Bedömningen av cellulär Stress och Inflammation i diskreta Oxytocin-utsöndrar hjärnan kärnor i Neonatal råtta, före och efter första råmjölk utfodring

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att isolera hjärnan kärnor i neonatal råtta hjärnan i samband med första råmjölk utfodring. Denna teknik tillåter studier av näringsämnen insufficiens stress i hjärnan som moduleras av enterocyter signalering.

Abstract

Målet med detta protokoll är att isolera oxytocin-receptor rika hjärnan kärnor i neonatal hjärnan före och efter första råmjölk utfodring. Uttrycket av proteiner känt att bemöta metabol stress mättes i hjärnan-kärnor isolat med hjälp av Western blotting. Detta gjordes för att bedöma om metabola stressinducerade näringsämnen insufficiens i kroppen utlöste neuronala stress. Vi har tidigare visat att näringsämnen insufficiens hos nyfödda framkallar metabol stress i tarmen. Dessutom modulerar råmjölk oxytocin cellulär stress svar, inflammation och autofagi markörer i nyfödda råtta gut villi före och efter första matningen. Signalering protein markörer associerade med endoplasmatiska nätverket stress [ER förkläde bindande immunglobulin protein (BiP), eukaryota översättning inledande faktor 2A (eIF2a), och eIF2a kinase proteinkinas R (p-PKR)], samt två inflammation-signalering proteiner [nuclear factor-κB (NF-kB) och hämmare κB (IkB)], mättes i nyfödda hjärnan kärnor [kärnan i den ensliga tarmkanalen (NTS), paraventricular nucleus (PVN), supra-optic nucleus (SON), cortex (CX), striatum atomkärnor (STR), och mediala preoptic kärnan (MPO)] innan de första foder (ovaccinerade av råmjölk) och efter starten av omvårdnad (Primas av råmjölk). Uttryck för BiP/GRP78 och p-eIF2a var uppreglerad i ovaccinerade och nedreglerade i primade NTS vävnad. NF-kB behölls (hög) i CX, STR och MPO cytoplasman, medan NF-kB var lägre och oförändrad i NTS, PVN och SON i båda villkoren. Den kollektiva BiP och p-eIF2 resultaten överensstämmer med en stressreaktion. eIf2a var fosforyleras av dsRNA beroende kinase (p-PKR) i SON, CX, STR och MPO. Dock var i NTS (och i mindre utsträckning i PVN), eIf2a fosforyleras av ett annat kinase, allmän kontroll nonderepressible-2 tyrosinkinashämmare (GCN2). Stress-modulerande mekanismerna tidigare observerade hos nyfödda gut enterocyter verkar speglas i vissa regioner med OTR-rika i hjärnan. De NTS och PVN kan utnyttja en annan fosforylering mekanism (under näringsbrist) från andra regioner och vara refraktära mot effekterna av näringsämnen insufficiens. Sammantaget tyder denna data på att hjärnan Svaren till näringsämnen insufficiens stress uppvägs av signalering från råmjölk-primade enterocyter.

Introduction

I motsats till vår förståelse för tidig hjärnans utveckling sker under loppet av dagar-på-veckor postpartum, är relativt lite känt om myriaden av dynamiska ändringar som inträffar under de första timmarna av liv i råttor. En viktig utmaning har varit den lilla storleken på neonatal råtta hjärnan och ett krav för högteknologiska verktyg att isolera diskret hjärnregioner eller enstaka celler. Studier bedöma ofta gen transkription och inte translation^1,2, som inte ger en fast förståelse för funktionella nivåer av aktiveras signalmolekyler. Andra undersöka uttryck med immunohistokemi till referens av hjärnan, som inte tillåter för kvantifiering av expression nivåer³. Ingen studie hittills har undersökt aktivering av signalering vägar som är associerad med råtta första råmjölk foder i diskreta hjärnregioner, som kräver snabb isolering och offer och mätning av proteiner och protein fosforylering via Western blotting. Medan hjärnan lokalt utförs på äldre och större hjärnor, har vi inte identifierat en referens som utför en icke-single-cell hjärnan punch i en P0 hjärna. Detta dokument presenterar ett protokoll för att isolera begränsade regioner i neonatal hjärnan med hjälp av en relativt lågteknologiska punch-teknik och en Western blotting förfarande för att mäta proteinuttryck i relativt små prover. Detta protokoll kan vara lämplig för forskningsfrågor som kräver bedömning av proteinuttryck och post-translationella modifieringar (t.ex., fosforylering) i relativt begränsade regioner av små hjärnor av alla arter, under förutsättning att de användaren kan visuellt identifiera hjärnregionen sevärdheter med en atlas och identifierbara landmärken.

Denna teknik utvecklades för att förstå förändringar som sker i hjärnan till följd av den neonatala råttor första råmjölk foder, som är rik på oxytocin (OT). OT har länge känt för dess förmåga att stimulera mjölk låt ned och livmoderns sammandragning. OT är dock nu känt att spela ett brett utbud av roller i regleringen av många kroppsliga funktioner och beteenden⁴. Till exempel OT motsätter sig stress och inflammation i samband med adaptiv affiliative beteenden⁵, fördröjer magtömningen och saktar intestinal transitering. OT-receptorer (OTR) har identifierats i enteriska nervceller och intestinala epitelet^6,7,8. Gastrointestinala effekter av OT är särskilt viktiga för barnet under den tidiga postnatala perioden. Exempelvis amning är kopplade till leveransen av betydande mängder OT till neonatal gut^9,10, och data visar att OTR är kraftigt ökad utsträckning hos duodenal villi under mjölken diande perioden⁸.

In vitro försök med en gut cellinje har visat på cellnivå att oxytocin modulerar viktiga molekyler i den stress som signalering utbildningsavsnitt^11,12 och en reglerande roll i översättning av proteiner ¹². dessa studier tyder på att komponenter av mjölk, inklusive exogena oxytocin från mamman, är viktiga i ovikta protein svaret hos nyfödda att minska cellulär stress¹³.

In vivo och ex vivo -studier har visat att råmjölk OT modulerar cellulär stress svar, inflammation och autofagi markörer i nyfödda råtta gut villi. Nyfödd enterocyter lida betydande cellulär stress på deras luminala sida när tarmen utsätts samtidigt för bakterieflora från mamman i råmjölk^14,15 och många proteiner, inklusive hormoner såsom OT^{9 , 10 , 16}.

Effekterna av OT på hjärnan har studerat¹⁷. OT signalering mekanismerna visat i tarmen under den tidiga postnatala perioden har dock inte studerats i hjärnan. I detta papper används en metod för att isolera diskret hjärnan kärnor i neonatal råtta hjärnstammen och hypotalamus med elektrofores att profilera isolerade hjärnregioner. Det övergripande målet med denna metod är att fånga delstaten cell signalering i hjärnområden så nära som möjligt till födelse, före och efter den första mjölk som diande, i hjärnvävnad med lägsta gliaceller/neuronala index. Grunden för utvecklingen av denna teknik är att det tillåter för snabb isolering av begränsade, mikroskopiska av hjärnan hos nyfödda ungar med en mer homogen samling av nervceller för ex vivo studier med hjälp av en automatiserad Western blotting metodik, erbjuder mycket konsekvent resultat på relativt små dissekerade prover. En brist av tidigare arbete innehåller fler brutto dissektion (hjärnan skivor eller hela hjärnan) och äldre djur^18,19. Hjärnan hos unga valpar är otroligt dynamiska, med vågor av gliaceller differentiering efter födseln. För att studera förändringar i hjärnan påverkas av pups’ första utfodring, är det nödvändigt att studera begränsade neuronala atomkärnor med reproducerbara dissektion.

Mjölk foder är vanligtvis analyseras för dess immunologiska och näringsmässiga inverkan på hälsa eller gen uttryck (till exempel i enterocyter^20,21), medan dess inverkan på hjärnområden under hjärnans utveckling studeras sällan. Effekten av mjölk transit i tarmen på hjärnans funktion analyserades med hänvisning till gut cholecystokinin receptorer vagala relä till hjärnstammen kärnor, men inte till Intracellulär signalering vägar²². Det finns en omfattande litteratur på sårbarhet för hjärnans utveckling nyfödda undernäring av mödrar under graviditeten²³, men stress och inflammation signalerna behandlas inte. Ännu viktigare, utnyttjar den nuvarande metoden ett fenomen i dag noll råtta nyfödda som isolerar de blod-född råmjölk stimuli från vagala relä av viscerala stimuli. Detta är den så kallade stress hypo-lyhördhet period kännetecknas av omogna kärnan tractus solitarius (NTS)-hypotalamus krets omedelbart efter födseln^24,25 som begränsar NTS, paraventricular nucleus (PVN), och supraoptic kärnan (SON) signaler till blod-född stimuli.

Denna metod är användbar för analys av flera signalvägar och begränsade relativt till neuronala celler, förutsatt att hjärnvävnaden skördas vid postnatal dag-0 hos råttor, förutom om mödrar har ifrågasatts eller inte genom någon form av behandling under graviditet. Kullar kan analyseras effekterna av råmjölk foder jämfört med före utfodring signalering. När man jämför signaler mellan hjärnområden med fattiga mot rika protein avkastning, kan denna metod i-kapillär bestämning av totalt protein av kapillärer som löper parallellt med immun-kvantitering av proteinantigener polypeptid band. Denna metod möjliggör kvantitativa jämförelsen, med godtyckliga enheter, av resultat som erhållits av samma antikropp utan standard kvantitativa kurvor och med hänvisning till totalt protein per kapillär. Jämför resultaten av olika antikroppar är möjligt endast med hjälp av kvantitativa standard kurvor.

Denna metod tillåtet för bedömning av dubbelriktad signalering mellan tarmen och hjärnan och som kan påverka funktionen i båda organ²⁶. Associationen mellan oxytocin och mat intag, som har studerats i senaste åren²⁷, stöder ett samband mellan ökad oxytocin signalering och näringsämnen tillgänglighet. Dessa studier stöder också begreppet converse att energi underskott kopplas ihop med minskningar i hypotalamus oxytocin signalering.

Tidigare studier av effekten av OT på hjärnans aktivitet visade att inducerade tarm inflammation framkallas cFos transkription i hypotalamus PVN, amygdala och piriform cortex som var refraktära mot vagotomy²⁸. Systemiska infusion av OT med sekretin minskade dock att hjärnan cFos bemöta den provocerade inflammatorisk reaktionen i tarmen²⁸. Detta tyder på att effekten av exogena OT genomfördes av vägar än vagala reläer, eventuellt via blodburna signalmolekyler transporteras genom området postrema^6,29.

I denna studie bedömdes de signalvägar som cellulär stress som har tidigare observerats i tarmen i hjärnan. Hypotesen var att mjölk komponenter kan skydda eller skjuta upp effekten av inflammation på gut permeabilitet mikrobiell och andra metaboliter, och i sin tur effekter på hjärnans funktion. De tydliga antagonistiska skillnaderna i IkB kontra BiP signalering Funna i villi, före och efter priming av råmjölk¹³, föreslog att hjärnan hos nyfödda, fortfarande håller på att utveckla, kan känna dessa råmjölk-inducerad gut signaler.

Signalering protein markörer som används i tidigare gut experiment som är associerade med endoplasmatiska nätverket stress mättes. De inkluderar ER förkläde BiP, översättning inledande faktor eIF2a (som fungerar som en stress reaktion integrator³⁰), eIF2a kinase p-PKR, och två inflammation-signalering proteiner (NF-kB och dess hämmare, IkB).

Sex regioner i hjärnan utifrån deras förmåga hos vuxna att utsöndra eller svara på OT valdes. NTS, ligger på övre medulla, den första relän av visceral input och tar emot direkt signalering från vagala sensoriska nervceller i tarmen³¹ och eventuellt blod-född cytokiner, gifter och hormoner via den angränsande område-postrema³². PVN, supraoptic kärnan (SON), striatum atomkärnor (STR), cerebral cortex (CX) och mediala preoptic kärnan (MPO) får signalering från tarmen via NTS.

Resultaten visade att den cellulära stressreaktionen under omedelbara postnatala perioden före råmjölk priming och omedelbart efter första utfodring är olika i NTS jämfört med PVN och SON. Signalering i CX, STR och MPO skilde sig från PVN och SON, liksom. De distinkta skyddande funktionerna av OT visat tidigare att modulera cell stress och inflammation i tarmen är sannolikt kände av vissa områden i hjärnan. Data visar sammantaget att på cellnivå, under de första timmarna efter födseln, hjärnan svarar på metabola stress i samband med näringsämnen insufficiens. Data visar också att omfattning och riktning av råmjölk foder modulerande effekter är region-beroende och att i vissa regioner, de speglar OT effekter visas tidigare i tarmen.

Protocol

Denna studie godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittéer vid Columbia University och New York State Psychiatric Institute. 1. vävnad förberedelse Beställa tidsinställda dräktiga råttor från leverantör. Följ tidsinställda dräktiga råttor genom att observera deras växande abdomens veckorna efter deras ankomst och därefter letar efter valpar på förväntat leveransdatum genom att inspektera buren varje 2 h tills leverans börjar.</li…

Representative Results

Immunoreaktivitet i förhållande till totalt protein representativa band visar att det finns hjärnan atomkärnor med mycket låg skördade protein. Detta kräver användning av automatiserade Western blot tekniken, som är mycket känsliga jämfört den kanoniska Western blot. Detta tillvägagångssätt kan köras med fortyfold mindre protein per kapillär jämfört med den per-lanen i Western blotting. Differentiella effekter av…

Discussion

En teknik för lokalt av diskreta, OTR-rika hjärnan kärnor i hjärnans neonatal råtta presenteras i denna uppsats. Det är väl känt att nervceller är högt specialiserade, även inom välkarakteriserad kärnor i hjärnan. Mycket reproducerbara sätt att isolera specifika OTR-rika atomkärnor kan robust hypotesprövning. Med hjälp av automatiserade Western blotting, förbättrades konsekvens och reproducerbarheten för resultaten ytterligare. En begränsning av denna teknik är fortfarande blygsam hjärnan punch va…

Materials

Bradford solution	Bio Rad
Protein lysis kit	Protein simple	CBS403	Bicine/CHAPS
WES kits	Protein simple	WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate	Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a	Cell Signaling technology	SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	2103
Rabbit anti-phospho-PKR	Millipore	Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	12297
rabbit mAb anti-GAPDH	Cell Signaling technology	2118
mouse mAb anti-phospho-IKB	Cell Signaling technology	9246
mouse mAb anti-IKB	Cell Signaling technology	4814
rabbit anti-BiP	Cell Signaling technology	3183
Rabbit anti GCN2	Cell Signaling technology	3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2	BIORBYT	T899
pregnant Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories
Punch device	WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core	0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50