y otros, y a su vez, los efectos en el cerebro la función. Las diferencias claramente antagónicas en IkB versus BiP señalización encontrada en las vellosidades, antes y después de cebado por calostro¹³, sugieren que los cerebros de los recién nacidos, aún en el proceso de desarrollo, pueden detectar estas señales de calostro-inducida del intestino.

Se midieron marcadores de proteínas señalización utilizados en los experimentos anteriores de tripa que se asocian a estrés del retículo endoplásmico. Incluyen las chaperonas de ER BiP, traducción iniciación factor eIF2a (que sirve como una respuesta de estrés integrador³⁰), eIF2a quinasa p-PKR y dos proteínas de señalización de la inflamación (NF-kB y su inhibidor IkB).

Se eligieron seis regiones cerebrales basadas en su capacidad en adultos secretan o responder a OT. El NTS, situado en la médula superior, es el primer relais de la entrada visceral y recibe señalización directa de neuronas sensoriales vagales en el intestino³¹ citoquinas posiblemente nacido de sangre, toxinas y hormonas a través de la zona-postrema adyacente³². El PVN, núcleo supraóptico (hijo), núcleos del estriado (STR), corteza cerebral (CX) y núcleo preóptica medial (MPO) reciben señales desde el intestino a través del NTS.

Resultados mostraron que la respuesta celular al estrés durante el período postnatal inmediato antes del cebado de calostro e inmediatamente después de primera alimentación es diferente en NTS en comparación con el PVN y el hijo. Señalización en CX, STR y MPO diferenciaron de ése del PVN y del hijo, así. Las distintas funciones de OT se mostraron anteriormente para modular el estrés celular y la inflamación en el intestino se sintió probablemente por algunas áreas del cerebro. Colectivamente, los datos indican que a nivel celular, durante las primeras horas después del nacimiento, el cerebro responde al estrés metabólico asociado con la escasez de nutrientes. Los datos también muestran que la magnitud y dirección de los efectos moduladores de calostro de alimentación dependen de la región y que en algunas regiones, reflejan efectos de OT se muestra anteriormente en el intestino.

Protocol

Este estudio fue aprobado por los comités de uso en la Universidad de Columbia y el Instituto psiquiátrico del estado de Nueva York y de institucional Animal Care. 1. preparación de tejido Pedir tiempo ratas preñadas de vendedor. Siga ratas embarazadas tiempo observando sus abdómenes de cada vez mayores en las semanas después de su llegada y posteriormente buscando cachorros en la fecha prevista para el parto mediante la inspección de la jaula cada 2 h hasta que entr…

Representative Results

Las bandas representativas del immunoreactivity en relación con proteínas totales muestran núcleos cerebrales con muy baja proteína cosechado. Esto requiere el uso de la técnica de Western blot automatizados, que es muy sensible comparado con el canónico Western blot. Este enfoque puede funcionar con menos proteína fortyfold por capilar en comparación con el por carril en manchas blancas /negras occidentales. Efectos difere…

Discussion

Una técnica de microdisección de discretos, núcleos del cerebro de OTR-ricos en el cerebro de rata neonatal se presenta en este documento. Se reconoce bien que las neuronas son altamente especializadas, incluso dentro de núcleos bien caracterizados en el cerebro. Este enfoque altamente reproducible para aislar determinados núcleos ricos en OTR permite comprobación de hipótesis robusta. Mediante Western Blot automatizados, la consistencia y reproducibilidad de los resultados mejoraron aún más. Mientras que una li…

Materials

Bradford solution	Bio Rad
Protein lysis kit	Protein simple	CBS403	Bicine/CHAPS
WES kits	Protein simple	WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate	Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a	Cell Signaling technology	SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	2103
Rabbit anti-phospho-PKR	Millipore	Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	12297
rabbit mAb anti-GAPDH	Cell Signaling technology	2118
mouse mAb anti-phospho-IKB	Cell Signaling technology	9246
mouse mAb anti-IKB	Cell Signaling technology	4814
rabbit anti-BiP	Cell Signaling technology	3183
Rabbit anti GCN2	Cell Signaling technology	3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2	BIORBYT	T899
pregnant Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories
Punch device	WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core	0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50