Summary

Fastställandet av reproduktiva behörighet genom bekräftar pubertala debut och utföra en fertilitet analys av möss och råttor

Published: October 13, 2018
doi:

Summary

Många behandlingar och genetiska mutationer påverkar tidpunkten för könsmognad och fertilitet. Det här protokollet beskriver en icke-invasiv metod för att utvärdera pubertala debut på möss och råttor innan ställa in en fertilitetsstudie på könsmogna djur.

Abstract

Bedömning av reproduktiva kompetens är avgörande för att förstå effekten av en behandling eller genetisk manipulation den reproduktiva axeln, också betecknas i hypotalamus-hypofysaxeln. Den reproduktiva axeln är en nyckel integratör av miljö- och inre indata anpassning fertilitet till goda förutsättningar för reproduktion. Innan du påbörjar en fertilitetsstudie på möss och råttor, könsmognad utvärderas för att utesluta att de observerade reproduktiv fenotyperna orsakas av fördröjd eller frånvarande pubertala debut. Det här protokollet beskriver en icke-invasiv metod för att bedöma pubertala debut hos män genom bestämning av preputiala separation, och hos kvinnor genom slidöppningen och första brunst. Efter bekräftelse av slutförandet av puberteten och uppnåendet av sexuell mognad, kan en fertilitetsstudie initieras. Förfarandet beskrivs de optimala avel villkor för möss och råttor, hur du ställer in en fertilitetsstudie och vilka parametrar som ska utvärdera och avgöra om behandlingen eller gen radering har en inverkan på fertilitet.

Introduction

Att uppnå könsmognad och reproduktiv kompetens krävs övergången igenom puberteten. Pubertala övergången och upprätthållandet av fertiliteten i vuxen ålder är reglerat av den reproduktiva axeln, också betecknas i hypotalamus-hypofysaxeln (figur 1). Tidpunkten för pubertala debut och underhåll av fertilitet är hårt reglerad av inre såväl som miljömässiga faktorer för att öka chanserna för överlevnad av avkomman och föräldrar1,2. Detta protokoll ger en icke-invasiv metod för att bestämma pubertala debut hos mus och råtta bekräftar könsmognad innan ställa in en fertilitetsstudie att bedöma reproduktiv kompetens.

En fertilitetsstudie utförs i könsmogna djur och kan initieras efter djuren har gått igenom puberteten. Den reproduktiva axeln är quiescent före könsmognad debut, och nyckel föraren av sexuell mognad, gonadotropinfrisättande hormon (GnRH), släpps på hypofysen i otillräckliga mängder att initiera pubertet (figur 1). Pubertala debut är en komplicerad process som resulterar i ökad GnRH frisättning vid median överlägsenhet. GnRH främjar luteiniserande hormon (LH) och follikelstimulerande hormon (FSH) sekretion från hypofysen, två hormoner som är väsentliga för gonadala mognad och fortplantningsförmågan (figur 1)3,4,5 .

Förolämpningar reproduktiv axel resultera i minskad fertilitet och kan också förskott eller dröjsmål pubertala debut. Villkoren kända för att påverka tidpunkten för pubertala debut och reproduktiv kompetens omfattar exponering för hormonstörande kemikalier6,7, ökade/minskade kropp vikt1,8, förändringar i dag längd2,9 och genetiska mutationer10,11,12,13,14,15.

Uppkomsten av sexuell mognad är ett avgörande steg som måste slutföras innan ställa in en fertilitet assay. Fördelarna med att fastställa pubertala debut genom preputiala separation, slidöppningen och första brunst, är dessa förfaranden, icke-invasiva egenskaper som de inte kräver blodinsamling eller offer av djur16, 17.

Efter pubertala debut bestäms, korrekt ställa in en fertilitetsstudie kommer att ge viktig information om integriteten i den reproduktiva axeln och har vanligtvis den andra fördelen generera försöksdjur för fortsatta studier (förfining) 18. den fertility studie inställning som beskrivs i detta protokoll kan upptäcka både mindre och större underskott i reproduktiv kompetens hos män och kvinnor. Viktiga parametrar utvärderas inkluderar 1) tid till den första kullen, 2) antal kullar som genereras i en given tidsram och 3) kull storlek. Slutligen ingår rekommendationer för typ av uppföljning av studier som kan genomföras för att identifiera orsaken till nedsatt fertilitet.

Protokollet beskrivs refererar till möss och representativa data återspeglar arbetet i transgena möss. Alla medföljande protokoll är dock lika giltiga i råttor.

Protocol

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén av Michigan State University och utförs i enlighet med guiden för skötsel och användning av försöksdjur. 1. Bestäm pubertala debut Följ anvisningar för kläder, minst, är det nödvändigt att bära en ren labbrock och rena handskar. Hantera alltid möss med rena handskar. Förbered arbetsytan genom att placera en pad på bordet. Placera en ren mus bur to…

Representative Results

De presenterade resultaten är från två olika transgena musmodeller där de transkription faktorn ventrala främre homeobox 1 (Vax1) har tagits bort i hela kroppen på en allel, här kallade heterozygot möss (HET)13eller Vax1 har raderats villkorligt inom GnRH nervceller22, här kallas villkorad KO (cKO). Innan du konfigurerar fertilitetsstudien, är det viktigt att bekräfta pubertala debut i alla mössen. <p class=…

Discussion

Det allmänna välmåendet av mössen är avgörande för en framgångsrik fertilitet assay21. När du utför en fertilitet analys, är det viktigt att inte fysiskt kontrollera på möss varje dag eftersom detta kan orsaka stress. Ytterligare undvika frekvent buren förändringar, eftersom dessa är också stressande. Helst kommer att bur ändringar göras mer än 1 – 2 gånger per vecka. Ljusexponering under den mörka fasen inverkar negativt avel i nattaktiva gnagare. Slå inte på lampor i avel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Jag tackar författarna bidra till den inledande arbete som är grunden för denna publikation. Tack Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan och Erica L. Schoeller för hjälp förbereda manuskriptet. Tack till Jessica Sora Lee och Austin hakan för tekniskt bistånd med manuskriptet. H.M.H. stöddes av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & mänsklig utveckling av det nationella Institutes of Health under Award nummer R00HD084759.

Materials

Sterile Cotton Balls Fisher 22456885
Surface protector Fisher 1420637
Light meter VWR 21800-014
Methylene blue  Sigma-Aldrich M9140
Microscope Slides Genesee Scientific 29-101
Optimouse rack with cages AnimalCare systems C89100
Water Bottle Basket  AnimalCare systems C61011
Filtered Cage Tops AnimalCare systems C78210
Optimice Standard Feeder AnimalCare systems C40100SG
Cage Card Holder AnimalCare systems C43251
Cage Cards AnimalCare systems M52010
Bottle Assambley AnimalCare systems C79122P
Bed R'Nest Nesting The Andersons BRN4WSR
1/8" Corn Cob bedding  The Andersons 8B
Standard mouse chow Teklad 7904 (7004)
Scale VWR 10205-004
Polypropylene Beaker Fisher 14-955-111F

References

  1. Schneider, J. E. Energy balance and reproduction. Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).
  2. Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function. Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).
  3. Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, (2016).
  4. Kauffman, A. S. Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations. Peptides. , (2009).
  5. Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. . Reproduction. , (1966).
  6. Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin. Science. , (1997).
  7. Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals. J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).
  8. Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice. Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).
  9. Bohlen, T. M., et al. A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system. Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).
  10. Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).
  11. Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance. Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).
  12. Navarro, V. M., et al. Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status. Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).
  13. Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., Pérez-Millán, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice. Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).
  14. Kauffman, A. S., et al. The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior. Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).
  15. Teles, M. G., et al. Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty. New England Journal of Medicine. , (2008).
  16. Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. I. Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat. Biology of reproduction. , (1977).
  17. Gaytan, F., et al. Development and validation of a method for precise dating of female puberty in laboratory rodents: The puberty ovarian maturation score (Pub-Score). Scientific Reports. 7 (March), 1-11 (2017).
  18. Caligioni, C. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-11 (2010).
  19. Mayer, C., et al. Timing and completion of puberty in female mice depend on estrogen receptor -signaling in kisspeptin neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (52), 22693-22698 (2010).
  20. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).
  21. Hedrich, H. . The Laboratory Mouse. , (2012).
  22. Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility. Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).
  23. Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat. PLoS ONE. , (2009).
  24. Manual, R. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. Management. , (2007).
  25. Kennedy, G. C., Mitra, J. Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat. The Journal of Physiology. , (1963).
  26. Sisk, C. L., Foster, D. L. The neural basis of puberty and adolescence. Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).
  27. Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. Genetic influences on the timing of puberty in mice. Biology of reproduction. , (1990).
  28. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. , (1982).
  29. Falconer, D. S. Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size. Genetical Research. , (1984).
  30. Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2. Developmental Biology. , (1997).
  31. Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. Epigenetic regulation of female puberty. Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).
  32. Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains. Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).
  33. Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6. Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).
  34. Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number. Comparative Biochemistry and Physiology — Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).
  35. Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies. Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).
  36. Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration. Molecular Neurobiology. , (2018).

Play Video

Cite This Article
Hoffmann, H. M. Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (140), e58352, doi:10.3791/58352 (2018).

View Video