Bestemmelse af reproduktive kompetence ved bekræfter puberteten indsættende og udføre en fertilitet Assay i mus og rotter
Summary
Mange behandlinger og genetiske mutationer påvirker timingen af seksuel modenhed og frugtbarhed. Denne protokol beskriver en non-invasiv metode til at vurdere puberteten debut i mus og rotter forud for oprettelsen af en Fertilitetsundersøgelse hos kønsmodne dyr.
Abstract
Vurdering af reproduktive kompetence er afgørende for at forstå virkningen af en behandling eller genetisk manipulation på den reproduktive akse, også kaldet hypothalamus-hypofyse-gonadale akse. Den reproduktive akse er en nøgle integrator af miljø og indre input tilpasning frugtbarhed til gunstige betingelser for reproduktion. Før indlede en Fertilitetsundersøgelse hos mus og rotter, seksuel modenhed er evalueret for at udelukke muligheden for, at den observerede reproduktive fænotyper skyldes forsinket eller fraværende puberteten debut. Denne protokol beskriver en non-invasiv metode til at vurdere puberteten debut hos mænd gennem bestemmelse af preputial adskillelse, og hos kvinder gennem vaginal åbning og første estrus. Efter bekræftelse af gennemførelsen af puberteten og opnåelsen af seksuel modenhed, kan en Fertilitetsundersøgelse indledes. Proceduren beskriver de optimale avl betingelser for mus og rotter, hvordan man opsætter en Fertilitetsundersøgelse og hvad parametre til at vurdere og afgøre, om behandling eller gen sletning har en indvirkning på fertilitet.
Introduction
Overgangen gennem puberteten er nødvendige for at nå seksuel modenhed og reproduktive kompetence. Puberteten overgangen og vedligeholdelse af frugtbarhed i voksenalderen er reguleret af den reproduktive akse, også kaldet hypothalamus-hypofyse-gonadale akse (figur 1). Timingen af puberteten indsættende og vedligeholdelse af frugtbarhed er stramt reguleret af interne såvel som miljømæssige faktorer til at øge chancerne for overlevelse af afkom og forældre1,2. Denne protokol giver en non-invasiv metode til at bestemme puberteten debut i mus og rotter at bekræfte seksuel modenhed før opsætning af en Fertilitetsundersøgelse at vurdere reproduktive kompetence.
En Fertilitetsundersøgelse udføres i kønsmodne dyr og kan iværksættes efter dyrene har gået gennem puberteten. Før puberteten debut, den reproduktive akse er inaktiv, og den vigtigste drivkraft for seksuel modning, gonadotropin – releasing hormon (GnRH), er udgivet på hypofysen i tilstrækkelige mængder til at indlede puberteten (figur 1). Puberteten debut er en kompleks proces, der resulterer i øget GnRH frigivelse ved medianen eminence. GnRH fremmer luteiniserende hormon (LH) og follikelstimulerende hormon (FSH) sekretion fra hypofysen, to hormoner afgørende for gonadale modning og reproduktive funktion (figur 1)3,4,5 .
Fornærmelser mod den reproduktive akse resultere i nedsat frugtbarhed og kan også forskud eller forsinkelse puberteten debut. Kendt for at påvirke timingen af puberteten debut og reproduktive kompetence omfatter eksponering for hormonforstyrrende kemikalier6,7, øget/nedsat organ vægt1,8, ændringer i dag længde2,9 og genetiske mutationer10,11,12,13,14,15.
Udbrud af seksuel modenhed er et afgørende skridt, der skal være afsluttet inden oprettelse af en fertilitet assay. Fordele ved bestemmelse af puberteten indsættende gennem preputial adskillelse, vaginal åbning og første estrus, er de ikke-invasiv Karakteristik af disse procedurer, som de ikke kræver blod samling eller ofringen af den animalsk16, 17.
Efter puberteten indsættende bestemmes, korrekt opsætning af en Fertilitetsundersøgelse vil give vigtige oplysninger om integriteten af den reproduktive akse, og normalt har den anden fordel at generere forsøgsdyr for yderligere undersøgelser (refinement) 18. fertilitet undersøgelse konfigurationen som beskrevet i denne protokol kan afsløre både mindre og større underskud i reproduktiv kompetence i hanner og hunner. Vigtige parametre evalueres omfatter 1) tid til den første kuld, 2) antal kuld genereret i en given tidsramme og 3) kuld størrelse. Endelig er anbefalinger for den opfølgende undersøgelser, som kan udføres til at identificere årsagen til fertilitet værdiforringelse inkluderet.
Den beskrevne protokol refererer til mus og de repræsentative data afspejler arbejdet i Transgene mus. Alle de inkluderede protokoller er dog lige så gyldige i rotter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den generelle velfærd af musene er afgørende for en vellykket frugtbarhed assay21. Når du udfører en fertilitet assay, er det vigtigt at ikke fysisk check på mus hver dag, da dette kan forårsage stress. Yderligere undgå hyppige bur ændringer, da disse er også stressende. Ideelt vil bur ændringer blive gjort mere end 1 – 2 gange om ugen. Lys eksponering i den mørke fase påvirker negativt avl i natlig gnavere. Ikke tænde lys i avl værelse i de mørke timer. Hvis der kræves adgang til …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tak til de forfattere, der bidrager til det indledende arbejde, som er grundlaget for denne offentliggørelse. Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan og Erica L. Schoeller for hjælp forberede håndskriftet. Tak til Jessica Sora Lee og Austin hage for teknisk bistand med håndskriftet. H.M.H. blev støttet af Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & menneskelig udvikling af National Institutes of Health under Award nummer R00HD084759.
Materials
| Sterile Cotton Balls | Fisher | 22456885 | |
| Surface protector | Fisher | 1420637 | |
| Light meter | VWR | 21800-014 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Microscope Slides | Genesee Scientific | 29-101 | |
| Optimouse rack with cages | AnimalCare systems | C89100 | |
| Water Bottle Basket | AnimalCare systems | C61011 | |
| Filtered Cage Tops | AnimalCare systems | C78210 | |
| Optimice Standard Feeder | AnimalCare systems | C40100SG | |
| Cage Card Holder | AnimalCare systems | C43251 | |
| Cage Cards | AnimalCare systems | M52010 | |
| Bottle Assambley | AnimalCare systems | C79122P | |
| Bed R'Nest Nesting | The Andersons | BRN4WSR | |
| 1/8" Corn Cob bedding | The Andersons | 8B | |
| Standard mouse chow | Teklad | 7904 (7004) | |
| Scale | VWR | 10205-004 | |
| Polypropylene Beaker | Fisher | 14-955-111F |
References
- Schneider, J. E. Energy balance and reproduction. Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).
- Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, (2016).
- Kauffman, A. S. Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations. Peptides. , (2009).
- Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. . Reproduction. , (1966).
- Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin. Science. , (1997).
- Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals. J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).
- Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).
- Bohlen, T. M., et al. A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system. Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
- Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).
- Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).
- Navarro, V. M., et al. Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status. Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).
- Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice. Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).
- Kauffman, A. S., et al. The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).
- Teles, M. G., et al. Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty. New England Journal of Medicine. , (2008).
- Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biology of reproduction. , (1977).
- Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score). Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).
- Caligioni, C. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).
- Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).
- Hedrich, H. . The Laboratory Mouse. , (2012).
- Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).
- Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat. PLoS ONE. , (2009).
- Manual, R. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. Management. , (2007).
- Kennedy, G. C., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. The Journal of Physiology. , (1963).
- Sisk, C. L., Foster, D. L. The neural basis of puberty and adolescence. Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).
- Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biology of reproduction. , (1990).
- Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. , (1982).
- Falconer, D. S. Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size. Genetical Research. , (1984).
- Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2. Developmental Biology. , (1997).
- Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. Epigenetic regulation of female puberty. Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).
- Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains. Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).
- Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6. Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).
- Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comparative Biochemistry and Physiology — Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).
- Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies. Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).
- Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration. Molecular Neurobiology. , (2018).
